專利名稱：禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病病毒快速檢測(cè)試紙條的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病病毒的器具，特別是涉及一種快速檢測(cè)禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病病毒的膠體金試紙條。
背景技術(shù)：
禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病(Reticuloendotheliosis，RE)是由禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病病毒(Reticuloendotheliosis virus, REV)引起雞、鴨、鵝、火雞及其他禽類以網(wǎng)狀細(xì)胞增生為主要特征的一組綜合征，包括急性網(wǎng)狀細(xì)胞增生病、矮小綜合征和淋巴組織及其它組織的慢性腫瘤增生性疾病。RE是禽類最重要的免疫抑制性和腫瘤性疾病之一。REV感染的自然宿主有火雞、雞、鴨、鵝和日本鵪鶉，其中火雞最易感染，并且有些病毒株對(duì)鴨的致病性比雞更強(qiáng)。REV主要感染雛雞，特別是新出孵的幼雛，感染后引起嚴(yán)重的免疫抑制或免疫耐受。而成年雞的免疫機(jī)能較為完善，感染后一般不出現(xiàn)病毒血癥。然而，由于該病的臨床癥狀不典型，一直沒有引起足夠的重視。近年來該病在全球迅速蔓延，對(duì)養(yǎng)禽業(yè)的危害日趨嚴(yán)重。世界上很多國(guó)家和地區(qū)均從雞或其它禽類中分離到REV。我國(guó)于1986年首次從南京地區(qū)的一患矮小綜合征病例雞群中分離到REV。至今，REV在國(guó)內(nèi)雞群中的流行已較為嚴(yán)重。2006年，有研究小組對(duì)全國(guó)5個(gè)省份9個(gè)規(guī)?；B(yǎng)禽企業(yè)的100多個(gè)雞群約2400份血清樣品進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)60%以上的雞群曾感染過REV，不同地區(qū)不同雞群的REV抗體的陽(yáng)性率平均約為20%。REV感染不僅能引起腫瘤發(fā)生，還可引起雞胸腺、法氏囊等免疫器官萎縮，使其免疫功能下降甚至喪失，從而導(dǎo)致嚴(yán)重的免疫抑制，以至感染雞群極易繼發(fā)感染其他疾病。REV與其他家禽免疫抑制病病毒如馬立克氏病病毒(MDV)、傳染性法氏囊病病毒(IBDV)共感染導(dǎo)致的混合感染、免疫抑制以及疫苗污染帶來的潛在危害使得該病對(duì)養(yǎng)禽業(yè)的危害大大加劇。REV屬于反轉(zhuǎn)錄病毒科。雖然不同毒株的致病力不太相同,但都具有相似的抗原性，即屬于同一血清型。REV可分為完全復(fù)制型和不完全復(fù)制型(缺陷型)。完全復(fù)制型的REV可在多種禽類體內(nèi)復(fù)制，主要通過雞胚、火雞胚、鴨胚及鵪鶉胚的成纖維細(xì)胞進(jìn)行體外增殖培養(yǎng)，不完全復(fù)制型REV即為原型病毒T株。RE的診斷主要有常規(guī)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)和分子生物學(xué)檢測(cè)兩大類方法。常規(guī)方法主要有病毒分離鑒定和REV抗體的血清學(xué)檢測(cè)，包括瓊脂凝膠沉淀試驗(yàn)(Agar gel precipitation test,AGP)、間接免疫突光抗體試驗(yàn)(Indirectimmunofluorescence assay, IFA)、酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(Enzyme linked immunosorbentassay, ELISA)等方法。分子生物學(xué)方法主要有聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chainreaction, PCR)、突光定量PCR和環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(Loop-mediated isothermalamplification, LAMP)等。REV的病毒分離培養(yǎng)、PCR、熒光定量PCR和LAMP等檢測(cè)技術(shù)操作復(fù)雜，需要昂貴的儀器設(shè)備，檢測(cè)過程耗時(shí)較長(zhǎng)，不適合生產(chǎn)一線或疫病現(xiàn)場(chǎng)的快速診斷需要。而AGP、IFA、ELISA等方法均只能用于REV抗體的檢測(cè)。ELISA測(cè)定方法雖然具有特異、敏感等特點(diǎn)，但操作復(fù)雜、費(fèi)時(shí)費(fèi)力，需要特 定儀器設(shè)備和專業(yè)技術(shù)人員操作，很難在基層普及。因此，研究一種快速檢測(cè)REV感染的檢測(cè)技術(shù)非常重要而迫切。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題:提供一種結(jié)果顯示直觀、準(zhǔn)確、快速檢測(cè)REV的試紙條，與其他檢測(cè)方法相比，該試紙條特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、結(jié)果顯示快速，檢測(cè)成本低廉。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:
一種快速檢測(cè)禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病病毒REV的試紙條，包括不吸水的支撐層、附著在支撐層上的吸附層，所述吸附層由樣品吸附纖維層、金標(biāo)抗體纖維層、纖維素膜層及吸水層依次拼接而成，所述纖維素膜層上標(biāo)記有抗羊IgG或抗小鼠IgG的對(duì)照印跡，以及含有抗REV抗體的檢測(cè)印跡；所述抗REV抗體為抗REV的單克隆抗體或多克隆抗體；所述金標(biāo)抗體纖維層上附著有與檢測(cè)印跡對(duì)應(yīng)的以膠體金標(biāo)記的抗REV的多克隆抗體或單克隆抗體。所述纖維素膜層由硝酸纖維素膜、純纖維素膜、羧化纖維素膜或聚偏二氟乙烯膜制成；所述樣品吸附纖維層由玻璃棉、尼龍纖維或聚酯纖維制成。所述支撐層由不吸水的硬質(zhì)塑膠片或硬紙條制成；所述吸水層用吸水紙制成；金標(biāo)抗體纖維層由玻璃棉、尼龍纖維或聚酯纖維制成。在所述樣品吸附纖維層、金標(biāo)抗體纖維層及吸水層上敷設(shè)有保護(hù)膜，且在樣品吸附纖維層與金標(biāo)抗體纖維層交界處對(duì)應(yīng)的保護(hù)膜上偏向樣品吸附纖維層一側(cè)0.3 0.7cm處印制有樣品標(biāo)記線；檢測(cè)印跡與對(duì)照印跡的排列組合為“ Il ”、“/ /”、“ + + ”、“U”、“H--?！?、“ h P’中的一種。

所述膠體金標(biāo)記的抗REV的單克隆抗體是通過以下方法制備的:
篩選抗REV的單克隆抗體細(xì)胞株，擴(kuò)大培養(yǎng)后用PBS洗滌后1000 r/min離心10 min收集細(xì)胞，以I X IO6 2X IO6個(gè)細(xì)胞/鼠的細(xì)胞量腹腔注射經(jīng)產(chǎn)母鼠，10 20 d后采集小鼠腹水，4000 r/min離心10 min后取上清,獲得單克隆抗體腹水；
以檸檬酸鈉還原法制備金溶膠:在50 100 mL沸騰的0.01% 0.05%(wt)氯金酸水溶液中加入2 4 mL的0.5% 2% (wt)檸檬酸三鈉溶液，反應(yīng)后獲得直徑為15 20 nm的膠體金溶膠；以0.1 mo I/L的K2CO3調(diào)節(jié)膠體金溶膠的pH值至8.5 9.5，以1:1000 I: 1300的印跡比將所述的單克隆抗體腹水加入膠體金溶膠中，印跡10 min后,加20% (wt)的 PEG-10000 至 PEG-10000 的終濃度為 0.05%(wt), 4°C > 1500 3000 r/min 離心 20 min,除去未結(jié)合的膠體金顆粒，4°C、15000 r/min離心I h,棄上清液,獲得初步純化的金標(biāo)抗體蛋白混合物后，用丙烯葡聚糖S-400柱層析，分離純化金標(biāo)蛋白，得到膠體金印跡的抗REV單克隆抗體。所述抗REV的單克隆抗體細(xì)胞株是由以下方法建立的:
將原核表達(dá)REV囊膜糖蛋白gp90基因的載體重組質(zhì)粒PET-28a-gp90轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL-21，挑選陽(yáng)性單克隆菌培養(yǎng)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)和培養(yǎng)，將超聲波裂解后的上清液過鎳柱純化，得到純化的REV gp90表達(dá)蛋白；
將純化的REV gp90表達(dá)蛋白以20 30 μ g/只的劑量用福氏佐劑乳化制備免疫原，免疫6周齡Balb/c系小鼠三次，每次間隔15 30 d ;最后一次加強(qiáng)免疫3 4 d后，將免疫小鼠眼球放血，拉頸處死，于75% (V)的酒精溶液中浸泡5 10 min，無菌取其脾細(xì)胞，剪碎并經(jīng)100目尼龍網(wǎng)過濾，用GNK洗液混懸脾細(xì)胞，1000 r/min離心10 min，收集脾細(xì)胞；將I X IO8個(gè)脾細(xì)胞與2X IO7 5X IO7個(gè)NSO骨髓瘤細(xì)胞混合，再用GNK洗液混懸后，1000 r/min離心10 min，棄上清，將細(xì)胞沉淀于37°C水浴中并在I min內(nèi)緩緩加入0.7 1.0 mL的pH8.5 pH9.0的PEG-1500中，邊加邊輕輕搖晃，然后再緩慢加入GNK洗液15ml,37°C水浴5 min后補(bǔ)加GNK洗液至總體積為40 mL, 1000 r/min離心10 min,棄上清,將得到的細(xì)胞沉淀重懸于1640/HAT選擇培養(yǎng)基中，以200 μ /孔鋪板至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，置于37°C、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 10 d，雜交瘤的培養(yǎng)上清用間接免疫熒光試驗(yàn)檢測(cè)，挑選熒光較強(qiáng)的細(xì)胞克隆，用有限稀釋法連續(xù)進(jìn)行三次細(xì)胞亞克隆，最后篩選得到特異性的抗REV的單抗雜交瘤細(xì)胞株。所述GNK洗液是由以下方法制備的:稱取NaCl 24g、KCl 1.2g、Na2HPO4.12H2010.68g、NaH2PO4.2Η20 2.34g、葡萄糖 6g、苯酚紅 0.03g，混合后加雙蒸水至 3000 ml，115。。滅菌15 min。本發(fā)明的有益效果:
(I)本發(fā)明根據(jù)ELISA的基本原理，用免疫層析試紙檢測(cè)病毒，利用微孔濾膜的滲濾濃縮和毛細(xì)管作用，將抗原-抗體反應(yīng)由ELISA的傳統(tǒng)液相環(huán)境轉(zhuǎn)到固相濾膜上快速進(jìn)行，并采用膠體金印跡代替酶印跡，憑肉眼直接觀察膠體金的顯色狀況，即時(shí)獲得檢測(cè)結(jié)果，因此該方法比ELISA等血清學(xué)方法更為簡(jiǎn)便、快速。(2)檢測(cè)特異性強(qiáng)，敏感性高。該試紙條以膠體金印跡高親和力的特異性單抗/多抗為基礎(chǔ)制備而成，金標(biāo)抗體中金顆粒與抗體分子之間無共價(jià)鍵形成，二者通過異性電荷間的范德華力相結(jié)合，膠體金標(biāo)對(duì)單抗/多抗的特異性和親和力(結(jié)合力)影響很小，且具有較高的印跡率。(3)操作簡(jiǎn)便，快速。使用本發(fā)明試紙條時(shí)無需附加任何其它儀器和試劑，只要將其測(cè)試端插入待檢樣品液中30秒左右，然后在5分鐘左右即可判定檢測(cè)結(jié)果。(4)結(jié)果顯示直觀、準(zhǔn)確。該試紙條以顯示棕紅色的檢測(cè)印跡和對(duì)照印跡作為檢測(cè)的陽(yáng)性和陰性印跡，即在纖維素膜上顯示兩條棕紅色印跡，表示在被檢測(cè)樣品中有病毒檢出，結(jié)果為陽(yáng)性；在纖維素膜上只顯示一條棕紅色對(duì)照印跡C，表示在被檢測(cè)樣品液中未檢出病毒，結(jié)果為陰性。結(jié)果判定直觀、準(zhǔn)確，簡(jiǎn)單明了，不易出現(xiàn)假陰性和假陽(yáng)性誤判。(5)減少投資和檢測(cè)成本。使用該試紙條，不需另配其它儀器、設(shè)備和試劑，節(jié)省大量?jī)x器、設(shè)備和附加試劑費(fèi)用；專業(yè)和非專業(yè)人士均可隨時(shí)隨地進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，無需支付專家診斷檢查費(fèi)或送樣品去診斷室的路費(fèi)，節(jié)省檢測(cè)成本，檢測(cè)費(fèi)用低。(6)應(yīng)用范圍廣，便于普遍推廣應(yīng)用。本發(fā)明操作簡(jiǎn)單，成“一步式”或“傻瓜式”，而且方便攜帶和保存，能滿足不同層次人員的需要，包括專業(yè)化驗(yàn)、海關(guān)檢疫、衛(wèi)生防疫、質(zhì)量監(jiān)測(cè)、畜產(chǎn)品加工、集約化養(yǎng)殖到個(gè)體養(yǎng)殖等，具有廣闊的市場(chǎng)前景和較好的經(jīng)濟(jì)、社會(huì)效益。


圖1為本發(fā)明試紙條的俯視結(jié)構(gòu)示意圖。

圖2為圖1試紙條的側(cè)面結(jié)構(gòu)示意圖。圖中I為支撐層，2為樣品吸附纖維層，3為金標(biāo)抗體纖維層，4為纖維素膜層，5為吸水層，6為檢測(cè)印跡，7為對(duì)照印跡，8-1為測(cè)試端保護(hù)膜，8-2為手柄端保護(hù)膜，9為印跡線。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1:一種快速檢測(cè)禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病病毒的試紙條，參見圖1和圖2，支撐層I以塑膠薄片條制成，樣品吸附纖維層2以玻璃棉制成，金標(biāo)抗體纖維層3上附著有膠體金標(biāo)記的抗REV單克隆抗體的玻璃棉制成的金標(biāo)抗體，纖維素膜層4為硝酸纖維素制成，吸水層5由吸水濾紙制成，將編號(hào)2、3、4、5各層依次粘貼在支撐層I上，彼此拼接的交界處纖維互相交叉滲透。纖維素膜層4上設(shè)有抗REV多克隆抗體IgG溶液標(biāo)記檢測(cè)印跡6 (代號(hào)T)，以及以羊(兔)抗小鼠IgG溶液標(biāo)記出對(duì)照印跡7 (代號(hào)C);檢測(cè)印跡與對(duì)照印跡的排列形式為“ I I ”。測(cè)試端保護(hù)膜8-1覆蓋在樣品吸附纖維層2和金標(biāo)抗體纖維層3上面，在測(cè)試端保護(hù)膜8-1上偏向于樣品吸附纖維層2的一側(cè)0.5cm處印有印跡線9，印跡線右端印有箭頭及MAX字樣，吸水層5上覆蓋有其它顏色(如黃色或藍(lán)色)的手柄端保護(hù)膜8-2。用于對(duì)照印跡的羊(兔)抗小鼠IgG抗體，及用于檢測(cè)印跡和金標(biāo)抗體纖維層的抗REV的多克隆抗體和單克隆抗體的制備方法如下:
(I)羊(兔)抗小鼠IgG的制備
以飽和硫酸銨法提取小鼠血清中的IgG:取I份血清加2份PBS液(pH 7.2)混勻，加等體積飽和硫酸銨液混勻，置4°C冰箱內(nèi)2小時(shí)，在4°C、10000 r/min離心15 min,棄上清液；以適量PBS液(pH7.2)溶解沉淀，加飽和硫酸銨液至其最終濃度為33%，置4°C冰箱內(nèi)2小時(shí)，在4°C、10000 r/min條件下離心15 min，棄上清液，以少量PBS液(pH7.2)溶解沉淀，置4°C冰箱內(nèi)用PBS液(pH7.2)過夜透析，換液2_3次，在4°C、10000 r/min條件下離心15min,收集上清液，以紫外分光·光度計(jì)測(cè)定其蛋白濃度。經(jīng)皮下或肌肉以50 μ g 100 μ g/kg體重的劑量注射IgG至抗體陰性健康羊或家兔3 4次，末次免疫20 d后，靜脈采血，以ELISA測(cè)定其血清抗體效價(jià)在1:2000以上，心臟采血或頸動(dòng)脈放血，分離制備高免血清，以飽和硫酸銨法提取羊(兔)抗小鼠的IgG (其提取方法與上述提取小鼠血清IgG相同，不再重述)，用于標(biāo)記本發(fā)明試紙條的對(duì)照印跡。(2)抗REV單克隆細(xì)胞株的建立
將原核表達(dá)REV囊膜糖蛋白gp90的重組質(zhì)粒PET-28a-gp90轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL-21，挑取陽(yáng)性單克隆菌落，接種于5 mL LB液體培養(yǎng)基中，37°C搖振培養(yǎng)過夜。取5 mL培養(yǎng)物接種于100 mL LB液體培養(yǎng)基中，37°C搖振培養(yǎng)約3 h，達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，即OD6tltl約0.8 1.2，按照每毫升培養(yǎng)基加入10 μ I 100 mmol/L IPTG至終濃度為1.0 mmol/L誘導(dǎo)表達(dá)，28°C條件下緩慢搖振培養(yǎng)4 5 ho在4°C、5000 r/min條件離心15 20 min,棄上清,按I g濕重菌體/2 5 ml平衡緩沖液的比例充分懸浮菌體沉淀。用超聲波裂解儀裂解，直至云霧狀的菌液變得比較清亮，4°C、15000 rpm離心15 min，收集上清備用。將上清液上樣至用平衡緩沖液(NaCl 500 mmol/L、PB 20 mmol/L、咪唑5 mmol/L，pH8.0)平衡的鎳離子親和層析柱，再依次分別用含30、50、75 mmol/L咪唑的洗脫緩沖液(NaCl 500 mmol/L.PB 20 mmol/L, pH7.4)進(jìn)行分階段洗脫，收集各階段洗脫液。將各階段洗脫峰進(jìn)行SDS-PAGE分析，電泳完畢后用考馬斯亮藍(lán)G2250 (甲醇:水:冰乙酸=4.5: 4.5: I)室溫染色2 h，用脫色液(40%甲醇、10%冰乙酸)脫色至背景清晰，觀察純化結(jié)果表明:重組菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后有明顯的與預(yù)期大小相符的目的蛋白條帶，表明REV囊膜糖蛋白gp90在萬.中獲得了大量表達(dá)。經(jīng)親和層析的重復(fù)洗脫液中，前兩次洗脫的純化蛋白含量最大，此后洗脫液中含量迅速減少，電泳與濃度測(cè)定結(jié)果一致。洗脫液中的REVgp90表達(dá)蛋白純度較高，可滿足單抗制備免疫原的需要。將純化的重組REV gp90表達(dá)蛋白以20 30 μ g/只的劑量用福氏佐劑乳化制備免疫原，免疫6周齡Balb/c系小鼠三次,每次間隔15 30天；最后一次加強(qiáng)免疫后3 4d,將免疫小鼠眼球放血，拉頸處死，于75%( V)的酒精溶液腫浸泡5 10 min,無菌取其脾細(xì)胞；剪碎并經(jīng) 100 目尼龍網(wǎng)過濾，用GNK 洗液(NaCl 24g、KCl 1.2g,Na2HPO4.12H20 10.68g、NaH2PO4.2H20 2.34g、葡萄糖6g、苯酹紅0.03g,混合后加雙蒸水至3000 ml,115°C滅菌15min)混懸脾細(xì)胞，1000 r/min離心10 min，收集脾細(xì)胞；將I X IO8個(gè)的脾細(xì)胞與2 X IO7 5 X IO7個(gè)的NSO骨髓瘤細(xì)胞混合，再用GNK洗液混懸后，1000 r/min離心10 min棄上清，細(xì)胞沉淀于37°C的水浴中在I min內(nèi)緩緩加入0.7 1.0 mL的PEG-1500 (pH8.5 pH
9.0)邊加邊搖，然后緩慢加入GNK洗液15 ml，以終止PEG的作用；37°C水浴5 min后補(bǔ)加GNK洗液至總體積為40 ml, 1000 r/min離心10 min棄上清，將細(xì)胞沉淀重懸于1640/HAT選擇培養(yǎng)基中，以200 PL/孔鋪板至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，置于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 10 d，用IFA檢測(cè)雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)上清，挑選熒光較強(qiáng)的陽(yáng)性孔細(xì)胞克隆，有限稀釋法連續(xù)進(jìn)行三次細(xì)胞亞克隆，最后篩選獲得特異性抗REV的單克隆雜交瘤細(xì)胞株。(3)抗REV金標(biāo)單克隆抗體和金標(biāo)單克隆抗體纖維膜的制備
將篩選到的特異性抗REV的單克隆細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，PBS洗后1000 r/min離心10 min,收集細(xì)胞，以IX IO6 2X IO6個(gè)/只的細(xì)胞量對(duì)經(jīng)產(chǎn)母鼠進(jìn)行腹腔注射，10-20 d后采集小鼠腹水，4000 r/min離心10 min后的上清即為所需的單克隆抗體腹水。
以檸檬酸鈉還原法制備金溶膠:在50 100 mL沸騰的0.01% 0.05% (wt)氯金酸水溶液中加入2 4 mL的0.5% 2%檸檬酸三鈉溶液，反應(yīng)后獲得直徑15 nm左右的膠體金。以0.1 mol/L的KfO3調(diào)膠體金pH值至8.5 9.5，以1:1000 1:1300的印跡比將待印跡的抗REV單克隆抗體腹水加入pH8.5 9.5的金溶膠中，印跡10 min后，加20% (wt)的 PEG-10000 至 PEG-10000 終濃度達(dá)到 0.05%，4°C下、1500 3000 r/min 離心 20 min,除去未結(jié)合的膠體金顆粒，4°C、15000 r/min離心I h,棄上清液,獲得初步純化的金標(biāo)抗體蛋白混合物后，用丙烯葡聚糖S-400柱層析，分離純化金標(biāo)蛋白，獲得膠體金印跡的抗REV單克隆抗體。將1:100 1:500稀釋的膠體金印跡的上述單克隆抗體吸附于精制玻璃棉(尼龍纖維或聚酯纖維)中，4°C下低溫真空干燥，即制得抗REV金標(biāo)單克隆抗體纖維膜。(4)抗REV多克隆抗體的制備
差速離心或蔗糖密度梯度離心對(duì)REV CEF細(xì)胞毒進(jìn)行濃縮、純化，甲醛滅活后用福氏佐劑乳化制備免疫抗原，單獨(dú)多次免疫接種抗體陰性健康羊或兔。末次免疫20 d后靜脈采血，以IFA檢測(cè)其血清抗體效價(jià)在1:2000以上時(shí)，心臟采血或頸動(dòng)脈放血，分離制備高免血清，以飽和硫酸銨法提取血清中IgG抗體(方法與提取小鼠血清IgG相同，不重述)。

(5)試紙條的檢測(cè)操作方法
a、樣品液的制備無菌取病雞的全血，以抗凝劑生理鹽水作1:10 1:50倍稀釋，離心分離血液淋巴細(xì)胞懸液，待檢；若取病雞的組織如胸腺、法氏囊、脾臟等，則將其剪碎、研磨，以生理鹽水制成1:2 1:5倍的待檢測(cè)樣品懸液，反復(fù)凍融3次，置4°C澄清或離心取上清備用；
b、檢測(cè)操作將該試紙條測(cè)試端插入待檢測(cè)樣品中，插入深度不超過印跡線(MAX)，約30 s后取出試紙條,水平放置約I 5 min,同時(shí)觀察結(jié)果。C、結(jié)果判斷如果在試紙條的纖維素膜上只顯示出一條棕紅色對(duì)照印跡C，表示測(cè)檢結(jié)果呈陰性，說明在被檢樣品液中未檢測(cè)出REV ;如果試紙條上的纖維素膜出現(xiàn)棕紅色的對(duì)照印跡C和檢測(cè)印跡T，表示檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性，即在待檢樣品中檢出REV;如果纖維素膜上沒有任何棕紅色印跡顯示，則表明試紙條已失效或操作有誤。(6)本發(fā)明試紙條的靈敏性、特異性試驗(yàn)
a、靈敏性試驗(yàn)。將REV的CEF細(xì)胞培養(yǎng)液用PBS (PH7.4)或雙蒸水分別配制不同病毒滴度的溶液(105.° TCID5Q/mL、IO4.。TCID50/mL、IO3.0 TCID5(l/mL、IO2 0 TCID50/mL、IO1.0 TCID50/mL)，將檢測(cè)試紙條測(cè)試端插入這些不同病毒滴度的溶液中，插入深度不超過印跡線(MAX)，約30 s后取出試紙條，水平放置約I 5 min,同時(shí)觀察結(jié)果。插入105_° TCID5(l/mL和104_°TCID5tlAiL病毒液的檢測(cè)試紙均出現(xiàn)棕紅色的對(duì)照印跡C和檢測(cè)印跡T，即檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性；插入103_° TCID5tlAiL病毒液的檢測(cè)試紙出現(xiàn)棕紅色的對(duì)照印跡C，但檢測(cè)印跡T的棕紅色較弱，即檢測(cè)結(jié)果為弱陽(yáng)性；插入102_° TCID5tlAiL和101° TCID5tZmL病毒液的檢測(cè)試紙只顯示出一條棕紅色對(duì)照印跡C，即檢測(cè)結(jié)果為陰性。由此可見，該試紙條對(duì)REV具有較高的靈敏度，可以檢測(cè)REV的最低病毒滴度為103_° TCID5(l/mL。b、特異性試驗(yàn)。用本發(fā)明的試紙條檢測(cè)其它家禽免疫抑制病病毒:馬立克氏病病毒(MDV)、禽白血病病毒(ALV)以及傳染性法氏囊病病毒(IBDV)的病毒液，結(jié)果顯示上述3種病毒液用本發(fā)明試紙條檢測(cè)的結(jié)果均為陰性，說明該試紙條的特異性強(qiáng)，與其他同類病無交叉反應(yīng)。(7)上述試紙條的檢測(cè)原理
當(dāng)試紙條測(cè)試端(樣品吸附纖維層)插入待檢測(cè)樣品溶液后，待檢溶液通過層析作用帶動(dòng)待檢病雞病毒及金標(biāo)抗體纖維膜中的金標(biāo)抗體一起向纖維素膜擴(kuò)散，并最終滲入手柄端的吸水層中，擴(kuò)散過程中待檢病毒可與該病毒相對(duì)應(yīng)的金標(biāo)單抗相結(jié)合，進(jìn)而與纖維素膜上檢測(cè)印跡中的抗該病毒的多抗IgG結(jié)合，從而顯示出棕紅色的檢測(cè)印跡T ;而對(duì)照印跡中的羊抗或兔抗小鼠IgG則可與金標(biāo)單抗結(jié)合，形成棕紅色對(duì)照印跡C。如果待檢樣品液中沒有REV，試紙條只顯示出一條棕紅色對(duì)照印跡C ;如果纖維素膜上沒有任何棕紅色印跡顯示，則表明試紙條已失效或操作失誤。實(shí)施例2:檢測(cè)網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病病毒的試紙條，其結(jié)構(gòu)、制備方法與實(shí)施例1基本相同，不同之處在于:由尼龍纖維制成的金標(biāo)抗體纖維層3上附著以膠體金標(biāo)記的抗REV金標(biāo)多克隆抗體；在硝酸纖維制成的纖維素膜層4上設(shè)有以抗REV單克隆抗體IgG溶液噴涂的檢測(cè)印跡T，以羊(兔)抗小鼠IgG溶液噴涂的對(duì)照印跡C。其它包括檢測(cè)樣品制備、操作方法和結(jié)果判定等均與實(shí)施例1相同。實(shí)施例3:檢測(cè)網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病病毒試紙條，其結(jié)構(gòu)、制備方法與實(shí)施例1基本相同，不同之處在于:由聚酯纖維制成的金標(biāo)抗體纖維層3上附著有抗REV金標(biāo)的單克隆抗體；在聚偏二氟乙烯制成 的纖維素膜層4上設(shè)有以對(duì)應(yīng)的抗REV多克隆抗體IgG溶液標(biāo)記的檢測(cè)印跡T，以羊(兔)抗小鼠IgG溶液標(biāo)記的對(duì)照印跡C。其它包括檢測(cè)樣品制備、操作方法和結(jié)果判定等均與實(shí)施例1相同。實(shí)施例4:檢測(cè)網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病病毒試紙條，其結(jié)構(gòu)、制備方法與實(shí)施例3基本相同，不同之處在于:由尼龍纖維制成的金標(biāo)抗體纖維層3上附著抗REV的金標(biāo)多克隆抗體；聚偏二氟乙烯制成的纖維素膜層4上設(shè)有以對(duì)應(yīng)的抗REV單克隆抗體IgG溶液標(biāo)記的檢測(cè)印跡T，以羊(兔)抗小鼠IgG溶液標(biāo)記的對(duì)照印跡C。實(shí)施例5:檢測(cè)網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病病毒試紙條，其結(jié)構(gòu)、制備方法與實(shí)施例3基本相同，不同之處在于:由尼龍纖維制成的金標(biāo)抗體纖維層3上附著有抗REV的金標(biāo)單克隆抗體；在聚偏二氟乙烯制成的纖維素膜層4上設(shè)有以識(shí)別另一表位的抗REV單克隆抗體IgG溶液印制的檢測(cè)印跡T，以羊(兔)抗鼠IgG溶液印制的對(duì)照印跡C，檢測(cè)印跡與對(duì)照印跡的排列組合為“/ /”、“ + + ”、“1^”、“丁丁”、“ h卜”中的任意一種。實(shí)施例6:試紙條結(jié)構(gòu)和實(shí)施例1基本相同，不同之處在于: 支撐層I由不吸水的硬紙條制成，樣品吸附纖維層2由尼龍纖維制成，纖維素膜層4用純纖維素膜制成。實(shí)施例7:試紙條結(jié)構(gòu)和實(shí)施例1基本相同，不同之處在于:
樣品吸附纖維層2由聚酯纖維膜制成，纖維素膜層4用羧化纖維素膜制成。實(shí)施例8:試紙條結(jié)構(gòu)和實(shí)施例3基本相同，不同之處在于:樣品吸附纖維層2用尼龍纖維制成，纖維素膜層4用聚偏二氟乙烯(PVDF)纖維膜制成。實(shí)施例9:試紙條結(jié)構(gòu)和實(shí)施例5基本相同，不同之處在于:樣品吸附纖維層2用聚酯纖維膜制成，纖維素膜層4用純纖維素膜制成。
權(quán)利要求
1.一種快速檢測(cè)禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病病毒REV的試紙條，包括不吸水的支撐層、附著在支撐層上的吸附層，所述吸附層由樣品吸附纖維層、金標(biāo)抗體纖維層、纖維素膜層及吸水層依次拼接而成，其特征在于:所述纖維素膜層上標(biāo)記有抗羊IgG或抗小鼠IgG的對(duì)照印跡，以及含有抗REV抗體的檢測(cè)印跡；所述抗REV抗體為抗REV的單克隆抗體或多克隆抗體；所述金標(biāo)抗體纖維層上附著有與檢測(cè)印跡對(duì)應(yīng)的以膠體金標(biāo)記的抗REV的多克隆抗體或單克隆抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試紙條，其特征在于:所述纖維素膜層由硝酸纖維素膜、純纖維素膜、羧化纖維素膜或聚偏二氟乙烯膜制成。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試紙條，其特征在于:所述樣品吸附纖維層由玻璃棉、尼龍纖維或聚酯纖維制成。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試紙條，其特征在于:所述支撐層由不吸水的硬質(zhì)塑膠片或硬紙條制成；所述吸水層用吸水紙制成。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試紙條，其特征在于:所述金標(biāo)抗體纖維層由玻璃棉、尼龍纖維或聚酯纖維制成。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試紙條，其特征在于:在所述樣品吸附纖維層、金標(biāo)抗體纖維層及吸水層上敷設(shè)有保護(hù)膜，且在樣品吸附纖維層與金標(biāo)抗體纖維層交界處對(duì)應(yīng)的保護(hù)膜上偏向樣品吸附纖維層一側(cè)0.3 0.7 cm處印制有樣品標(biāo)記線。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試紙條，其特征在于:檢測(cè)印跡與對(duì)照印跡的排列組合為“ Il，，、“/ /”、 “ ++”、“丄丄”、“丁丁”、“ 1- P’中的一種。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)所述的試紙條，其特征在于:所述膠體金標(biāo)記的抗REV的單克隆抗體是通過以下方法制備的: 篩選抗REV的單克隆抗體細(xì)胞株，擴(kuò)大培養(yǎng)后用PBS洗滌后1000 r/min離心10 min收集細(xì)胞，以I X IO6 2X IO6個(gè)細(xì)胞/鼠的細(xì)胞量腹腔注射經(jīng)產(chǎn)母鼠，10 20 d后采集小鼠腹水，4000 r/min離心10 min后取上清,獲得單克隆抗體腹水； 以檸檬酸鈉還原法制備金溶膠:在50 100 mL沸騰的0.01% 0.05%(wt)氯金酸水溶液中加入2 4 mL的0.5% 2% (wt)檸檬酸三鈉溶液，反應(yīng)后獲得直徑為15 20 nm的膠體金溶膠；以0.1 mo I/L的K2CO3調(diào)節(jié)膠體金溶膠的pH值至8.5 9.5，以1:1000 I: 1300的印跡比將所述的單克隆抗體腹水加入膠體金溶膠中，印跡10 min后,加20% (wt)的 PEG-10000 至 PEG-10000 的終濃度為 0.05%(wt), 4°C > 1500 3000 r/min 離心 20 min,除去未結(jié)合的膠體金顆粒，4°C、15000 r/min離心I h,棄上清液,獲得初步純化的金標(biāo)抗體蛋白混合物后，用丙烯葡聚糖S-400柱層析，分離純化金標(biāo)蛋白，得到膠體金印跡的抗REV單克隆抗體。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的試紙條，其特征在于:所述抗REV的單克隆抗體細(xì)胞株是由以下方法建立的: 將原核表達(dá)REV囊膜糖蛋白gp90的載體重組質(zhì)粒PET-28a-gp90轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL-21，挑選陽(yáng)性單克隆菌培養(yǎng)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)和培養(yǎng)，將超聲波裂解后的上清液過鎳柱純化，得到純化的REV gp90表達(dá)蛋白； 將純化的REV gp90表達(dá)蛋白以20 30 μ g/只的劑量用福氏佐劑乳化制備免疫原，免疫6周齡Balb/c系小鼠三次，每次間隔15 30 d ;最后一次加強(qiáng)免疫3 4 d后，將免疫小鼠眼球放血，拉頸處死，于75% (V)的酒精溶液中浸泡5 10 min，無菌取其脾細(xì)胞，剪碎并經(jīng)100目尼龍網(wǎng)過濾，用GNK洗液混懸脾細(xì)胞，1000 r/min離心10 min，收集脾細(xì)胞；將I X IO8個(gè)脾細(xì)胞與2X IO7 5X IO7個(gè)NSO骨髓瘤細(xì)胞混合，再用GNK洗液混懸后，.1000 r/min離心10 min，棄上清，將細(xì)胞沉淀于37°C水浴中并在I min內(nèi)緩緩加入0.7 .1.0 mL的pH8.5 pH9.0的PEG-1500中，邊加邊輕輕搖晃，然后再緩慢加入GNK洗液15ml,37°C水浴5 min后補(bǔ)加GNK洗液至總體積為40 mL, 1000 r/min離心10 min,棄上清,將得到的細(xì)胞沉淀重懸于1640/HAT選擇培養(yǎng)基中，以200 μ /孔鋪板至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，置于37°C、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 10 d，雜交瘤的培養(yǎng)上清用間接免疫熒光試驗(yàn)檢測(cè)，挑選熒光較強(qiáng)的細(xì)胞克隆，用有限稀釋法連續(xù)進(jìn)行三次細(xì)胞亞克隆，最后篩選得到特異性的抗REV的單抗雜交瘤細(xì)胞株。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的試紙條，其特征在于:所述GNK洗液是由以下方法制備的:稱取 NaCl 24g、KCl 1.2g、Na2HPO4.12H20 10.68g、NaH2PO4.2H20 2.34g、葡萄糖 6g、苯酚紅0.03g,混合后加雙蒸水至3000 ml,115°C滅菌15 min。
全文摘要
本發(fā)明公開一種快速檢測(cè)禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病病毒REV的試紙條，包括不吸水的支撐層、附著在支撐層上的吸附層，吸附層由樣品吸附纖維層、金標(biāo)抗體纖維層、纖維素膜層及吸水層依次拼接而成，纖維素膜層上標(biāo)記有抗羊IgG或抗小鼠IgG的對(duì)照印跡，以及含有抗REV抗體的檢測(cè)印跡；抗REV抗體為抗REV的單克隆抗體或多克隆抗體；金標(biāo)抗體纖維層上附著有與檢測(cè)印跡對(duì)應(yīng)的以膠體金標(biāo)記的抗REV的多克隆抗體或單克隆抗體。該試紙條檢測(cè)的特異性強(qiáng)、敏感性高，操作簡(jiǎn)便、快速，結(jié)果顯示直觀、準(zhǔn)確，無需附加設(shè)備和試劑，檢測(cè)成本較低，適合禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病病毒的快速檢測(cè)；使用范圍廣，便于推廣應(yīng)用。
文檔編號(hào)G01N33/569GK103235122SQ20131013317
公開日2013年8月7日 申請(qǐng)日期2013年4月17日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月17日
發(fā)明者張改平, 羅俊, 滕蔓, 崔治中, 鄧瑞廣, 江國(guó)托, 趙東, 趙鵬, 柴書軍, 程娜, 胡驍飛, 職愛民, 楊蘇珍, 盧清俠, 郝慧芳 申請(qǐng)人:河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院