專利名稱：牛病毒性腹瀉病毒抗體快速檢測試紙條及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及動物病毒學和動物傳染病學領(lǐng)域，具體是一種用于檢測牛病毒性腹瀉病毒抗體的快速檢測試紙條及其制備方法。
背景技術(shù)：
牛病毒性腹灣(Bovine viral diarrhoea, BVD)又稱為牛病毒性腹灣/粘膜病(Bovine viral diarrhoea-mucosal disease, BVD-MD),是由牛病毒性腹灣病毒(Bovineviral diarrhoea virus,BVDV)引起的主要發(fā)生于牛的一種接觸性傳染病。BVDV與豬痕病毒(classical swine fever virus, CSFV)、羊邊界病病毒(border disease virus’BDV)及部分未分類痕病毒同屬于黃病毒科痕病毒屬，均為單股正鏈RNA病毒。痕病毒屬成員中的病毒過去被認為是宿主特異性的，但后來的研究表明BVDV與BDV可以感染更廣泛的宿主，它們不但可以感染牛和羊，并且可以感染包括豬在內(nèi)的多種偶蹄類動物。目前，BVD廣泛分布于世界各國，如美國血清學陽性率約50%，加拿大82%，澳大利亞89%，法國76%，英格蘭54% 74%，芬蘭大于50%，瑞士 78% 80%，印度17.3%，南美6國(巴西、智利、阿根廷、哥倫比亞、烏拉圭和秘魯)陽性率達84%。該病在我國絕大多數(shù)省份均有報道，在部分地區(qū)，BVDV血清抗陽性率達80%以上。在國際動物貿(mào)易中，很多國家規(guī)定BVD是必須檢疫的動物疫病之一。BVD的廣泛存在嚴重影響著動物養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展和國際動物貿(mào)易，造成巨大的經(jīng)濟損失。BVDV引起的牛病毒性腹瀉-黏膜病迄今尚無有效的治療方法，且疫苗預防效果不理想。BVDV可以造成免疫耐受和持續(xù)性感染，這給該病的檢疫帶來了很大的困難。目前，檢測BVD的方法主要為病毒分離、中和試驗、瓊脂擴散試驗，這些方法操作繁瑣、費時。RT-PCR方法雖然特異性和敏感性都很高，但需要專門的儀器設(shè)備和技術(shù)人員，只能用于實驗室檢測。因此，這些方法均不適用于現(xiàn)場檢測和基層獸醫(yī)診斷部門臨床檢測。另外，由于BVDV可造成持續(xù)感染，這給BVDV臨床檢測帶來了很大的困難。因此，建立BVDV抗體快速檢測方法，用于BVDV抗體的快速檢測和現(xiàn)場檢測，有利于對感染BVDV的動物進行及時的清除，達到種群凈化的目的，有利于動物養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。膠體金免疫層析試紙條(immunochromatographic strip)是20世紀90年代初期的發(fā)展起來的一種快速免疫學檢測方法，該方法的核心技術(shù)是以條狀纖維層析材料(常用硝酸纖維素膜、尼龍膜等)為固相載體。用膠體金標記的蛋白質(zhì)作為探針，在吸水墊的作用下，通過毛細作用使樣品溶液反應物和膠體金標記物在固相載體以一定的速度向一端定向移動泳動(Lateral flow)。通過在硝酸纖維素上形成的檢測線和對照線來判定結(jié)果。這種檢測方法具有快速、方便、特異、敏感、安全等特點。本發(fā)明是用基因工程表達的截短的BVDV NS蛋白抗原、膠體金標記的鏈球菌G蛋白(SPG)、硝酸纖維素膜等為主要材料，建立BVDV抗體免疫層析試紙檢測方法并制備BVDV抗體快速檢測試紙條，可以用于BVDV抗體的快速檢測和現(xiàn)場檢測，解決目前國內(nèi)缺乏BVDV抗體快速檢測和現(xiàn)場檢測方法和檢測工具的現(xiàn)狀。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服BVDV抗體現(xiàn)有檢測方法的不足，提供一種具有敏感性高、特異性強、檢測快速、操作方便BVDV抗體檢測方法。如圖1所示，牛病毒性腹瀉病毒抗體免疫層析快速檢測試劑紙條由背襯⑴、硝酸纖維素膜(2)、金標復合物墊(3)、樣品墊(4)、吸水墊(5)、檢測線(6)和對照線(7)組成。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的:1、BVDV NS蛋白抗原表位分析及目的基因的擴增:通過檢索BVDV NS蛋白序列(NP_776266)，利用在線軟件對其主要抗原表位進行分析，確定選擇抗原表位位于NS3蛋白中第165 425氨基酸，其氨基酸序列為序列表中SEQ ID N0.1，其對應的核苷酸序列為GeneBank公布的BVDV基因組序列(NC_001461.1)中第4286 5068位核苷酸。并根據(jù)該核苷酸序列設(shè)計特異性引物，在引物5'端人工添加LIC粘性末端。用RT-PCR方法從BVDV基因組中擴增該片段，并進行DNA測序。2、PET52/LIC-BVDV NS重組表達載體的構(gòu)建:用T4DNA聚合酶處理的上述PCR產(chǎn)物，并與商品化線性pET52/LIc載體連接，構(gòu)建pET52/LIC-BVDV NS重組表達載體。通過PCR方法鑒定和DNA測序分析對構(gòu)建的表達載體進行鑒定。3、BVDV NS重組蛋白的表達和純化:將經(jīng)鑒定為DNA序列無突變的重組表達載體PET52/LIC-BVDV NS轉(zhuǎn)化(DE3)pLacI E.coli感受態(tài)細胞，在IPTG誘導下，進行蛋白表達，用SDS-PAGE和Western blot分析表達產(chǎn)物，并用相關(guān)病毒陽性血清與表達產(chǎn)物進行Western blot試驗,分析表達的物特異性。使用6 XHis標簽融合蛋白純化試劑盒對表達產(chǎn)物進行純化。4、金標復合物的制備墊:采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金溶液，調(diào)膠體金溶液的PH值為6.5，冷卻至室溫后。采用室溫攪拌法將適量SPG溶液加入膠體金溶液中進行標記，用卵白蛋白(OVA)進行封閉，標記結(jié)束后，采用差速離心對標記物進行純化，用XYZ3050點樣平臺將膠體金標記的SPG溶液噴于玻璃纖維棉上，制作成金標復合物墊。5、兔抗SPG的制備:用SPG免疫2月齡家兔，制備兔抗SPG多克隆抗體，用蛋白A/G抗體純化試劑盒從多克隆抗體中純化IgG，作為對照線試劑。6、檢測線和對照線的制備:首先將硝酸纖維素膜粘貼于背襯表面，再將濃度為lmg/mL的BVDV NS3重組蛋白溶液和濃度為1.5mg/mL的兔抗SPG抗體分別點在硝酸纖維膜上，作為檢測線和對照線試劑。7、試紙條的組裝和切割:按圖1所示，將背襯(I)和已點樣檢測線和對照線的硝酸纖維膜(2)、金標墊(3)、樣品墊(4)、吸水墊(5)粘在一起，并于CM4000切條機中，將其切成3mm寬的試紙條，于4°C干燥保存?zhèn)溆谩?、試紙條的特異性、敏感性分析:用試紙條分別檢測份BVDV (I型和2型)標準陽性血清樣品、其它相關(guān)病毒(CSFV、AKV、BRV、O型FMDV)陽性血清樣品及陰性對照樣品。結(jié)果表明試紙條檢測BVDV(1型和2型)標準陽性血清樣品時為陽性反應，與其它病毒陽性血清及陰性對照樣品時均為陰性。用試紙條檢測5份系列稀釋的BVDV陽性血清樣品，同時用進口 ELISA試劑盒作對照，結(jié)果顯示試紙條檢測5份樣品抗體滴度與ELISA檢測結(jié)果相當。9、試紙條與進口試劑盒檢測之間比對:用試紙條和進口 ELISA試劑盒同時檢測臨床血清樣品568份。根據(jù)檢測結(jié)果計算得出，試紙條特異性為99.24，敏感性為98.69%，試紙條和ELISA試劑盒檢測結(jié)果之間的符合率為98.94%。本發(fā)明的特點和優(yōu)點:本發(fā)明所制備的基因工程表達的截短的BVDV NS蛋白，具有與BVDV抗體特異性結(jié)合的活性，并且不與相關(guān)病毒陽性血清發(fā)生反應。表明基因工程表達的BVDV NS蛋白可以用于建立BVDV抗體免疫學檢測方法。利于基因工程表達的截短的BVDV NS蛋白和膠體金標記的SPG作為主要材料，建立BVDV抗體檢測試紙條，與國外進口 ELISA試劑盒相比，該試紙條具有良好的特異性和敏感性，兩種方法檢測結(jié)果符合率為98.69%。該試紙條具有檢測快速、操作簡便、不需要專門的儀器設(shè)備和專業(yè)技術(shù)人員。另外，該試紙條易于保存和運輸，使用檢測樣品量小，檢測成本較低，操作安全，不造成環(huán)境污染。因此該方法特別適用于BVDV抗體現(xiàn)場檢測、基層獸醫(yī)診斷部門臨床檢測和養(yǎng)殖企業(yè)自行檢測等。該試紙條的研制，為BVDV抗體檢測、BVD檢疫和BVD流行病學調(diào)查提供良好的工具。
四

圖1為牛病毒性腹瀉病毒抗體快速檢測試紙條結(jié)構(gòu)示意圖1:背襯，2:硝酸纖維素膜，3:金標復合物墊，4:樣品墊，5:吸水墊，6:檢測線，7:對照線。
五具體實施方式
:實施例1:截短的BVDVNS3蛋白的表達(I)BVDV NS蛋白抗原表位分析及目的蛋白的篩選:通過檢索BVDV NS蛋白序列(NP_776266)，利用在線軟件對其主要抗原表位進行分析，選擇抗原表位位于NS3蛋白中第165 425氨基酸作為目的蛋白片段，其序列為序列表中SEQ ID N0.1。其對應的核苷酸序列為GeneBank公布的BVDV基因組序列(NC_001461.1)中第4286 5068位核苷酸。(2)NS引物的設(shè)計:根據(jù)GeneBank公布的BVDV基因組序列(N0.NCOO1461.1)基因片段第4286 5068位核苷酸序列，設(shè)計了擴增BVDV NS3基因的特異性引物，在引物的5'端添加LIC粘性末端。引物序列如下:上游引物(Pl):5/ -CAGGGACCCGGT-CTGCCTACCTATGAATTGG-3'下游引物(P2):5/ -GGCACCAGAGCGTT-AGCACAAGCACAGTATCTG-3'(3) BVDV核酸提取:使用病毒RNA提取試劑盒(Invitrogen公司產(chǎn)品)從BVDVOregon株細胞培養(yǎng)上清中提出病毒RNA。(4)RT-PCR擴增BVDV NS基因:用一步法RT-PCR試劑盒(Takara公司產(chǎn)品)，從BVDVRNA中擴增目的基因片段。在PCR管中加入以下組分:IOxRT-PCR 緩沖液5pL
MgCl2 (25 mmol/L)ΙΟμ
dNTP (各 lOmmol/L)5μ
RNase 抑制劑(40U/pL)lμL
AMV 反轉(zhuǎn)錄酶(5U/pL)Ιμ
Taq (5υ/μ )Ιμ
Pl (20μηιο1/υΙμ
Ρ2 (20μιηο1/ω\μΙ
病毒RNA8μ
無RNA酶水17μ
總體積50μ 將上述組分混合后置于PCR儀中，進行擴增。反應程序為:45°C反轉(zhuǎn)錄30min ；95°C予頁變性 5min ;95°C lmin, 55°C Imin, 72°C lmin, 30 個循環(huán),72°C IOmin0 經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，PCR擴增產(chǎn)物約為783bp，用DNA快速回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物。將PCR產(chǎn)物送到TAKARA公司進行DNA序列測定,其序列為序列表中SEQ ID N0.2。(5)重組表達載體的構(gòu)建和鑒定:用T4DNA聚合酶對PCR產(chǎn)物進行處理，依靠T4DNA聚合酶外切酶活性，切去3丨端約11-12個堿基，即形成與LIC位點序列互補的粘性末端。反應體系如下:
PCR產(chǎn)物(純化)ΙΟμ
10ΧΤ4 DNA聚合酶緩沖液2μ
dATP (25mmol/L)2μL
DTT (10mmol/L)1μΙ>
Τ4 DNA 聚合酶(2.5 υ/μ )0.4μ
無DNA酶/RNA酶水4.6μ
總體積ΙΟμ 將上述反應物混合后，于22°C反應30min，然后于75°C反應20min。在1.5mL離心管中，加入線性PET52/LIC質(zhì)粒I μ L、經(jīng)T4DNA聚合酶處理的PCR產(chǎn)物2 μ L和25mmol/LEDTALy 1，混合后，于22°C反應5min。取上述反應物I μ L轉(zhuǎn)化NovaBlue E.coli感受態(tài)細胞(Invitrogen公司產(chǎn)品)，冰浴5min，42°C熱激30s，冰浴2min。加入250 μ L SOC液體培養(yǎng)基，37°C震蕩(250r/min)培養(yǎng)60min后，5，000r/min離心5min,棄去400 μ L上清，用加樣器吹打數(shù)次，重懸菌體后涂布含Ampicillin (50 μ g/mL)的LB平板上，37°C培養(yǎng)12h后，隨機挑取6個單菌落，分別接種至3mL含Ampicillin (50 μ g/mL)的LB培養(yǎng)液中，37°C震蕩培養(yǎng)過夜。取1.5mL培養(yǎng)物，用質(zhì)粒DNA提取試劑盒(TARAKA公司產(chǎn)品)提取質(zhì)粒DNA，用該DNA作為模板，進行PCR鑒定。PCR反應體系如下:IOXPCR 緩沖液2.5μ
Pl (20μιηο1/υΙμ
Ρ2 (20μιηο1/υΙμ
dNTP (2μιηο1/υ 質(zhì)粒DNAΙμ
Taq0.5pL
水18μ
總體積25pL反應程序為:95°C預變性 5min ;95°C lmin, 55 °C lmin, 72 °C lmin，30 個循環(huán)，72°C IOmin0 PCR反應結(jié)束后，取8 μ LPCR產(chǎn)物進行電泳分析。并將PCR產(chǎn)物送至TAKARA公司進行DNA序列測定?；蛐蛄袨樾蛄斜碇蠸EQ ID N0.2。(6)BVDV NS蛋白在原核細胞中的表達及鑒定:將上述經(jīng)鑒定含有DNA序列無突變的重組表達載體PET52-BVDV NS的菌株擴大培養(yǎng)后，用質(zhì)粒提取試劑盒(TARARA公司產(chǎn)品)提出質(zhì)粒DNA,并轉(zhuǎn)化(DE3)pLacI E.coli感受態(tài)細胞(Invitrogen公司產(chǎn)品)，涂于含Ampicillin (50 μ g/mL)的LB固體培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)12 16h，挑取6個單菌落，接種于5mL LB培養(yǎng)基，于37°C震蕩培養(yǎng)2h后，加入IPTG (終濃度為lmmol/L)進行誘導表達BVDVNS蛋白。收集上述菌液,5000r/min離心IOmin,取上清,加入原體積約1/10的PBS(pH7.2),用超聲波破碎儀對菌體進行破碎處理。經(jīng)SDS-PAGE分析，表達產(chǎn)物大小約為35KD。用牛抗BVDV陽性血清和HRP標記的兔抗牛IgG(SIGMA公司產(chǎn)品)進行Western blot分析，結(jié)果表明表達產(chǎn)物可以和BVDV陽性血清反應。用豬瘟病毒(CSFV)、赤羽病病毒(AKV)、邊界病病毒(BDV)、O型口蹄疫病毒(FMDV O)、藍舌病病毒(BTV)、小反芻獸疫病毒(PPRV)陽性血清進行Western blot分析時,結(jié)果表明表達產(chǎn)物不與其反應,表明該表達產(chǎn)物特異性良好。(7) BVDVNS蛋白的純化:使用6 XHis標簽融合蛋白純化試劑盒對表達BVDVNS表達產(chǎn)物進行純化，用核酸/蛋白分析儀檢測蛋白濃度，并用50mmol/LPBS(pH7.2)將其蛋白濃度調(diào)至lmg/mL。實施例2:膠體金標記試紙條的制備(I)膠體金的制備及膠體金標記SPG:采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金溶液。向99mL三蒸水中加入ImL I %氯金酸溶液,加熱至沸騰,迅速加入2.4mL新鮮配制的1.05%(m/v)檸檬酸三鈉溶液，并充分混勻，繼續(xù)加熱約5 lOmin，溶液顏色由藍色變?yōu)榧t色即可。冷卻至室溫后，用0.22 μ m濾膜過濾。首先用I %碳酸鈉溶液調(diào)膠體金溶液的pH值為
6.5。向50mL膠體金溶液中緩慢地加入20 μ L濃度為lmg/mL的SPG溶液，室溫攪拌30min，緩慢加入10%卵白蛋白(OVA)至其終濃度為10mg/mL，繼續(xù)攪拌30min。4，000r/min離心IOmin,將上清轉(zhuǎn)移至另一離心管中，12, 000r/min離心30min,小心棄去上清。用5mL(即1/10原體積)50mmol/L PBS(pH7.2)重懸沉淀。加入1% (w/v)的疊氮鈉(NaN3)溶液至終濃度為0.02%。(2)金標復合物墊的制備:用XYZ3050點樣平臺將膠體金標記的SPG溶液噴于300mmX 5mm玻璃纖維棉上，速度為50 μ L/cm,并于4°C真空抽干。(3)兔抗SPG多克隆抗體的制備及IgG純化:用SPG免疫2月齡家兔，每隔2周免疫I次，共免疫3次，注射劑量分別為Img/只、Img/只和2mg/只。首免時加等體積弗氏完全佐劑乳化，二免和三免時加等體積弗氏不完全佐劑乳化。三免后15d，頸靜脈采血并分離血清，56°C水浴作用30min。用蛋白A/G抗體純化試劑盒(Pierce公司產(chǎn)品)從兔血清中純化抗SPG IgG，用DU-800核酸/分析蛋白分析儀測定蛋白含量，用50mmol/L PBS (pH7.2)稀釋至1.5mg/mL。(4)檢測線和對照線的制備:首先將硝酸纖維素膜(35mm X 300mm)粘貼于背襯(70mmX 300mm)正中表面，用基因工程表達的BVDV NS蛋白(lmg/mL)和兔抗SPGIgGd.5mg/mL)分別作為檢測線和對照線試劑。將兩種試劑分別點在硝酸纖維膜上，點樣速度為0.75 μ L/cm。點樣時，檢測線位于硝酸纖維素膜中線，對照線與檢測線之間距離為5mm。371:干燥211，41:密封保存?zhèn)洹?5)試紙條的組裝和切割:按圖1所示，將背襯(I)和已點樣檢測線(6)和對照線(7)試劑的硝酸纖維膜(2)、金標墊(3)、樣品墊(4)、吸水墊(5)粘在一起，壓實后，于CM4000切條機中，將其切成3_寬的試紙條。(6)試紙條的反應原理、結(jié)果判定標準和檢測步驟:制備試紙條時，將膠體金標記的SPG固定于金標復合物墊上，檢測線為基因工程表達的BVDV NS蛋白，對照線為兔抗SPGIgG。檢測時，陽性樣品中的IgG與膠體金標記SPG結(jié)合，形成G-SPG-1gG復合物，在吸水墊的作用下，該復合物在硝酸纖維膜上向吸水墊端移動，若樣品中含有BVDV抗體，則BVDV抗體會與檢測線上的BVDV NS蛋白特異性結(jié)合，膠體金顆粒聚集于此，形成紅色的條帶，即檢測線。相反，若樣品中不含BVDV抗體，則G-SPG-1gG復合物不與檢測線試劑BVDV NS蛋白結(jié)合而繼續(xù)向吸水墊端移動，并與對照線試劑兔抗SPG結(jié)合，形成紅色條帶，即對照線。無論樣品中是否含有BVDV抗體，G-SPG-1gG復合物均能與對照線試劑結(jié)合，形成對照線。在判定結(jié)果時，若檢測線和對照線同時顯紅色，則為陽性，若檢測線不顯色，對照線顯紅色，則為陰性。若檢測線和對照線均不顯色或檢測線顯紅色且對照線不顯色，均為無效結(jié)果，需更換試紙條重新檢測。檢測時，將試紙條平放于實驗臺上，取100μ L用50mmol/LPBS(ph7.2)作10倍稀釋的樣品加于樣品墊上，室溫靜置反應，在15min內(nèi)進行結(jié)果判定。實施例3:試紙條的特異性、敏感性和符合率試驗(I)試紙條的特異性:用試紙條分別檢測份BVDV(I型和2型)標準陽性血清樣品、其它相關(guān)病毒包括豬瘟病毒(CSFV)、赤羽病病毒(AKV)、邊界病病毒(BDV)、0型口蹄疫病毒(FMDV O)、藍舌病病毒(BTV)、小反芻獸疫病毒(PPRV)陽性血清樣品及陰性對照樣品。結(jié)果顯示試紙條檢測BVDV(1型和2型)標準陽性血清樣品時為陽性反應，與其它病毒陽性血清及陰性對照樣品時均為陰性。表明試紙條特異性良好。(2)試紙條的敏感性:用試紙條檢測5份系列稀釋的BVDV陽性血清樣品(編號為I 5)，同時用進口 ELISA試劑盒作對照，結(jié)果顯示試紙條檢測5份樣品抗體滴度分別為 I: 512,1: 512,1: 256,1: 512 和 I: 512，ELISA 檢測極限為 I: 256,1: 512、
I: 512,1: 512和1: 512。表明試紙條與ELISA檢測敏感性相當。(3)試紙條與進口試劑盒檢測之間比對:用試紙條和進口 ELISA試劑盒同時檢測臨床血清樣品568份，結(jié)果如下表。根據(jù)檢測結(jié)果計算得出，與進口 ELISA試劑盒相比，試紙條特異性為99.24(261/263)，敏感性為98.69% (302/305)，試紙條和ELISA試劑盒檢測結(jié)果之間的符合率為98.94% [(301+261)/568]。詳細數(shù)據(jù)見表1:表1:臨床樣品檢測結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種用于牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)抗體檢測的快速檢測試紙條。其特征在于使用了截短的BVDV NS基因工程表達抗原作為檢測線試劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的，截短的NS片段是通過使用抗原表位分析軟件分析后選擇長度為261個氨基酸的片段，其氨基酸序列為序列表中SEQ ID N0.1。
3.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的，截短的BVDVNS抗原是通過對PCR擴增BVDV NS基因片段，該基因片段序列為序列表中SEQ ID N0.2，將擴增的基因片段插入pET52/LIC載體中，構(gòu)建pET52/LIC-BVDV NS重組表達載體，將載體轉(zhuǎn)化BL21大腸桿菌，進行表達所得到的重組蛋白抗原，該重組抗原可用于BVDV抗體檢測。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的截短的BVDVNS抗原，是根據(jù)其對應的核苷酸序列，設(shè)計特異性引物，并在引物的5'端分別加入LIC位點，其序列為序列表中SEQ ID N0.3和SEQ IDN0.4。
5.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的BVDV抗體檢測的快速檢測試紙條可以用于BVDV抗體的快速檢測。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)抗體檢測的重組抗原及其快速檢測試紙條。其主要針對于BVDV抗體檢測的截短的BVDV NS表達抗原和用于檢測BVDV抗體的快速檢測試紙條。利用抗原表位分析軟件，對BVDV NS蛋白氨基酸序列分析，取含有主要抗原表位的片段，根據(jù)其對應核苷酸序列設(shè)計引物，通過PCR擴增、重組表達載體構(gòu)建和原核表達，獲得了截短BVDV NS重組抗原，純化后可用于BVDV抗體檢測。基于截短的BVDVNS抗原建立的快速檢測試紙條，該試紙條具有操作方便、檢測快速，且不需專門實驗室和設(shè)備等優(yōu)點，克服了現(xiàn)有檢測方法的局限，可用于BVDV抗體的快速檢測和血清流行病學調(diào)查。
文檔編號G01N33/68GK103197082SQ20131013606
公開日2013年7月10日 申請日期2013年4月16日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月16日
發(fā)明者楊俊興, 花群義, 曹琛福, 張彩虹, 呂建強, 盧體康, 孫潔, 陳兵, 阮周曦, 秦智鋒, 劉建利, 胡運發(fā), 唐金明 申請人:深圳出入境檢驗檢疫局動植物檢驗檢疫技術(shù)中心