半胱氨酸蛋白酶抑制劑sn與糖類抗原19-9的聯(lián)合應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了半胱氨酸蛋白酶抑制劑SN（Cystatin?SN）與糖類抗原19-9（CA199）的聯(lián)合應(yīng)用，具體為Cystatin?SN與CA199在制備診斷和預(yù)示大腸癌或胰腺癌標(biāo)志物中的應(yīng)用，本發(fā)明還公開了大腸癌或胰腺癌標(biāo)志物的捕獲劑，并公開了含有該捕獲劑的試劑盒，本發(fā)明公開的試劑盒具有特異性好、靈敏度高等優(yōu)點，能夠用于大腸癌或胰腺癌的早期診斷，治療過程中的療效監(jiān)控以及治療后的轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)監(jiān)控。
【專利說明】半胱氨酸蛋白酶抑制劑SN與糖類抗原19-9的聯(lián)合應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)檢測領(lǐng)域，涉及半胱氨酸蛋白酶抑制劑SN (Cystatin SN)與糖類抗原19-9 (CA199)的聯(lián)合應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]近年來，由于生活水平提高，我國大腸癌發(fā)病率急劇上升，達到4.2%。我國大腸癌高發(fā)年齡普遍在50歲-60歲，比西方國家平均提早10歲。目前，大腸癌的診斷主要通過大便隱血實驗、血液CA199指標(biāo)、腸鏡篩查等，其中大便隱血實驗不易被民眾接受，其檢測篩選檢查率低于5%;而腸鏡篩查為侵入性，檢測痛苦，有出血、穿孔等風(fēng)險，發(fā)現(xiàn)問題進一步進行腸鏡檢查比例更低，低于3% ;血液CA199指標(biāo)準確度不高。通過早期發(fā)現(xiàn)大腸癌，然后進行早期干預(yù)大腸癌預(yù)后五年生存率高于90%。因此，如何更早期發(fā)現(xiàn)、及時干預(yù)，如何實現(xiàn)療效評估和監(jiān)測，如何對術(shù)后患者進行復(fù)發(fā)監(jiān)控，是診斷和監(jiān)控大腸癌亟待解決的問題。
[0003]胰腺癌是高致死率腫瘤之一，死亡率與發(fā)病率之比為0.99:1。1991-2000年全國疾病監(jiān)測點系統(tǒng)的資料顯示胰腺癌死亡率不斷上升，居惡性腫瘤的第7位。65-84歲年齡段者的死亡率是15-54歲年齡段的5倍，城市死亡率為農(nóng)村的2.42-4.68倍，東北和東部地區(qū)死亡率明顯高于其它地區(qū)。常規(guī)的確診手段為內(nèi)窺鏡逆行胰膽管造影(ERCP)、經(jīng)皮肝穿刺肝膽管造影(PTC)、超聲內(nèi)窺檢查(EUS)、胰管內(nèi)超聲、血管造影等，目前胰腺癌尚無高特異性、靈敏的檢測生物標(biāo)志物,用于胰腺癌的血清蛋白標(biāo)志物有CA19-9、CEA、CA50、CA242等，但這些標(biāo)志物常用于晚期胰腺癌輔助診斷、療效評估、轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)監(jiān)控等，用于早期預(yù)示胰腺癌普遍靈敏度不夠。因此，急需尋找一種高靈敏度的標(biāo)志物，為早期預(yù)示胰腺癌奠定基礎(chǔ)。
[0004]糖抗原(CA199)是一種含黏液成分的大分子糖蛋白，可表達于多種細胞包括腫瘤細胞表面。在判斷大腸癌患者臨床分期方面，CA199是比CEA更為敏感的指標(biāo)。CA199與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及浸潤深度相關(guān)，并可與其它指標(biāo)聯(lián)合應(yīng)用提示血源性復(fù)發(fā)。CA199是大腸癌患者獨立判斷預(yù)后的指標(biāo)，血清中高水平的CA199提示大腸癌患者生存期縮短，但是單獨使用CA199指標(biāo)準確度不高。半胱氨酸蛋白酶抑制劑SN (Cystatin SN)是人類Cystatin家族成員，由CSTl基因編碼的含141個氨基酸的蛋白質(zhì)，分子量為16.4Kda。Cystatin SN分子中含有兩個二硫鍵，為典型的分泌蛋白，分布于體液和分泌物中，如眼淚、唾液、血清、血漿等。據(jù)報道，早期結(jié)腸癌患者血清或尿液中Cystatin SN含量高于正常人，通過檢測Cystatin SN含量可用于結(jié)腸癌篩查。但是未見Cystatin SN與CA 199聯(lián)合應(yīng)用的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種半胱氨酸蛋白酶抑制劑SN (Cystatin SN)和糖類抗原19-9 (CA199)在制備診斷和預(yù)示大腸癌或胰腺癌標(biāo)志物中的應(yīng)用；本發(fā)明的目的之二在于提供大腸癌或胰腺癌標(biāo)志物的捕獲劑；本發(fā)明的目的之三在于提供含有上述捕獲劑的檢測試劑盒；本發(fā)明的目的之四在于提供試劑盒建立計算診斷和預(yù)示大腸癌或胰腺癌閾值的方法。
[0006]為達到上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案:
[0007]1.半胱氨酸蛋白酶抑制劑SN和糖類抗原19-9在制備診斷和預(yù)示大腸癌或胰腺癌標(biāo)志物中的應(yīng)用，所述半胱氨酸蛋白酶抑制劑SN的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示，所述糖類抗原19-9的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0008]優(yōu)選的，所述診斷和預(yù)示為診斷、療效評估或轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)監(jiān)控。
[0009]2.大腸癌或胰腺癌標(biāo)志物的捕獲劑，所述標(biāo)志物為半胱氨酸蛋白酶抑制劑SN和糖類抗原19-9，所述半胱氨酸蛋白酶抑制劑SN的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示，所述糖類抗原19-9的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0010]優(yōu)選的，所述捕獲劑為識別半胱氨酸蛋白酶抑制劑SN和糖類抗原19-9的特異性抗體。
[0011]3.含有權(quán)利要求3或4所述捕獲劑的試劑盒。
[0012]優(yōu)選的，所述試劑盒為檢測血清中半胱氨酸蛋白酶抑制劑SN和糖類抗原19-9濃度的試劑盒。
[0013]優(yōu)選的，所述試劑盒為酶聯(lián)免疫檢測試劑盒。
[0014]更優(yōu)選的，所述試劑盒含有包被有單克隆抗體的固相載體、生物素標(biāo)記的多克隆抗體和顯色底物。
[0015]更優(yōu)選的，所述單克隆抗體為鼠抗人Cystatin SN單克隆抗體，所述多克隆抗體為兔抗人Cystatin SN多克隆抗體，所述顯色底物為四甲基聯(lián)苯胺。
[0016]4.利用所述試劑盒建立計算診斷和預(yù)示大腸癌或胰腺癌閾值的方法，用所述試劑盒檢測半胱氨酸蛋白酶抑制劑SN和糖類抗原19-9濃度，利用P=exp(-6.119-0.053*a+0.509*b)/[1+exp (-6.119-0.053*a+0.509*b)]計算大腸癌閾值 P 或利用 P= [exp (-9.238+0.661*a+0.689*b) ]/[1+exp (-9.238+0.661*a+0.689*b)]計算胰腺癌閾值P，當(dāng)P大于或等于0.75時，為陽性；當(dāng)P小于0.75時，為陰性；
[0017]其中a代表Cystatin SN濃度,單位為pg/mL, b代表CA199濃度,單位為ng/mL
[0018]本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明公開了將Cystatin SN和CA199聯(lián)合用于制備診斷和預(yù)示大腸癌或胰腺癌的新標(biāo)志物，利用兩個標(biāo)志物共同檢測大腸癌和胰腺癌的靈敏度高和特異性高于單獨檢測其中一種標(biāo)志物；本發(fā)明還公開了檢測大腸癌或胰腺癌標(biāo)志物的捕獲齊?，將捕獲劑與常規(guī)試劑組合形成檢測試劑盒，形成的試劑盒具有使用方便，重復(fù)性好，便于攜帶等特點，可用于大腸癌或胰腺癌的早期診斷、療效評估或移轉(zhuǎn)復(fù)發(fā)監(jiān)控等，其檢測大腸癌的靈敏度為86.9%，特異性為93.6% ;檢測胰腺癌的靈敏度為80.2%，特異性為86.8%。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果更加清楚，本發(fā)明提供如下附圖:
[0020]圖1為Cystatin SN酶聯(lián)免疫檢測試劑盒檢測Cystatin SN蛋白的標(biāo)準曲線。
[0021]圖2為Cystatin SN-CA199聯(lián)合檢測試劑盒檢測大腸癌ROC曲線。
[0022]圖3為Cystatin SN-CA199聯(lián)合檢測試劑盒檢測胰腺癌ROC曲線。
【具體實施方式】[0023]下面將結(jié)合附圖，對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進行詳細的描述。
[0024]本發(fā)明使用的試劑如下:鼠抗人Cystatin SN單克隆抗體購自美國R&D公司(貨號為:MAB1285);兔抗人Cystatin SN多克隆抗體、Cystatin SN蛋白標(biāo)準品購自北京義翹神州生物技術(shù)有限公司；CA199-ELISA試劑盒購自MyBioSource公司(貨號為:MBS161209)。
[0025]實施例1建立Cystatin SN血清檢測反應(yīng)體系及其優(yōu)化
[0026]用濃度為5 μ g/mL鼠抗人Cystatin SN單克隆抗體包被ELISA板,于4°C條件下包被過夜，洗板；然后在質(zhì)量分數(shù)為2%的BSA中室溫封閉2小時,洗板；將濃度分別為Opg/mL, 50pg/mL, 100pg/mL, 200pg/mL, 400pg/mL, 800pg/mL, 1600pg/mL 的 Cystatin SN 蛋白標(biāo)準品(編碼Cystatin SN蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示)和血清樣品加入封閉板中，于37°C反應(yīng)I小時，洗板；然后用濃度為0.5 μ g/mL HRP標(biāo)記的兔抗人Cystatin SN多克隆抗體，在37°C條件下反應(yīng)I小時，洗板；再與四甲基聯(lián)苯胺(TMB)反應(yīng)2-3分鐘，最后用濃度為2M的硫酸終止反應(yīng)，并于450nm條件下檢測OD值(圖1)。由圖1可知，CystatinSN酶聯(lián)免疫檢測試劑盒線性范圍為50pg/mL-1600pg/mL，在線性范圍內(nèi)標(biāo)準品線性相關(guān)系數(shù)r≥0.990，回收率在90%~110%范圍內(nèi)。
[0027]檢測體系優(yōu)化，比對分別由美國R&D，英國Abcam和美國NOVUS B10L0GICALS3個不同公司生產(chǎn)的Cystatin SN單克隆抗體、美國R&D公司和北京義翹神州生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的Cystatin SN蛋白標(biāo)準品和美國R&D,英國Abcam和北京義翅神州生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的Cystatin SN多克隆抗體。結(jié)果表明，Cystatin SN單克隆抗體優(yōu)選R&D公司提供的產(chǎn)品，最佳工作濃度為5 μ g/mL ；Cystatin SN蛋白標(biāo)準品和Cystatin SN多克隆抗體優(yōu)選北京義翹神州生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，最佳工作濃度為0.5μ g/mL，在最佳條件下，可實現(xiàn)背景OD值< 0.1，能夠有效區(qū)分陰性組與陽性組，且具有統(tǒng)計學(xué)意義。
[0028]固相載體的確定:對美國Corning、德國Greiner、美國Thermo和丹麥Nunc4個不同廠家生產(chǎn)的酶標(biāo)板進行了比較。結(jié)果顯示，美國corning公司(貨號為:9018)和thermo(貨號為:468667)公司的酶標(biāo)板符合背景OD值< 0.1，且信噪比較高。
[0029]包被液的選擇:根據(jù)抗體包被于固相載體所需要的緩沖體系，ELISA常用包被液為緩沖鹽溶液，分別用磷酸鹽緩沖液(PH7.5)和碳酸鹽緩沖液(pH9.6)檢測包被環(huán)境對反應(yīng)體系的影響，結(jié)果顯示碳酸鹽緩沖液(PH9.6)可滿足空白組OD值< 0.1，有效區(qū)分空白組、陰性組和陽性組，信噪比較高。
[0030]稀釋劑的選擇:通過實驗對比了 2種商品化稀釋劑(分別購自天津博美科生物技術(shù)有限公司(貨號BMKF017-1)和上海西唐生物科技有限公司(貨號C0901))和自制稀釋劑的稀釋效果，主要從保護蛋白能力，自身穩(wěn)定性兩方面評價稀釋劑的稀釋效果。結(jié)果顯示自制稀釋劑的效果最佳，自制稀釋劑各組分的濃度如下:3mM EDTA、質(zhì)量分數(shù)為0.5%的BSA、1XPBS、質(zhì)量分數(shù)為0.05%的Tween-20和質(zhì)量分數(shù)為0.02%的硫柳汞(pH6.0)。
[0031]穩(wěn)定劑的選擇:使用3種穩(wěn)定劑(3種穩(wěn)定劑具體如下:穩(wěn)定劑1:質(zhì)量分數(shù)為3%的蔗糖，體積分數(shù)為8%的甘油和質(zhì)量分數(shù)為1.3%的NaCl ;穩(wěn)定劑I1:質(zhì)量分數(shù)為3%的蔗糖，體積分數(shù)為8%的甘油，質(zhì)量分數(shù)為0.1%的EDTA和質(zhì)量分數(shù)為1.3%的NaCl，穩(wěn)定劑III:體積分數(shù)為68.8%的PBS，體積分數(shù)為30%的胎牛血清和質(zhì)量分數(shù)為0.2%的硫柳汞)分別稀釋單克隆抗體、蛋白標(biāo)準品和多克隆抗體至濃度為0.5mg/mL、0.16ng/mL和50 μ g/mL,使用時按體積比為1:100稀釋。并于第O天、第7天和第14天進行檢測，結(jié)果顯示穩(wěn)定劑III效果最佳，其組分為:體積分數(shù)為68.8%的PBS、體積分數(shù)為30%的胎牛血清、質(zhì)量分數(shù)為0.2%的硫柳萊。
[0032]通過以上研究確定了檢測體系的主要組分，并建立Cystatin SN血清檢測試劑盒。
[0033]實施例2Cystatin SN血清檢測試劑盒
[0034]根據(jù)實施例1中建立Cystatin SN血清檢測體系構(gòu)建Cystatin SN酶聯(lián)免疫檢測檢測試劑盒，具體組分如表1所示:
[0035]表1.Cystatin SN酶聯(lián)免疫檢測試劑盒組分
[0036]
【權(quán)利要求】
1.半胱氨酸蛋白酶抑制劑SN和糖類抗原19-9在制備診斷和預(yù)示大腸癌或胰腺癌標(biāo)志物中的應(yīng)用，所述半胱氨酸蛋白酶抑制劑SN的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示，所述糖類抗原19-9的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于:所述診斷和預(yù)示為診斷、療效評估或轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)監(jiān)控。
3.大腸癌或胰腺癌標(biāo)志物的捕獲劑，其特征在于:所述標(biāo)志物為半胱氨酸蛋白酶抑制劑SN和糖類抗原19-9，所述半胱氨酸蛋白酶抑制劑SN的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示，所述糖類抗原19-9的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的捕獲劑，其特征在于:所述捕獲劑為識別半胱氨酸蛋白酶抑制劑SN和糖類抗原19-9的特異性抗體。
5.含有權(quán)利要求3或4所述捕獲劑的試劑盒。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于:所述試劑盒為檢測血清中半胱氨酸蛋白酶抑制劑SN和糖類抗原19-9濃度的試劑盒。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于:所述試劑盒為酶聯(lián)免疫檢測試劑盒。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于:所述試劑盒含有包被有單克隆抗體的固相載體、生物素標(biāo)記的多克隆抗體和顯色底物。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所 述的試劑盒,其特征在于:所述單克隆抗體為鼠抗人CystatinSN單克隆抗體，所述多克隆抗體為兔抗人Cystatin SN多克隆抗體，所述顯色底物為四甲基聯(lián)苯胺。
10.利用權(quán)利要求5-9任一項所述試劑盒建立計算診斷和預(yù)示大腸癌或胰腺癌閾值的方法，其特征在于:用所述試劑盒檢測半胱氨酸蛋白酶抑制劑SN和糖類抗原19-9濃度，利用 P=exp (-6.119-0.053*a+0.509*b) /[1+exp (-6.119-0.053*a+0.509*b)]計算大腸癌閾值 P 或利用 P= [exp (-9.238+0.661*a+0.689*b)]/[1+exp (-9.238+0.661*a+0.689*b)]計算胰腺癌閾值P，當(dāng)P大于或等于0.75時，為陽性；當(dāng)P小于0.75時，為陰性； 其中a代表半胱氨酸蛋白酶抑制劑SN濃度，單位為pg/mL，b代表糖類抗原19_9濃度，單位為ng/mL。
【文檔編號】G01N33/68GK103901206SQ201310165176
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2013年5月7日 優(yōu)先權(quán)日:2013年5月7日
【發(fā)明者】王弢, 秦勇, 吳婷婷 申請人:上海良潤生物醫(yī)藥科技有限公司