專利名稱:一種輔助鑒定南芥菜花葉病毒的試劑及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及一種輔助鑒定南芥菜花葉病毒的試劑及其應(yīng)用。
背景技術(shù):
南芥菜花葉病毒(Arabis mosaic virus, ArMV)屬于Si 花葉病毒科(Comoviridae)線蟲傳多面體病毒屬(Nepovirus)成員。其地理分布極廣,在五大洲30幾個國家有發(fā)生,屬于世界性病害。在我國未見該病毒危害的報道,是我國對外重要的檢疫性植物病毒。該病毒寄主范圍廣,可侵染植物約174屬、215種,主要危害黃瓜、萵苣、馬鈴薯、胡蘿卜、郁金香、煙草、櫻桃、葡萄、草莓、菠菜、玫瑰、大豆、菜豆等經(jīng)濟作物。ArMV可通過種子、鱗球、塊莖及苗木等無性繁殖材料進行遠距離傳播。在田間汁液、嫁接等均可傳毒。種子也可傳毒,至少有14個科20種植物通過種子傳毒,一般寄主植物種傳率可達10%以上,有的可高達100%。傳毒介體有Xiphinema diversicaudatum和Xiphinema coxi。線蟲在感染ArMV的病株上取食,它的吻針和食道攜帶類似病毒的顆粒。加洲英絲子(Cuscuta californica)和另一種英絲子(Cuscuta subinclusa)常傳病毒。目前,檢測南芥菜花葉病毒的方法主要有酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、電鏡技術(shù)和RT - PCR等技術(shù)。也有采用實時熒光PCR檢測ArMV的研究所道。如李彬等采用ELISA和RT-PCR凝膠電泳方法檢測ArMV (李彬,于翠,吳翠萍等,進境荷蘭郁金香種苗中南芥菜花葉病毒的鑒定.植物保護學報,2 010,37 (I) 19-24.);鄧叢良等采用RT-Realtime PCR檢測ArMV (鄧叢良,呂玉峰等.應(yīng)用RT-Real time PCR檢測南芥菜花病毒.植物檢疫,2008,22
(2):80-82.)。電鏡技術(shù)設(shè)備昂貴,檢測靈敏度低;ELISA技術(shù)操作步驟繁瑣、檢測周期長、靈敏度低、易出現(xiàn)假陽性。PCR凝膠電泳技術(shù)較ELISA在多個方面有所提高,但易于造成污染。未見采用半巢式RT-Realtime PCR檢測Armv的研究所道。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種輔助鑒定南芥菜花葉病毒的試劑及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的輔助鑒定南芥菜花葉病毒的試劑,包括特異引物;所述特異引物由序列表的序列I所示DNA、序列表的序列2所示DNA和序列表的序列3所示DNA組成。所述試劑可由所述特異引物和特異探針組成;所述特異探針的核苷酸序列如序列表的序列4所示。所述特異探針可為TaqMan探針。所述試劑可用于制備輔助鑒定南芥菜花葉病毒的試劑盒。本發(fā)明還保護一種輔助鑒定南芥菜花葉病毒的試劑盒,包括所述試劑。所述試劑可用于輔助鑒定南芥菜花葉病毒。本發(fā)明還保護一種輔助鑒定南芥菜花葉病毒的方法,包括如下步驟:以待測病毒的cDNA為模板,用特異引物對甲進行PCR,得到PCR產(chǎn)物甲;以待測病毒的cDNA為模板,用特異引物對乙進行PCR,得到PCR產(chǎn)物乙;如果PCR產(chǎn)物甲為103bp且PCR產(chǎn)物乙為73bp,待測病毒為候選的南芥菜花葉病毒;所述特異引物對甲為序列表的序列I所示DNA和序列表的序列3所示DNA組成的引物對;所述特異引物對乙為序列表的序列2所示DNA和序列表的序列3所示DNA組成的引物對。本發(fā)明還保護另一種輔助鑒定南芥菜花葉病毒的方法,包括如下步驟:以待測病毒的cDNA為模板,用特異引物對甲和特異探針進行實時熒光PCR,得到擴增曲線甲;以待測病毒的cDNA為模板,用特異引物對乙和所述特異探針進行實時熒光PCR,得到擴增曲線乙;根據(jù)擴增曲線甲和擴增曲線乙判斷待測病毒是否為候選的南芥菜花葉病毒;所述特異引物對甲為序列表的序列I所示DNA和序列表的序列3所示DNA組成的引物對;所述特異引物對乙為序列表的序列2所示DNA和序列表的序列3所示DNA組成的引物對;所述特異探針為TaqMan探針,核苷酸序列如序列表的序列4所示。如果所述擴增曲線甲和所述擴增曲線乙均為陽性,待測病毒為候選的南芥菜花葉病毒。所述待測病毒具體可為南芥菜花葉病毒、馬鈴薯X病毒、番茄黑環(huán)斑病毒或馬鈴薯Y病毒脈壞死株系(PVYn)毒源。本發(fā)明還保護一種檢測待測樣本中是否含有南芥菜花葉病毒的方法,包括如下步驟:(I)提取待測樣本的總RNA,反轉(zhuǎn)錄為cDNA ;(2)以所述cDNA為模板,用特異引物對甲和特異探針進行實時熒光PCR,得到擴增曲線甲;以所述cDNA為模板,用特異引物對乙和所述特異探針進行實時熒光PCR,得到擴增曲線乙;根據(jù)擴增曲線甲和擴增曲線乙判斷待測樣本中是否含有南芥菜花葉病毒;所述特異引物對甲為序列表的序列I所示DNA和序列表的序列3所示DNA組成的引物對;所述特異引物對乙為序列表的序列2所示DNA和序列表的序列3所示DNA組成的引物對;所述特異探針為TaqMan探針,核苷酸序列如序列表的序列4所示。如果所述擴增曲線甲和所述擴增曲線乙均為陽性,待測樣本含有南芥菜花葉病毒。所述TaqMan探針5’末端具體可連接有熒光報告染料FAM,3’末端具體可連接有熒光淬滅染料TAMRA。不同的方法,靈敏度和準確性差異較大,如ELISA與PCR凝膠電泳方法靈敏度相差100倍以上,PCR凝膠電泳與實時熒光PCR技術(shù)靈敏度相差也在100倍以上。即使同樣采用實時熒光PCR技術(shù),由于引物的擴增效率不一樣,靈敏度差異也可達到1000倍以上。在實際檢測鑒定工作中,為了提高結(jié)果的準確性,經(jīng)常需要對一個結(jié)果進行兩個以上的確認試驗,不同方法檢測靈敏度不一樣,很難保證兩個試驗的結(jié)果完全一樣,這就為結(jié)果的判斷增加了難度,特別是在檢測目標含量極少的情況下,這種難度就會進一步加大。若兩套方法檢測靈敏度一樣或非常接近,這個難題就迎刃而解。實時熒光PCR (Realtime-PCR)檢測技術(shù)是國際最近十余年發(fā)展起來的高新檢測技術(shù),該技術(shù)將PCR擴增與熒光檢測系統(tǒng)有機結(jié)合起來。與目前已報道的其它檢測技術(shù)相t匕,該技術(shù)具有巨大的優(yōu)越性,主要體現(xiàn)在:(a)能實時觀察PCR過程中待檢測樣品模板DNA(或cDNA)擴增情況,無需進 行電泳、染色和紫外檢測,大大簡化了操作程序并縮短檢測時間;(b)采用熒光信號放大功能,大大提高了靈敏度;(C)特異性引物與特異熒光探針雙保險結(jié)構(gòu)有效提高了檢測的準確性;(d)全封閉的操作系統(tǒng),減少了 PCR產(chǎn)物對實驗室環(huán)境的染污和樣品間的交叉染污,有效降低和避免了假陽性結(jié)果。實時熒光PCR技術(shù),是目前生物檢測中最準確、最靈敏的技術(shù),其優(yōu)越性使之在植物檢疫中具有廣闊的應(yīng)用范圍和前景。南芥菜花葉病毒(Arabis mosaic virus, ArMV)是我國重要的檢疫性有害生物。本研究根據(jù)ArMV中多聚蛋白基因(polyprotein gene)的保守序列,設(shè)計了三條巢式PCR引物和一條TaqMan探針,建立了半巢式-RT-Realtime PCR檢測ArMV的方法。與現(xiàn)有技術(shù)比較,本發(fā)明的優(yōu)點如下:⑴上述實時熒光PCR技術(shù)的優(yōu)點在本發(fā)明得以全部體現(xiàn),如準確、靈敏、簡便、快速和能有效減少污染等;(2)設(shè)計上非常巧妙地將巢式PCR的原理運用到實時熒光PCR技術(shù)中,并與實時熒光PCR技術(shù)有機結(jié)合;(3)在實時熒光PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上僅增加一條引物,就形成兩套獨立的實時熒光PCR反應(yīng)系統(tǒng);(4)兩套引物探針相互驗證,進一步有效提高了結(jié)果的準確性;(5)兩套引物探針的擴增效率一致,因此對于同一個樣品的兩次驗證實驗,結(jié)果的能保證基本一致,從而降低了結(jié)果判斷的難度,在實際檢測工作、科研和解決重大的國際貿(mào)易爭端中具有極強的可操作性;(6)兩套引物探針的擴增效率極高,檢出低限均可達0.06fg/ μ I植物總RNA。
圖1為特異性測定中試劑甲的實時熒光PCR結(jié)果;縱軸為Λ Rn,橫軸為循環(huán)數(shù);Α為 ArMV, B 為 PVX,C 為 PVYN,D 為 TBRV,E 為 CK1,F(xiàn) 為 CK2。圖2為特異性測定中試劑乙的實時熒光PCR結(jié)果;縱軸為Λ Rn,橫軸為循環(huán)數(shù);Α為 ArMV, B 為 PVX,C 為 PVYN,D 為 TBRV,E 為 CK1,F(xiàn) 為 CK2。圖3為靈敏度測定中試劑甲的實時熒光PCR結(jié)果;縱軸為Λ Rn,橫軸為循環(huán)數(shù);
A、B、C、D、E、F、G、H、1、J所對應(yīng)的 RNA 濃度依次為 600pg/μ l、60pg/μ l、6pg/μ l、600fg/μ 1、60fg/ μ 1、6fg/ μ 1、0.6fg/ μ 1、0.06fg/ μ 1、0.006fg/ μ 1、0.0006fg/ μ I, K 對應(yīng) DEPC水。圖4為靈敏度測定中試劑乙的實時熒光PCR結(jié)果縱軸為Λ Rn,橫軸為循環(huán)數(shù);Α、
B、C、D、E、F、G、H、1、J所對應(yīng)的 RNA 濃度依次為 600pg/μ l、60pg/μ l、6pg/μ l、600fg/μ 1、60fg/ μ 1、6fg/ μ 1、0.6fg/ μ 1、0.06fg/ μ 1、0.006fg/ μ 1、0.0006fg/ μ I,K 對應(yīng) DEPC 水。圖5為試劑甲和試劑乙的擴增效率對比圖;縱軸為Λ Rn,橫軸為循環(huán)數(shù);Α為試劑甲,B為試劑乙。
具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明,但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法,如無特殊說明,均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料,如無特殊說明,均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。實時熒光PCR基因擴增儀為ABI PRISM7000 (美國ABI公司);核酸蛋白分析儀為BioPhotometer (德國eppendorf公司);植物總RNA提取試劑盒(商品名E.Z.N.A ,美國Omega公司產(chǎn)品,貨號:R2867_01)購自北京雙羸生物公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自大連寶生物公司(TaKaRa)(貨號:DRR037A)、實時熒光PCR試劑盒(Platinum 定量PCR SuperMix-UDG,貨號:C1173`0-025)購自美國Invitrogen公司。以下實施例中的定量試驗,均設(shè)置三次重復(fù)實驗,結(jié)果取平均值。實時熒光PCR的結(jié)果的判定標準為:Ct值< 40,為陽性;Ct值≥40,為陰性。南芥菜花葉病毒(ArMV):ATCC編號PV-192 ;馬鈴薯X 病毒(PVX):ATCC 編號 PV-197 ;番茄黑環(huán)斑病毒(TBRV) =ATCC編號PVAS-174 ;馬鈴薯Y病毒脈壞死株系(PVYN)毒源:ATCC編號PV-50。ATCC 即美國標準菌種收藏所(American Type Culture Collection), http: //www.atcc.0rg/0實施例1、試劑的制備一、引物和探針的設(shè)計根據(jù)美國NCBI核酸數(shù)據(jù)庫中南芥菜花葉病毒基因組中多聚蛋白質(zhì)基因(polyprotein gene)序列保守區(qū),分別設(shè)計三條引物(兩條上游引物ArMVFl、ArMVF2和一條下游引物ArMVR)和一條Taqmam探針(ArMVP)。二、試劑的組成1、試劑甲的組成試劑甲由ArMVFl、ArMVR和ArMVP組成(引物和探針由上海生工合成)。ArMVFl (上游引物):5’ -TGCTGAGTTTGAGGCAGCAA-3’(序列表的序列 I);ArMVR (下游引物):5,-CAGTGGTGGGATGGTCAGAAA-3,(序列表的序列 2);ArMVP (探針):5’(FAM)-CGACTTTGCCAGCCTAGATGCAG-(TAMRA) 3’ ;(核苷酸序列為序列表的序列4,5’端標記報告熒光染料FAM,3’端標記淬滅熒光染料TAMRA)。ArMVFl和ArMVR的祀序列大小為103bp (見序列表的序列5)。2、試劑乙的組成試劑乙由ArMVF2、ArMVR和ArMVP組成(引物和探針由上海生工合成)。ArMVF2 (上游引物):5’ -TGGGAAGCCCAACTTCATTT-3’(序列表的序列 I);ArMVR (下游引物):5,-CAGTGGTGGGATGGTCAGAAA-3,(序列表的序列 3);ArMVP (探針):5’(FAM)-CGACTTTGCCAGCCTAGATGCAG-(TAMRA) 3’ ;(核苷酸序列為序列表的序列4,5’端標記報告熒光染料FAM,3’端標記淬滅熒光染料TAMRA)。ArMVF2和ArMVR的祀序列大小為73bp (見序列表的序列6)。實施例2、試劑的應(yīng)用分別取感染四種病毒(ArMV、PVX、TBRV和PVYn)的馬鈴薯葉片,取健康馬鈴薯葉片作為對照,應(yīng)用實施例1制備的試劑甲和試劑乙分別進行特異性測定、靈敏度測定,并進行試劑甲和試劑乙的擴增效率對比。一、試劑的特異性測定1、總RNA提取及質(zhì)量控制用植物總RNA提取試劑盒從感染每種病毒的葉片(4種)和健康葉片(CKl)中分別提取總RNA。用核酸蛋白分析儀BioPhotometer測定其OD值,得出其濃度與純度值,并以此控制核酸質(zhì)量。2、反轉(zhuǎn)錄合成cDNA用反轉(zhuǎn)錄試劑盒分別將步驟I從5種葉片中提取的總RNA進行反轉(zhuǎn)錄,得到cDNA ;DEPC水作為總RNA的對照(CK2)。
反應(yīng)體系(25μ L):5 μ L PrimerScript Buffer (5X), L 25 μ L PrimerScript Enzyme Mix I, 1.25 μ L Oligo dT Primer(50 μ M), 1.25 μ L Random6mers(100 μ Μ),2 μ L總RNA,加 DEPC 水至 25 μ L。反應(yīng)條件:37°C、15min,85t:、5s。3、試劑的特異性用實時熒光PCR試劑盒和實施例1制備的試劑(試劑甲或試劑乙)將步驟2中的cDNA進行實時熒光PCR。試劑甲的反應(yīng)體系(25μ L):PCR buffer (2X ) 12.5 μ 1,R0X0.5 μ 1,ArMVFl(15μΜ)1μ l,ArMVR (15μΜ)1 μ I, ArMVP (10 μ Μ) I μ l,cDNA2.0μ 1,補充 DEPC 水至 25 μ I。每個cDNA設(shè)置2個重復(fù)。試劑乙的反應(yīng)體系(25μ L):PCR buffer (2 X ) 12.5 μ I,R0X0.5 μ I,ArMVF2(15μΜ)1μ l,ArMVR (15μΜ)1μ I, ArMVP (10 μ Μ) I μ l,cDNA2.0μ 1,補充 DEPC 水至 25 μ I。每個cDNA設(shè)置2個重復(fù)。試劑甲和試劑乙的反應(yīng)體系均在ABI PRISM7000的96孔板中進行;循環(huán)條件為:5(TC、2min ;95° C>2min ;95°C> 15s,60°C>30s,45 個循環(huán)。采用試劑甲的實時熒光PCR結(jié)果見圖1。采用試劑乙的實時熒光PCR結(jié)果見圖2。應(yīng)用試劑甲只有在ArMV中出現(xiàn)擴增曲線(Ct值=14 ),判為陽性;應(yīng)用試劑乙只有在ArMV中出現(xiàn)擴增曲線(Ct值=14)。PVX、TBRV, PVY\ CKl和CK2均未出現(xiàn)擴增信號,判為陰性。結(jié)果表明,試劑甲(或試劑乙)的特異性很好,結(jié)果與預(yù)計相符。二、試劑的靈敏度測定1、總RNA提取和各個稀釋液的制備用植物總RNA提取試劑盒從感染ArMV的葉片中提取總RNA,用核酸蛋白分析儀BioPhotometer測定其OD值,得出其濃度和純度值。濃度值為6ι^/μ1,純度值為0D260/280=2.07, 0D260/230=2.19。用DEPC水將提取的總RNA進行10倍梯度稀釋,得到各個稀釋液。各個稀釋液中,RNA 濃度分別為 600pg/ μ l、60pg/ μ l、6pg/ μ l、600fg/ μ l、60fg/ μ l、6fg/ μ 1、0.6fg/μ 1,0.06fg/μ 1,0.006fg/μ 1,0.0006fg/μ I。2、反轉(zhuǎn)錄合成cDNA用反轉(zhuǎn)錄試劑盒分別將各個稀釋液進行反轉(zhuǎn)錄,得到cDNA ;DEPC水作為總RNA的對照。反應(yīng)體系(254 1^):5“1^ PrimerScript Buffer (5 X ), 1.25 μ LPrimerScript Enzyme Mix 1, 1.25 μ L Oligo dT Primer(50 μ Μ) , 1.25 μ LRandom6mers (100 μ Μ), 2 μ L 稀釋液,加 DEPC 水至 25 μ L。反應(yīng)條件:37°C、15min,85t:、5s。3、試劑的靈敏度用實時熒光PCR試劑盒和實施例1制備的試劑(試劑甲或試劑乙)將步驟2中的cDNA進行實時熒光PCR。試劑甲的反應(yīng)體系(25yL):PCR buffer (2 X ) 12.5 μ I, R0X0.5 μ I, ArMVFl(15μΜ)1μ !,ArMVR (15μΜ)1μ I, ArMVP (10 μ Μ) I μ l,cDNA2.0μ 1,補充 DEPC 水至 25 μ I。每個cDNA設(shè)置2個重復(fù)。試劑乙的反應(yīng)體系(25yL):PCR buffer (2 X ) 12.5 μ I, R0X0.5 μ I, ArMVF2(15μΜ)1μ l,ArMVR (15μΜ)1μ I, ArMVP (10 μ Μ) I μ l,cDNA2.0μ 1,補充 DEPC 水至 25 μ I。每個cDNA設(shè)置2個重復(fù)。試劑甲和試劑乙的反應(yīng)體系均在ABI PRISM7000的96孔板中進行;循環(huán)條件為:5(TC、2min ;95°C>2min ;95°C> 15s,60°C>30s,45 個循環(huán)。采用試劑甲的實時熒光PCR結(jié)果見圖3。采用試劑乙的實時熒光PCR結(jié)果見圖4。應(yīng)用試劑甲可以判為陽性的最低稀釋度為0.06fg/ μ I植物總RNA (Ct值=36);應(yīng)用試劑乙可以判為陽性的最低稀釋度為0.06fg/ μ I植物總RNA(Ct值=37)。結(jié)果表明,應(yīng)用試劑甲(或試劑乙)檢測的靈敏度可達10_8,即0.06fg/ μ I植物總RNA。三、試劑甲和試劑乙的擴增效率對比1、總 RNA 提取用植物總RNA提取試劑盒從感染ArMV的葉片中提取總RNA。用核酸蛋白分析儀BioPhotometer測定其OD值,得出其濃度和純度值。2、反轉(zhuǎn)錄合成cDNA用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA進行反轉(zhuǎn)錄,得到cDNA ;DEPC水作為總RNA的對照。反應(yīng)體系同步驟一的2。3、試劑的靈敏度 用實時熒光PCR試劑盒和實施例1制備的試劑(試劑甲或試劑乙)將步驟2中的cDNA進行實時熒光PCR。方法同步驟一的3。實時熒光PCR結(jié)果見圖5。采用試劑甲的Ct值=13 ;采用試劑乙的Ct值=13。結(jié)果表明,試劑甲和試劑乙的擴增效率幾乎完全一樣。
權(quán)利要求
1.一種輔助鑒定南芥菜花葉病毒的試劑,包括特異引物;所述特異引物由序列表的序列I所示DNA、序列表的序列2所示DNA和序列表的序列3所示DNA組成。
2.如權(quán)利要求1所述的試劑,其特征在于:所述試劑由所述特異引物和特異探針組成;所述特異探針的核苷酸序列如序列表的序列4所示。
3.如權(quán)利要求2所述的試劑,其特征在于:所述特異探針為TaqMan探針。
4.權(quán)利要求1至3中任一所述的試劑在制備輔助鑒定南芥菜花葉病毒的試劑盒中的應(yīng)用.
5.一種輔助鑒定南芥菜花葉病毒的試劑盒,包括權(quán)利要求1至3中任一所述的試劑。
6.權(quán)利要求1至3中任一所述的試劑在輔助鑒定南芥菜花葉病毒中的應(yīng)用。
7.一種輔助鑒定南芥菜花葉病毒的方法,包括如下步驟:以待測病毒的cDNA為模板,用特異引物對甲進行PCR,得到PCR產(chǎn)物甲;以待測病毒的cDNA為模板,用特異引物對乙進行PCR,得到PCR產(chǎn)物乙;如果PCR產(chǎn)物甲為103bp且PCR產(chǎn)物乙為73bp,待測病毒為候選的南芥菜花葉病毒;所述特異引物對甲為序列表的序列I所示DNA和序列表的序列3所示DNA組成的引物對;所述特異引物對乙為序列表的序列2所示DNA和序列表的序列3所示DNA組成的引物對。
8.一種輔助鑒定南芥菜花葉病毒的方法,包括如下步驟:以待測病毒的cDNA為模板,用特異引物對甲和特異探針進行實時熒光PCR,得到擴增曲線甲;以待測病毒的cDNA為模板,用特異引物對乙和所述特異探針進行實時熒光PCR,得到擴增曲線乙;根據(jù)擴增曲線甲和擴增曲線乙判斷待測病毒是否為候選的南芥菜花葉病毒;所述特異引物對甲為序列表的序列I所示DNA和序列表的序列3所示DNA組成的引物對;所述特異引物對乙為序列表的序列2所示DNA和序列表的序列3所示DNA組成的引物對;所述特異探針為TaqMan探針,核苷酸序列如序列表的序列4所示。
9.如權(quán)利要求7或8所述的方法,其特征在于:所述待測病毒為南芥菜花葉病毒、馬鈴薯X病毒、番茄黑環(huán)斑病毒或馬鈴薯Y病毒脈壞死株系(PVYn)毒源。
10.一種檢測待測樣本中是否含有南芥菜花葉病毒的方法,包括如下步驟: (1)提取待測樣本的總RNA,反轉(zhuǎn)錄為cDNA; (2)以所述cDNA為模板,用特異引物對甲和特異探針進行實時熒光PCR,得到擴增曲線甲;以所述cDNA為模板,用特異引物對乙和所述特異探針進行實時熒光PCR,得到擴增曲線乙;根據(jù)擴增曲線甲和擴增曲線乙判斷待測樣本中是否含有南芥菜花葉病毒;所述特異引物對甲為序列表的序列I所示DNA和序列表的序列3所示DNA組成的引物對;所述特異引物對乙為序列表的序列2所示DNA和序列表的序列3所示DNA組成的引物對;所述特異探針為TaqMan探針,核苷酸序列如序列表的序列4所示。
全文摘要
本發(fā)明的目的是提供一種輔助鑒定南芥菜花葉病毒的試劑及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的試劑包括由序列表的序列1所示DNA、序列表的序列2所示DNA和序列表的序列3所示DNA組成的特異引物。所述試劑還可包括核苷酸序列如序列表的序列4所示的特異探針。南芥菜花葉病毒是我國重要的檢疫性有害生物,本發(fā)明中利用三條巢式PCR引物和一條TaqMan探針,建立了半巢式-RT-Realtime PCR檢測ArMV的方法。該方法有機地結(jié)合了巢式PCR和實時熒光PCR技術(shù);三條引物和一條探針形成的兩套PCR體系相互驗證,有效提高了結(jié)果的準確性;實時熒光PCR技術(shù)有效提高了檢測的靈敏度。本方法準確、靈敏、簡便、快速,檢出低限均可達0.06fg/μl植物總RNA。
文檔編號G01N21/64GK103173576SQ20131012396
公開日2013年6月26日 申請日期2013年4月10日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月10日
發(fā)明者粟智平, 耿金培, 劉愛華, 張苗, 王建力, 楊益娥, 李金慶 申請人:粟智平