專利名稱：Hplc法測定非洲蘿芙木中育亨賓的含量的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及育亨賓含量檢測方法，具體涉及非洲蘿芙木中育亨賓的高效液相色譜法(HPLC)含量測定。
背景技術(shù)：
蘿芙木是一種重要的藥用植物，含有利血平和育亨賓等20多個(gè)生物堿。育亨賓(見圖1)是一種吲哚型生物堿，分子式C21H26N203，紅棕色粉末或白色到乳白色精細(xì)粉末，熔點(diǎn):288°C 290°C，易溶于氯仿，溶于甲醇、乙醇，微溶于水。育亨賓主要治療男性性功能障礙、動(dòng)脈硬化、風(fēng)濕病等，同時(shí)還具有清風(fēng)熱，降肝火、效腫毒的功效。因此，檢測蘿芙木中育亨賓的含量非常重要。目前國內(nèi)對育亨賓的檢測方法常見的是高效液相色譜法。例如:陳琴華等(HPLC法測定蘿芙木中育亨賓的含量，劉璇，中南林業(yè)科技大學(xué))用色譜柱為C18，流動(dòng)相為甲醇-磷酸緩沖液-三乙胺=30: 70: 0.1，PH= 5.0，流速為lml/min，檢測波長為270nm。該檢測方法分離效果不是太好，檢測誤差大。劉宇等(高效液相色譜法測定蘿芙木中育亨賓和利血平的含量，劉宇，孫蕾，馮蕾，錢秀萍，趙鳳生，中國科學(xué)院上海冶金研究所，博士論文2000年度)用乙腈-7K -三氟乙酸為流動(dòng)相，對蘿芙木 提取液進(jìn)行檢測育亨賓，雖然分離效果很好，但是檢測時(shí)間達(dá)到I個(gè)多小時(shí)。此外還有紫外分光法和熒光法，這些檢測方法都比較繁瑣，條件要求較高，測定含量誤差大，對育亨賓的含量檢測有很多的限制。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有的檢測方法，本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有的高效液相色譜法測定非洲蘿芙木中育亨賓的含量，所述方法操作方便，分離效果好，節(jié)約時(shí)間，線性關(guān)系好，準(zhǔn)確度高。對于準(zhǔn)確測定蘿芙木中育亨賓的含量具有重要的應(yīng)用價(jià)值。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用如下方案:本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)自己掌握的知識配制溶液的方法。本發(fā)明典型但不限制的育亨賓標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制方法為:準(zhǔn)確稱取Img育亨賓標(biāo)準(zhǔn)品溶于IOml容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，制成濃度為0.lmg/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液。本發(fā)明典型但不限制的樣品溶液的配制方法為:準(zhǔn)確稱取非洲蘿芙木粉末(40目)2.0g于IOOml的容量瓶中，加入甲醇，超聲30min，靜置，4°C避光。本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)自己掌握的知識選擇液相色譜檢測條件。本發(fā)明典型但不限制的選用液相色譜儀為:美國Agilent-1260進(jìn)行檢測。 本發(fā)明的一個(gè)具體的實(shí)施例中，所選色譜柱是指:C18 (4.6 X 250mm5 μ m)，檢測波長為278nm，紫外檢測器。本發(fā)明中PHLC法檢測非洲蘿芙木中育亨賓的含量，流動(dòng)相所選為甲醇:水(三乙胺 0.003mol/L)組成的體積比為 60-55: 40-45，例如:60: 40,59: 41,58: 42,57: 43，56: 44,55: 45。本發(fā)明中PHLC法檢測非洲蘿芙木中育亨賓的含量，所述的進(jìn)樣量為1_20μ1，進(jìn)
一步優(yōu)選5 μ I。本發(fā)明中PHLC法檢測非洲蘿芙木中育亨賓的含量，所述流動(dòng)相的流速為
0.5-1.5mg/ml,例如 0.6mg/ml、0.7mg/ml、0.8mg/ml、0.9mg/ml>1.0mg/ml>1.lmg/ml>1.2mg/ml、L 3mg/ml>1.4mg/ml>1.5mg/ml,優(yōu)選 1.0mg/ml。本發(fā)明中PHLC法檢測非洲蘿芙木中育亨賓的含量，所述的柱箱溫度為20_40°C，優(yōu)選于25 °C。


圖1育亨賓結(jié)構(gòu)式圖2育亨賓標(biāo)準(zhǔn)品的色譜3非洲蘿芙木溶液的色譜4育予兵標(biāo)準(zhǔn)品的工作曲線
具體實(shí)施例方式(I)色譜條件:C18(4.6X250mm5ym)，流動(dòng)相為甲醇:水(三乙胺 0.003mol/l) =55: 45，使用紫外檢測器，檢測波長為·278nm，流速為lml/min，進(jìn)樣量為5 μ 1，柱溫為25°C。(2)育亨賓標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制:準(zhǔn)確稱取Img育亨賓標(biāo)準(zhǔn)品溶于IOml容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成濃度為0.lmg/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液。(3)蘿芙木樣品溶液的配制:準(zhǔn)確稱取非洲蘿芙木粉末(40目)2.0g于IOOml的容量瓶中，加入甲醇，超聲提取3次，每次30min，靜置，4°C避光。實(shí)施例1:按上述方法配制育亨賓標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)0.2 μ m微孔濾頭過濾后注入液相色譜儀中，按本發(fā)明確定的方法，如下所述的色譜條件下進(jìn)行測定。結(jié)果顯示出峰良好，育亨賓的色譜峰與其他組分色譜完全分離，見圖2所示。其中，色譜柱:(:18(4.6\250_511111);流動(dòng)相為甲醇:水(三乙胺0.003mol/l) =55: 45 ;色譜溫度:25°C;進(jìn)樣量:5μ I ;流速:lml/min ；檢測器:紫外檢測器；檢測波長:278nm。實(shí)施例2:按上述方法配制的蘿芙木溶液，取上層清液，經(jīng)3個(gè)0.2 μ m微孔濾頭過濾后注入液相色譜儀中，按本發(fā)明確定的方法，如下所述的色譜條件下進(jìn)行測定。通過育亨賓的標(biāo)準(zhǔn)圖譜記錄蘿芙木中育亨賓的峰面積，測得其結(jié)果。樣品中的育亨賓和其他雜質(zhì)有很好的分離，見圖3所示。其中，色譜柱:(:18(4.6\2501111115 4111);流動(dòng)相為甲醇:水(三乙胺
0.003mol/l) = 55: 45 ;色譜溫度:25°C;進(jìn)樣量:5μ I ;流速:lml/min ;檢測器:紫外檢測器；檢測波長:278nm。本發(fā)明的方法學(xué)考察:
線性關(guān)系考察按上述方法配制5個(gè)不同稀釋濃度的育亨賓標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)0.2 μ m微孔濾頭過濾后注入液相色譜儀中，按本發(fā)明確定的方法，如下所述的色譜條件下進(jìn)行測定。所述的5個(gè)不同濃度的育亨賓標(biāo)準(zhǔn)溶液分別為0.25 μ g/ml、5 μ g/ml、10 μ g/ml、20 μ g/ml、50 μ g/ml。以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，樣品濃度(X)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得r= 1，線性關(guān)系很好，見圖4。其中，色譜柱:(:18(4.6\2501111115 4 111);流動(dòng)相為甲醇:水(三乙胺0.003mol/l)=55: 45 ;色譜溫度:25°C ;進(jìn)樣量:5μ I ;流速:lml/min ;檢測器:紫外檢測器；檢測波長:278nm。線性范圍考察按上述方法配制的5個(gè)不同稀釋濃度的育亨賓標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)0.2 μ m微孔濾頭過濾后注入液相色譜儀中，按本發(fā)明確定的方法，如下所述的色譜條件下進(jìn)行測定。依次以
0.25 μ g/ml>5 μ g/ml、10 μ g/ml>20 μ g/ml>50 μ g/ml 濃度進(jìn)樣,每個(gè)樣品進(jìn)樣一次，根據(jù)育亨賓標(biāo)準(zhǔn)圖譜記錄相應(yīng)的峰面積，以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，樣品濃度(X)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得線性方程為:γ= ο.007X+0.0287，即濃度在0.25 μ g/ml-50 μ g/ml范圍內(nèi)，育亨賓的含量和峰面積呈良好的線性關(guān)系，見圖4。其中，色譜柱:(:18(4.6\250111111511111);流動(dòng)相為甲醇:水(三乙胺0.003mol/L) = 55: 45 ;色譜溫度:25°C ;進(jìn)樣量:5μ I ;流速:1ml/min ;檢測器:紫外檢測器；檢測波長:278nm。精密度考察精密度指在規(guī)定的測試條件下，同一個(gè)均勻樣品，經(jīng)多次取樣測定所得結(jié)果之間的接近程度，用以說明測量值的重現(xiàn)性，精密度用相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)來表示。按本發(fā)明確定的方法，將蘿芙木溶液連續(xù)進(jìn)樣5次，并根據(jù)如下所述的色譜條件下進(jìn)行測定。由上述的線行方程:Y = 10.007Χ+ 0.0287和育亨賓含量計(jì)算方程:M = CX 100ml (C為樣品的濃度，即為X)，即可得到非洲蘿芙木中 育亨賓的含量。結(jié)果得本發(fā)明的RSD為1.4%，2g蘿芙木溶液中平均含48.86 μ g的育亨賓，詳細(xì)結(jié)果見表1:表I蘿芙木中育亨賓的含量及RSD值
權(quán)利要求
1.本發(fā)明旨非洲蘿芙木中育亨賓的含量檢測，采用高效液相色譜法測定蘿芙木中育亨賓的含量，其特征在于流動(dòng)相為甲醇、三乙胺和水組成的混合溶劑為流動(dòng)相，體積比為甲醇:水(三乙胺0.003mol/L) = (60-55: 40-45)，檢測波長為278nm，紫外檢測器。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，本發(fā)明采用高效液相色譜法測定育亨賓的含量，選用的色譜柱為:C18 (4.6 X 250mm, 5 μ m)，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，本發(fā)明特征在于流動(dòng)相成分所述甲醇、三乙胺和水組成的體積比優(yōu)選60-55: 40-45，進(jìn)一步優(yōu)選55: 45。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，本發(fā)明的特征在于進(jìn)樣量為1_20μ1，進(jìn)一步優(yōu)選5μ1。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，本發(fā)明的特征在于流速為0.5-1.5mg/ml,優(yōu)選1.0mg/ml。
6.如權(quán)利要 求2所述的方法，本發(fā)明的特征在于所述柱溫箱溫度為20-40°C，優(yōu)選于25。。。
全文摘要
本發(fā)明屬于含量測定領(lǐng)域，具體涉及非洲蘿芙木中育亨賓含量測定的方法。本發(fā)明采用高效液相色譜法檢測非洲蘿芙木中育亨賓的含量。色譜條件為C18(4.6×250mm5μm)，流動(dòng)相為甲醇-水(三乙胺0.003mol/1)＝55∶45，使用紫外檢測器，檢測波長為278nm。所述方法檢測育亨賓濃度范圍為0.25-50μg/ml，線性相關(guān)系r＝1，RDS為1.4％。采用本發(fā)明的高效液相色譜法，操作簡單，可縮短色譜圖分析時(shí)間，保護(hù)色譜柱，降低流動(dòng)相配置費(fèi)用，節(jié)約成本，線性關(guān)系好，準(zhǔn)確性高。
文檔編號G01N30/88GK103235075SQ20131012545
公開日2013年8月7日 申請日期2013年4月12日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月12日
發(fā)明者張梅, 彭學(xué)東, 趙金召, 祁法娟 申請人:張家港威勝生物醫(yī)藥有限公司