一種快速檢測食品中花生致敏蛋白的裝置及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種快速、方便、高效、定量檢測食品中花生致敏蛋白的檢測裝置及其制備方法，屬于熒光微球標(biāo)記的檢測技術(shù)。本發(fā)明包括標(biāo)記了特殊性質(zhì)的具有生物特異性的生物大分子，以具有吸附移動性的聚合材料薄膜作載體，在便攜輕巧的方形設(shè)備內(nèi)進(jìn)行的檢測。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是利用標(biāo)記物的特殊性質(zhì)對食品基質(zhì)中的含有的微量花生致敏蛋白成分進(jìn)行定量檢測，檢測限可達(dá)到0.1ng/mL。這種特殊的標(biāo)記物克服了常見標(biāo)記物的不穩(wěn)定性，檢測值低的問題。本發(fā)明主要應(yīng)用于食品安全中殘余花生致敏物的定量檢測方面。
【專利說明】
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于食品安全中食品中花生致敏蛋白的檢測領(lǐng)域，具體涉及一種定性和定 量快速地檢測食品中花生致敏蛋白的熒光微球標(biāo)記的裝置及其制備方法。 一種快速檢測食品中花生致敏蛋白的裝置及其制備方法

【背景技術(shù)】
[0002] 近年來，隨著人們的生活水平日漸提高，食品的安全問題越來越突出，包括食物過 敏等。食物過敏是指機(jī)體對食品中的某種物質(zhì)或成分產(chǎn)生的一種變態(tài)反應(yīng)，是一種由IgE 介導(dǎo)和非IgE介導(dǎo)的超敏反應(yīng)，可引起皮膚、腸胃道、呼吸系統(tǒng)的反應(yīng)，嚴(yán)重時(shí)甚至?xí)?dǎo)致 系統(tǒng)過敏反應(yīng)或休克。
[0003] 花生過敏屬于IgE介導(dǎo)的超敏反應(yīng)，其機(jī)制主要為I型超敏反應(yīng)機(jī)理，一定量的 過敏原可誘導(dǎo)易感個(gè)體產(chǎn)生足夠量的IgE，IgE與膜表面特定的受體結(jié)合，從而使機(jī)體處 于致敏狀態(tài)。當(dāng)再次接觸含相同或相似過敏原成分時(shí)，過敏原分子特異性識別致敏細(xì)胞膜 表面的IgE ,誘導(dǎo)細(xì)胞脫顆粒釋放炎癥介質(zhì)而觸發(fā)花生過敏癥。與牛奶、雞蛋過敏相比，花 生過敏一般不隨年齡增長而消失，是終身致敏的。而目前，對于食物過敏的最好最直接的辦 法是嚴(yán)格避免食用含致敏蛋白的食物，但在食品的加工生產(chǎn)過程中，會摻雜著少量潛在的 致敏物質(zhì)，所以，人們亟需研究出能夠快速檢測食物中致敏物質(zhì)的方法，達(dá)到預(yù)防的目的。 食入含量甚微的花生過敏原食物就可能對高度敏感的患者引發(fā)過敏反應(yīng)，如腸胃不適、過 敏性皮炎等疾病，嚴(yán)重的甚至?xí)l(fā)生過敏休克和過敏性死亡。如今，花生過敏作為世界各地 普遍存在的一個(gè)公眾性健康問題，得到了廣泛的關(guān)注。
[0004] 目前，有關(guān)花生致敏蛋白的檢測手段包括主要包括基于免疫學(xué)的方法、聚合酶鏈 式反應(yīng)技術(shù)、毛細(xì)管電泳分析、色譜法、質(zhì)譜法等，這些檢測手法都比較繁瑣，且需要一定的 設(shè)備儀器和專業(yè)人才，不適用于食品的快速檢測判斷。隨著新技術(shù)的開發(fā)應(yīng)用，致敏蛋白的 檢測逐漸向高靈敏度、簡便快速、準(zhǔn)確性高方向發(fā)展。
[0005] 這種裝置是建立在免疫層析技術(shù)的基礎(chǔ)上的一種獨(dú)特的免疫分析方式，它通常以 條狀纖維層析材料為固相，通過虹吸作用原理使樣品溶液在層析條上擴(kuò)撒，并同時(shí)使樣品 中的待測物與層析材料上針對待測物的受體發(fā)生高特異高親和性的免疫反應(yīng)，層析過程中 免疫復(fù)合物被富集或截留在層析材料的一定區(qū)域，通過酶反應(yīng)或直接運(yùn)用可目測的標(biāo)記物 而得到直觀的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。而游離標(biāo)記物則越過檢測帶，達(dá)到與結(jié)合標(biāo)記物自動分離之目的。 這種技術(shù)目前常見的標(biāo)記粒子包括膠體金，乳膠，膠體硒、明膠等，其中運(yùn)用最多和成熟的 是月父體金。
[0006] 但是，膠體金標(biāo)記的裝置存在以下缺陷： (1)膠體金標(biāo)記過程是靜電吸附過程，是一種物理吸附，故在液相中穩(wěn)定性較差， 往往造成已標(biāo)記上的蛋白分子又再次脫落。
[0007] (2)結(jié)果通過顯示單一的紫紅色條帶來判斷，顏色單一，難以實(shí)現(xiàn)多檢和聯(lián) 檢。
[0008] (3)只有當(dāng)金顆粒集聚到一定量時(shí)，人肉眼才能觀察到紫紅的條帶，且該顏色條 帶與背景對比度不大，從而限制了檢測靈敏度。
[0009] (4)不同的材料基質(zhì)效應(yīng)明顯，背景干擾非常大。
[0010] (5)檢測靈敏度較低。
[0011] (6)無法實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確定量檢測。
[0012] 目前也出現(xiàn)了利用彩色乳膠等標(biāo)記的檢測方法，但是這些方法并不能完全實(shí)現(xiàn)對 檢測物的定量檢測。
[0013] 專利200910085054. 1公開了一種采用熒光微球免疫層析檢測卡來同時(shí)檢測氯胺 酮與甲基苯丙胺，反應(yīng)靈敏度較膠體金法有很大提高，快速方便。
[0014] 專利200910117820. 8公開了一種熒光微球免疫層析試紙條，改進(jìn)熒光微球的制 備方法來實(shí)現(xiàn)對樣品進(jìn)行定性和定量檢測。
[0015] 但是花生致敏蛋白用常規(guī)的熒光微球免疫層析方法來定量檢測仍然難以達(dá)到靈 敏度、檢測穩(wěn)定性方面的要求。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0016] 本發(fā)明目的是針對上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種簡便快速、靈敏度高且可進(jìn)行 定量檢測的熒光微球標(biāo)記裝置。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述裝置的制備方法。
[0017] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的本發(fā)明采取的一個(gè)技術(shù)方案是： 一種快速檢測食品中花生致敏蛋白的裝置，包括用于檢測花生致敏蛋白的免疫層析 試紙條；所述免疫層析試紙條為粘性底板上依次搭接濾紙、樣本墊、玻璃纖維膜、NC膜和 吸水紙；所述玻璃纖維膜上噴涂的熒光微球墊為熒光微球標(biāo)記的花生致敏蛋白多克隆抗 體；所述NC膜的檢測區(qū)噴涂花生致敏蛋白；所述NC膜的質(zhì)控區(qū)上噴涂羊抗兔IgG ;所 述所述熒光微球是直徑為〇. 01?10 μ m的用聚合材料或二氧化硅包裹熒光物質(zhì)的微球， 其表面連接有活性基團(tuán)。
[0018] 所述的裝置，還包括底卡和面卡，免疫層析試紙條固定在底卡上，試紙條表面用面 卡壓緊；所述面卡上預(yù)留有加樣孔和觀察窗，加樣孔的位置與試紙條的樣本墊對應(yīng)，觀察窗 的位置與試紙條的NC膜對應(yīng)，所述底卡和面卡為塑料卡。
[0019] 所述聚合材料為聚苯乙烯、聚乙烯和聚氯乙烯，所述的活性基團(tuán)為一 CHO、-C00H、-OH、-NH2或-SH，所述熒光物質(zhì)為菲咯啉聯(lián)釕有機(jī)染料、異硫氰根熒光素、異硫 氰根羅丹明、6-羧基熒光素酰胺酯、熒光烷衍生物類、1，8-萘二酰亞胺類、香豆素類有機(jī)熒 光染料或其摻雜物或量子點(diǎn)。
[0020] 所述花生致敏蛋白用0. 01?0. 1 M pH 7. 2的磷酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)至包被物濃度為 1. 0 mg/mL，噴膜量為0· 80 μ L/cm ;所述羊抗兔IgG用0· 01?0· 1 M pH 7. 2的磷酸鹽緩 沖液調(diào)節(jié)至包被物濃度為1. 〇 mg/mL，噴膜量為0. 80 μ L/cm。
[0021] 前述述的裝置的制備方法，包括如下步驟：（1) NC膜上檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)的制備； (2)熒光微球墊的制備；（3)裝置組裝；所述的NC膜上檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)的制備，包括所述 NC膜的檢測區(qū)噴涂花生致敏蛋白，花生致敏蛋白用0. 01?0. 1 M pH 7. 2的磷酸鹽緩沖液 調(diào)節(jié)至包被物濃度為1. 0mg/mL，噴膜量為0. 8 μ L/cm ;所述NC膜的質(zhì)控區(qū)上噴涂羊抗兔 IgG，羊抗兔IgG用0· 01?0· 1 M pH 7. 2的磷酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)至包被物濃度為1. Omg/mL， 噴膜量為〇. 8 μ L/cm ;所述的熒光微球墊的制備，包括如下的步驟：（1)熒光微球標(biāo)記的花 生致敏蛋白多克隆抗體的制備（2)將熒光微球標(biāo)記的花生致敏蛋白多克隆抗體噴涂在玻璃 纖維膜上制備熒光微球墊。所述的裝置組裝為在粘性底板上依次搭接濾紙、樣本墊、有熒 光微球墊的玻璃纖維膜、固定有檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)的NC膜、吸水紙制成免疫層析試紙條，并 剪成合適大小； 所述檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)的制備方法如下：用BIODOT Dispensing System將花生致敏蛋白 和羊抗兔IgG包被到NC膜上：分別用0. 01?0. 1 M pH 7. 2的磷酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)包被物濃 度為1. 0 mg/mL，噴膜量為0. 8 μ L/cm，檢測區(qū)上噴涂花生致敏蛋白，質(zhì)控區(qū)上噴涂羊抗兔 IgG，兩區(qū)相隔5 mm ;37°C烘干處理過夜后，室溫干燥的環(huán)境下保存?zhèn)溆谩?br> [0022] 如權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于熒光微球標(biāo)記的花生致敏蛋白多克隆 抗體制備方法如下：取微球在l〇〇〇Xg離心10?15 min，離心后收集沉淀，用0.01 M pH 4. 8的硼酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)微球濃度為0D45(I=0. 2,然后分別加入20?100 mg/mL對乙基-N， N-二甲基丙基碳二亞胺EDC，和2?20 mg/mL N-羥基丁二酰亞胺NHS，振蕩混勻，室溫孵育 10?30 min后，1000Xg離心5?15 min，沉淀用0. 01 M pH 4. 8的硼酸鹽緩沖液溶解， 并調(diào)節(jié)微球濃度為〇D45(l為0. 2-1. 0,1 mL該熒光微球中加入100 μ g的花生致敏蛋白多克 隆抗體，充分混合后，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)3 h ;超純水離心洗滌2?5次，沉淀用0. 01 M pH 7. 2 的磷酸鹽緩沖液復(fù)溶沉淀至起始體積；用BI0D0T Dispensing System將標(biāo)記好的突光微球 噴涂至玻璃纖維膜上，25°C真空干燥1?2 h，置于室溫干燥的環(huán)境下備用。
[0023] 前述裝置定性檢測花生致敏蛋白的方法，包括如下步驟：a.在裝置的加樣孔上滴 加待測樣本，反應(yīng)10 min后，將檢測裝置放入熒光分析儀檢測窗口；b.熒光微球在燈源激 發(fā)下，發(fā)出強(qiáng)烈的熒光；c.當(dāng)樣本中不含有被檢測花生致敏蛋白時(shí)，觀察窗內(nèi)只出現(xiàn)兩條 熒光條帶，即檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)分別有一條熒光帶，則檢測樣本為陰性；當(dāng)待測樣本中含有過 量的被檢測花生致敏蛋白時(shí)，觀察窗內(nèi)只出現(xiàn)一條熒光條帶，即檢測區(qū)無熒光條帶，質(zhì)控區(qū) 有一條熒光帶，則檢測樣本即為陽性。
[0024] 前述裝置定量檢測花生致敏蛋白的方法，其特征在于包括如下步驟：在裝置加 樣孔上加入待測樣本，反應(yīng)10 min后，將檢測裝置放入熒光分析儀檢測窗口；截留在檢測 區(qū)和質(zhì)控區(qū)的熒光微球在燈源激發(fā)下，發(fā)出強(qiáng)烈的熒光條帶；發(fā)射的熒光經(jīng)CCD掃描系統(tǒng) 匯聚后，經(jīng)過光電聚集管，送入光電倍增管，光信號得到增強(qiáng)，再經(jīng)過信號轉(zhuǎn)換元件，軟件處 理后，熒光的強(qiáng)弱以數(shù)值的高低在顯示器上顯示；以不同已知濃度的待測花生致敏蛋白 作檢測，獲得一系列數(shù)值后，繪制待檢測花生致敏蛋白濃度與熒光強(qiáng)弱數(shù)值關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲 線；根據(jù)檢測樣本的顯示數(shù)值，以及上述標(biāo)準(zhǔn)曲線得出檢測樣本中花生致敏蛋白的濃度。
[0025] 圖2是定性和定量檢測花生致敏蛋白的熒光微球標(biāo)記的裝置的檢測原理圖； 圖3是一種簡易熒光檢測儀的檢測原理及其結(jié)構(gòu)示意圖。
[0026] 本發(fā)明的有益效果是： 1)本發(fā)明制備的熒光微球使用壽命長，易于制造，制備穩(wěn)定且具有良好的單分散性，與 花生致敏蛋白多克隆抗體穩(wěn)固結(jié)合，制備的熒光微球抗體熒光量等非常適宜于花生致敏蛋 白的檢測。
[0027] 2)本發(fā)明技術(shù)方案針對花生致敏蛋白本身的特性，經(jīng)過大量的試驗(yàn)得出熒光標(biāo)記 抗體噴涂量、質(zhì)控線上羊抗兔IgG、檢測線花生致敏蛋白噴涂量，能靈敏地定量檢測花生致 敏蛋白。
[0028] 3)本發(fā)明能夠快速準(zhǔn)確地對食品中的花生致敏蛋白實(shí)現(xiàn)定性和定量檢測。
[0029] 4)通過C⑶掃描技術(shù)把過濾后的發(fā)射光譜收集后，再發(fā)送到熒光分析檢測儀以及 經(jīng)過軟件處理，把熒光信號數(shù)值化，從而實(shí)現(xiàn)定量檢測。
[0030] 5)不同粒徑和種類的量子點(diǎn)在相同的激發(fā)光譜下，能夠發(fā)出多種顏色的條帶；不 同無機(jī)或者有機(jī)熒光染料按照不同比例摻混時(shí)能夠發(fā)射不同的顏色，從而實(shí)現(xiàn)多檢和聯(lián) 檢。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0031] 圖1是檢測花生致敏蛋白的熒光微球標(biāo)記的裝置的結(jié)構(gòu)圖； 圖2是定性和定量檢測花生致敏蛋白的熒光微球標(biāo)記的裝置的檢測原理圖； 圖3是一種簡易熒光檢測儀的檢測原理及其結(jié)構(gòu)示意圖。
[0032] 如圖1所示，該熒光微球免疫層析試紙條的構(gòu)成為：在粘性底板18上，依次搭接地 粘貼濾紙11、樣本墊12、噴涂有熒光微球標(biāo)記的抗花生致敏蛋白單克隆抗體(或多克隆抗 體)的玻璃纖維膜13、包被有抗花生致敏蛋白多克隆抗體(或單克隆抗體)的檢測區(qū)15和包 被有抗兔抗體的質(zhì)控區(qū)16的硝酸纖維素膜14和吸水紙17。質(zhì)控區(qū)距吸水紙2 _，質(zhì)控區(qū) 和檢測區(qū)間隔5 mm。
[0033] 如圖1和2所示，檢測原理如下：在樣本墊12上滴加樣品，檢測試紙條放入檢測窗 口 41 ;當(dāng)檢測樣本中不包含待檢測花生致敏蛋白時(shí)，熒光微球標(biāo)記的抗花生致敏蛋白單克 隆抗體(或多克隆抗體)不會直接與檢測區(qū)15上包被的抗花生致敏蛋白多克隆抗體(或單克 隆抗體）結(jié)合，而只與質(zhì)控區(qū)16上的抗兔抗體特異性結(jié)合，待檢樣本43在光源42激發(fā)下， 發(fā)射的熒光44通過單色光濾光片35過濾后，通過觀察窗口 36在質(zhì)控區(qū)16能夠觀察到一 條清晰的熒光條帶檢測區(qū)15無熒光條帶。當(dāng)待檢樣本43中含待檢測花生致敏蛋白且含量 超過檢測限時(shí)，樣本中的花生致敏蛋白會特異性地與熒光微球標(biāo)記的花生致敏蛋白單克隆 抗體(或多克隆抗體)結(jié)合，然后被檢測區(qū)15的花生致敏蛋白多克隆抗體(或單克隆抗體)捕 獲，多余的熒光標(biāo)記花生致敏蛋白單克隆抗體(或多克隆抗體）與質(zhì)控區(qū)的抗兔抗體結(jié)合， 所以在簡易熒光檢測儀上觀察到，檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)都能看到一條清晰的熒光條帶。
[0034] 如圖3所示，用熒光微球標(biāo)記的裝置定性檢測花生致敏蛋白的檢測步驟如下：
[1] 在裝置上加入樣本，反應(yīng)10 min后，將檢測裝置放入檢測窗口 41 ;
[2] 熒光微球43在燈源42激發(fā)下，發(fā)出強(qiáng)烈的熒光；
[3] _當(dāng)樣本中不含有被檢測花生致敏蛋白時(shí)，檢測區(qū)不出現(xiàn)熒光條帶，而質(zhì)控區(qū)出現(xiàn) 一條熒光條帶，即檢測樣本為陰性；當(dāng)樣本中含有過量的被檢測花生致敏蛋白時(shí)，檢測區(qū)和 質(zhì)控區(qū)均有熒光條帶，檢測樣本即為陽性。
[0035] 如圖3所示，用熒光微球標(biāo)記的裝置定量檢測花生致敏蛋白的檢測步驟如下：
[1] 在樣本墊上滴加樣品，反應(yīng)10 min后，檢測裝置放入檢測窗口 41 ;
[2] 檢測區(qū)或質(zhì)控區(qū)被截留的熒光微球43在光源42激發(fā)下，發(fā)出強(qiáng)烈的熒光條帶；
[3] 發(fā)射的熒光44經(jīng)(XD掃描系統(tǒng)45匯聚后，經(jīng)過光電聚集管46,送入光電倍增管 47,光信號得到增強(qiáng)，再經(jīng)過信號轉(zhuǎn)換元件48,經(jīng)過軟件處理49后，熒光的強(qiáng)弱以數(shù)值的高 低在數(shù)據(jù)輸出410的顯示器上顯示出來；
[4] 檢測過程中，以不同已知濃度的被檢測花生致敏蛋白作檢測，獲得一系列數(shù)值后， 繪制被檢測花生致敏蛋白濃度與熒光強(qiáng)弱數(shù)值關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線。最后根據(jù)檢測樣本的數(shù)據(jù) 輸出410的數(shù)值，查標(biāo)準(zhǔn)曲線圖得出檢測樣本中花生致敏蛋白的濃度。

【具體實(shí)施方式】
[0036] 實(shí)施例一 一、熒光標(biāo)記裝置的組裝； 1.NC膜的制備： 檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)的制備：花生致敏蛋白多克隆抗體和抗兔抗體包被到硝酸纖維素 膜上：用0.1 M pH 7.2的PBS (磷酸鹽緩沖液，其中包含5 %蔗糖和0.05 %吐溫-20 (Tween-20))調(diào)節(jié)花生致敏蛋白多克隆抗體的濃度為0. 5 mg/mL，所得的溶液在膜上噴涂作 為檢測區(qū)，用0. 01 M pH 7. 2的PBS (其中包含5 %蔗糖和0. 05 %吐溫-20 (Tween-20)) 調(diào)節(jié)抗兔抗體的濃度為〇. 5 mg/mL，所得的溶液在膜上噴涂作為質(zhì)控區(qū)，兩區(qū)的噴膜量均為 0.74 yL/cm，兩區(qū)相隔5 mm，質(zhì)控區(qū)距硝酸纖維素膜一端2 mm，37°C烘干處理過夜后，于室 溫干燥的環(huán)境下保存?zhèn)溆谩?br> [0037] 2.熒光微球墊的制備： 熒光微球標(biāo)記花生致敏蛋白單克隆抗體的制備：取1 mg包裹有香豆素的熒光微球 (0.01?10 μ--)(購自默克公司）1000Xg離心10 min，離心后收集沉淀用0.01M pH 4.8 的硼酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)微球濃度為0D45(I=0. 2,然后分別加入80 μ L的20 mg/mL對乙基-N， N-二甲基丙基碳二亞胺EDC，和130 yL的20 mg/mL N-羥基丁二酰亞胺NHS，振蕩混勻后， 室溫孵育20 min后，1000Xg離心5 min，沉淀用0.01M pH 4. 8的硼酸鹽緩沖液溶解，調(diào)節(jié) 微球濃度〇D45(l為1. 0,1 mL熒光微球中加入1 μ g的花生致敏蛋白單克隆抗體，充分混合 后，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)3 h，超純水離心洗滌3次，沉淀用0. 01 M pH 7. 2的PBS (其中包含5 % 鹿糖和0.05 % Tween-20)復(fù)溶沉淀至起始體積后，用BI0D0T操作平臺（BI0D0T Dispensing System),按照8 μ L/cm的量噴涂至30X0. 8 cm的玻璃纖維膜上，25?真空干燥1.5 h，放 于干燥環(huán)境備用。
[0038] 3.組裝裝置： 在PVC塑料底板上依次搭接地粘貼：（1)濾紙和樣本墊，樣本墊為一種經(jīng)過5 % Tween-20處理的玻璃纖維膜；（2)分散有熒光微球標(biāo)記花生致敏蛋白單克隆抗體的 0. 8X30 cm的熒光微球墊；（3)有花生致敏蛋白多克隆抗體作為檢測區(qū)和有羊抗兔IgG作 為質(zhì)控區(qū)的NC膜；（4)吸水紙。切割組裝好后，放到準(zhǔn)備好的裝置盒中，裝入鋁箔袋，加入 干燥劑后，封口保存，于室溫干燥的環(huán)境下至少可保存一年。
[0039] _、定性和定量檢測食品中花生致敏蛋白； 1.定性檢測：秤取lg粉狀樣品（若不是，需要先液氮研磨），加入20 mL提取液（8 mmol/L Tris-HCl, 25 mmol/LTricine, pH 8· 6) 45°C 1 h，11 000 r/min30 min 離心收集 上清，提取其中的花生蛋白成分，吸取50 μ L上清液加入樣本墊上進(jìn)行檢測，十分鐘后，將 檢測裝置放入簡易熒光檢測儀中檢測窗口內(nèi)，熒光微球在LED燈源激發(fā)下，發(fā)射特定顏色 的熒光，經(jīng)過單色濾光片過濾后，選擇只能透過紅色光的濾光片，從觀察窗口觀察，在簡易 熒光檢測儀上觀察到只有質(zhì)控區(qū)有一條清晰的紅色熒光條帶。說明檢測樣本中含有花生致 敏蛋白。
[0040] 2.定量檢測： (1) 在裝置的樣本墊上加入樣本，反應(yīng)10 min后，檢測裝置放入檢測窗口； (2) 熒光微球在LED燈源激發(fā)下，發(fā)出強(qiáng)烈的熒光； (3) 發(fā)射的熒光經(jīng)CCD掃描系統(tǒng)匯聚后，經(jīng)過光電聚集管，送入光電倍增管，光信號 得到增強(qiáng)，在經(jīng)過信號轉(zhuǎn)換元件，經(jīng)過軟件處理后，熒光的強(qiáng)弱以數(shù)值的高低在數(shù)據(jù)輸 出410的顯示器上顯示出來。
[0041] (4)實(shí)驗(yàn)過程中，將含花生致敏蛋白的標(biāo)準(zhǔn)樣品配制成不同濃度，測出其對應(yīng)的熒 光強(qiáng)度的數(shù)值，從而根據(jù)這一系列數(shù)值與對應(yīng)濃度建立一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣本經(jīng)過前處理后， 吸取50 μ L懸液，進(jìn)行檢測，檢測限可以達(dá)到0. Ing/mL。
[0042] (4)實(shí)驗(yàn)過程中，將含花生致敏蛋白的標(biāo)準(zhǔn)樣品配制成不同濃度，測出其對應(yīng)的熒 光強(qiáng)度的數(shù)值，從而根據(jù)這一系列數(shù)值與對應(yīng)濃度建立一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣本經(jīng)過前處理后， 吸取50μ L懸液，進(jìn)行檢測。根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線可知，在0. 5~200ng/ml的范圍 內(nèi)具有很好的線性關(guān)系，檢測限值可達(dá)到〇. lng/ml，經(jīng)過多次實(shí)驗(yàn)，變異系數(shù)CV〈5%，穩(wěn)定 性好。
【權(quán)利要求】
1. 一種快速檢測食品中花生致敏蛋白的裝置，其特征在于包括用于檢測花生致敏蛋白 的免疫層析試紙條；所述免疫層析試紙條為粘性底板上依次搭接濾紙、樣本墊、玻璃纖維 膜、NC膜和吸水紙；所述玻璃纖維膜上噴涂的熒光微球墊為熒光微球標(biāo)記的花生致敏蛋 白多克隆抗體；所述NC膜的檢測區(qū)噴涂花生致敏蛋白；所述NC膜的質(zhì)控區(qū)上噴涂羊抗 兔IgG;所述所述熒光微球是直徑為0.01?10 μ m的用聚合材料或二氧化硅包裹熒光物 質(zhì)的微球，其表面連接有活性基團(tuán)。
2. 如權(quán)利要求1所述的裝置，其特征在于還包括底卡和面卡，免疫層析試紙條固定在 底卡上，試紙條表面用面卡壓緊；所述面卡上預(yù)留有加樣孔和觀察窗，加樣孔的位置與試紙 條的樣本墊對應(yīng)，觀察窗的位置與試紙條的NC膜對應(yīng)，所述底卡和面卡為塑料卡。
3. 如權(quán)利要求1所述的裝置，其特征在于所述聚合材料為聚苯乙烯、聚乙烯和聚氯乙 烯，所述的活性基團(tuán)為一 CHO、-COOH、-OH、-NH2或-SH，所述熒光物質(zhì)為菲咯啉聯(lián)釕有機(jī)染 料、異硫氰根熒光素、異硫氰根羅丹明、6-羧基熒光素酰胺酯、熒光烷衍生物類、1，8-萘二 酰亞胺類、香豆素類有機(jī)熒光染料或其摻雜物或量子點(diǎn)；所述花生致敏蛋白用〇. 01?〇. 1 M pH 7. 2的磷酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)至包被物濃度為1. 0 mg/mL，噴膜量為0. 80 μ L/cm ;所述羊 抗兔IgG用0. 01?0. 1 M pH 7. 2的磷酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)至包被物濃度為1. 0 mg/mL，噴膜量 為 0·80 μ L/cm。
4. 權(quán)利要求1所述的裝置的制備方法，其特征在于包括如下步驟：（1) NC膜上檢測 區(qū)和質(zhì)控區(qū)的制備；（2)熒光微球墊的制備；（3)裝置組裝；所述的NC膜上檢測區(qū)和質(zhì) 控區(qū)的制備，包括所述NC膜的檢測區(qū)噴涂花生致敏蛋白，花生致敏蛋白用0.01?0.1 M pH 7. 2的磷酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)至包被物濃度為1 mg/mL，噴膜量為0. 8 μ L/cm ;所述NC膜的質(zhì) 控區(qū)上噴涂羊抗兔IgG，羊抗兔IgG用0.01?0.1 M pH 7. 2的磷酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)至包被 物濃度為lmg/mL，噴膜量為0.8 yL/cm;所述的熒光微球墊的制備，包括如下的步驟：（1) 熒光微球標(biāo)記的花生致敏蛋白多克隆抗體的制備（2)將熒光微球標(biāo)記的花生致敏蛋白多克 隆抗體噴涂在玻璃纖維膜上制備熒光微球墊；所述的裝置組裝為在粘性底板上依次搭接濾 紙、樣本墊、有熒光微球墊的玻璃纖維膜、固定有檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)的NC膜、吸水紙制成免疫 層析試紙條，并剪成合適大小。
5. 如權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于所述檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)的制備方法如 下：用BIODOT Dispensing System將花生致敏蛋白和羊抗兔IgG包被到NC膜上：分別用 0. 01?0. 1 M pH 7. 2的磷酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)包被物濃度為1 mg/mL，噴膜量為0. 8 μ L/cm， 檢測區(qū)上噴涂花生致敏蛋白，質(zhì)控區(qū)上噴涂羊抗兔IgG，兩區(qū)相隔5 mm ;37°C烘干處理過夜 后，室溫干燥的環(huán)境下保存?zhèn)溆谩?br> 6. 如權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于熒光微球標(biāo)記的花生致敏蛋白多克隆抗 體制備方法如下：取微球在1〇〇〇 Xg離心10?15 min，離心后收集沉淀，用0. 01 M pH 4. 8 的硼酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)微球濃度為0D45(I=0. 2,然后分別加入20?100 mg/mL對乙基-N，N-二甲基丙基碳二亞胺EDC，和2?20 mg/mL N-羥基丁二酰亞胺NHS，振蕩混勻，室溫孵育 10?30 min后，1000Xg離心5?15 min，沉淀用0. 01 M pH 4. 8的硼酸鹽緩沖液溶解， 并調(diào)節(jié)微球濃度為〇D45(l為0. 2-1. 0,1 mL該熒光微球中加入0. 1?100 μ g的花生致敏蛋 白多克隆抗體，充分混合后，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)1?4 h ;超純水離心洗滌2?5次，沉淀用0. 01 M pH 7. 2的磷酸鹽緩沖液復(fù)溶沉淀至起始體積；用BIODOT Dispensing System將標(biāo)記好 的熒光微球噴涂至玻璃纖維膜上，25°C真空干燥1?2 h，置于室溫干燥的環(huán)境下備用。
7. 用權(quán)利要求1~4任一所述裝置定性檢測花生致敏蛋白的方法，其特征在于包括如下 步驟：a.在裝置的加樣孔上滴加待測樣本，反應(yīng)10 min后，將檢測裝置放入熒光分析儀檢 測窗口；b.熒光微球在燈源激發(fā)下，發(fā)出強(qiáng)烈的熒光；c.當(dāng)樣本中不含有被檢測花生致敏 蛋白時(shí)，觀察窗內(nèi)只出現(xiàn)兩條熒光條帶，即檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)分別有一條熒光帶，則檢測樣本 為陰性；當(dāng)待測樣本中含有過量的被檢測花生致敏蛋白時(shí)，觀察窗內(nèi)只出現(xiàn)一條熒光條帶， 即檢測區(qū)無熒光條帶，質(zhì)控區(qū)有一條熒光帶，則檢測樣本即為陽性。
8. 用權(quán)利要求1~3任一所述裝置定量檢測花生致敏蛋白的方法，其特征在于包括如下 步驟：在裝置加樣孔上加入待測樣本，反應(yīng)10 min后，將檢測裝置放入熒光分析儀檢測窗 口；截留在檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)的熒光微球在燈源激發(fā)下，發(fā)出強(qiáng)烈的熒光條帶；發(fā)射的熒 光經(jīng)CCD掃描系統(tǒng)匯聚后，經(jīng)過光電聚集管，送入光電倍增管，光信號得到增強(qiáng)，再經(jīng)過信 號轉(zhuǎn)換元件，軟件處理后，熒光的強(qiáng)弱以數(shù)值的高低在顯示器上顯示；以不同已知濃度的 待測花生致敏蛋白作檢測，獲得一系列數(shù)值后，繪制待檢測花生致敏蛋白濃度與熒光強(qiáng)弱 數(shù)值關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線；根據(jù)檢測樣本的顯示數(shù)值，以及上述標(biāo)準(zhǔn)曲線得出檢測樣本中花 生致敏蛋白的濃度。
【文檔編號】G01N21/64GK104101581SQ201310124885
【公開日】2014年10月15日 申請日期:2013年4月11日 優(yōu)先權(quán)日:2013年4月11日
【發(fā)明者】賴衛(wèi)華, 倪小琴, 劉道峰, 山珊, 彭濤 申請人:南昌大學(xué)