一種藻紅蛋白純度的計(jì)算方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種藻紅蛋白純度的計(jì)算方法。屬于熒光蛋白純度表達(dá)方法及計(jì)算【技術(shù)領(lǐng)域】。其特征在于包括下述步驟：1)從海洋紅藻中分離提取出藻紅蛋白，2)用紫外-可見(jiàn)光光度計(jì)，從280-800nm全程掃描，掃描步長(zhǎng)1.0-5.0nm，獲得藻紅蛋白溶液的吸收光譜圖，3)按照附圖1所示，分別計(jì)算出由藻紅蛋白溶液的吸光值與橫坐標(biāo)數(shù)軸在280-800nm波長(zhǎng)掃描區(qū)間所圍包的A區(qū)域面積，B區(qū)域面積和C區(qū)域面積，4)由于B區(qū)域面積是藻紅蛋白典型特有的吸收光譜圖，而A區(qū)域面積C區(qū)域面積代表了其它雜蛋白的吸收光譜圖。因此藻紅蛋白的純度P(％)可以方便、準(zhǔn)確地表達(dá)為P(％)＝100*B區(qū)域面積/(A區(qū)域面積+B區(qū)域面積+C區(qū)域面積).本發(fā)明專利所述的藻紅蛋白純度的計(jì)算方法具有簡(jiǎn)易方便性，較高準(zhǔn)確性，適用于獲得不同的藻紅蛋白純化樣品的純度值以及比較評(píng)估不同的藻紅蛋白純化產(chǎn)品的優(yōu)劣性。
【專利說(shuō)明】 一種藻紅蛋白純度的計(jì)算方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種藻紅蛋白純度的計(jì)算方法。屬于熒光蛋白純度表達(dá)方法及計(jì)算【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002]某些海洋藻類的細(xì)胞體中，除了含有植物常見(jiàn)的葉綠素a外，還含有一類特殊的水溶性輔助采光色素，稱為藻膽蛋白(Phycobiliprotein),主要包括藻紅蛋白(Phycoerythrin, PE)，藻藍(lán)蛋白(Phycocyanin, PC),藻紅藍(lán)蛋白(PhycoerythrocyaninPEC)和別藻藍(lán)蛋白(Allo-phycocyanin, APC)。藻膽蛋白不僅是藻細(xì)胞體內(nèi)重要的光合作用色素蛋白，而且具有具有多方面的功能作用和廣泛的應(yīng)用價(jià)值。在藻膽蛋白中，藻紅蛋白是藻膽蛋白中最重要的熒光蛋白，具有無(wú)毒性、摩爾消光系數(shù)大、熒光量子產(chǎn)率高、斯托克位移大、紅橙色特征熒光、背景光干擾小、不易淬滅、性質(zhì)穩(wěn)定可較長(zhǎng)期保存等特點(diǎn)，是一種熒光特異性強(qiáng)的標(biāo)記物。因此，藻紅蛋白在臨床醫(yī)學(xué)診斷、免疫化學(xué)及生物工程等研究領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。具有強(qiáng)熒光性的藻紅蛋白分子可與特異的抗體或其它的生物分子發(fā)生結(jié)合作用，當(dāng)這種結(jié)合態(tài)抗體附到細(xì)胞或組織的特異受體位點(diǎn)時(shí)，很容易通過(guò)它們發(fā)出的特異性熒光而進(jìn)行跟蹤觀察，可作為效果良好的熒光示蹤物，而且這種結(jié)合態(tài)物對(duì)生物體本身無(wú)任何毒性副作用和損害，具有很好的適用安全性。最近的研究表明，藻紅蛋白可作為有效的光敏劑，用于治療腫瘤、癌癥等。已有許多報(bào)道指出，藻紅蛋白能有效清除體內(nèi)的各種有害自由基，提高機(jī)體免疫力，具有抗輻射、抗衰老、抗腫瘤作用，其樣品市場(chǎng)大，是目前極有發(fā)展?jié)摿Φ慕】当＝∑贰Ａ硗?，藻紅蛋白也可作為添加劑，可廣泛應(yīng)用于各類食品和化妝品行業(yè)，具有增強(qiáng)食品美麗色彩或養(yǎng)顏?zhàn)o(hù)膚的功效。根據(jù)全球生物化學(xué)樣品最大的供應(yīng)商Sigma公司的標(biāo)價(jià)，高純度的藻紅蛋白目前的市場(chǎng)售價(jià)已達(dá)200-800美元/毫克不等，而某些生物蛋白分子與藻紅蛋白結(jié)合物的現(xiàn)成品的售價(jià)更高。
[0003]從海洋紅藻中分離提取藻紅蛋白，由于涉及的藻源材料不同，或者由于采用的分離提取、純化方法和技術(shù)存在差異性，因而必然存在所獲得的藻紅蛋白純度會(huì)有很大的差別。因?yàn)樵寮t蛋白的純度是涉及到藻紅蛋白的熒光性能，是一個(gè)非常重要的理化指標(biāo)值，直接關(guān)系到所分離提取藻紅蛋白在質(zhì)量上的優(yōu)劣性。至目前為止，傳統(tǒng)上表達(dá)和計(jì)算分離提取的藻紅蛋白純度采用的是測(cè)定出藻紅蛋白在在280nm、565nm和625nm波長(zhǎng)的吸光值，用A565A280的比值和A625A565的比值表示分離提取的藻紅蛋白純度。但這種表達(dá)和計(jì)算藻紅蛋白純度的方法只是一種很粗略的藻紅蛋白純度計(jì)算值，因?yàn)閮H僅是用3個(gè)單一波長(zhǎng)上的吸光值表達(dá)藻紅蛋白純度。為了能更全面、合理、準(zhǔn)確地反映出分離提取的藻紅蛋白純度，需要建立一種更好的表達(dá)和計(jì)算藻紅蛋白純度的方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題就是針對(duì)上面所述的【背景技術(shù)】，采用準(zhǔn)確、適宜的計(jì)算方法，獲得藻紅蛋白樣品的純度值P(% )，根據(jù)計(jì)算的純度值大小，可以方便、準(zhǔn)確地比較分離提取的不同藻紅蛋白樣品在純度方面的差異性。
[0005]本發(fā)明采用的技術(shù)方案及技術(shù)特征:
[0006]取從海洋紅藻中分離純化的藻紅蛋白樣品溶液4毫升，用紫外-可見(jiàn)光光度計(jì)，從280-800nm全程掃描，掃描步長(zhǎng)1.0-5.0nm，獲得藻紅蛋白溶液的吸收光譜圖，見(jiàn)附圖1所示。如附圖1所示，分別計(jì)算出由藻紅蛋白溶液的吸光值與橫坐標(biāo)數(shù)軸在280-800nm波長(zhǎng)掃描區(qū)間所圍包的A區(qū)域面積，B區(qū)域面積和C區(qū)域面積。a分點(diǎn)是藻紅蛋白溶液在280nm波長(zhǎng)光的吸收值，b分點(diǎn)是藻紅蛋白溶液在剛開(kāi)始出現(xiàn)其典型的吸收譜時(shí)的吸收值，c分點(diǎn)是藻紅蛋白溶液在結(jié)束出現(xiàn)其典型的吸收譜時(shí)的吸收值。藻紅蛋白溶液經(jīng)紫外-可見(jiàn)光光度計(jì)掃描得到的吸收值轉(zhuǎn)入到Excel界面后，實(shí)施各區(qū)域面積的計(jì)算。其具體的相應(yīng)面積的含義和計(jì)算操作過(guò)程如下:
[0007]A區(qū)域面積的含義和計(jì)算:A區(qū)域面積是指從a分點(diǎn)至b分點(diǎn)，藻紅蛋白溶液的吸光值與橫坐標(biāo)圍成的面積。A區(qū)域面積實(shí)際上代表了分離提取的藻紅蛋白溶液中，小分子雜質(zhì)蛋白及其他一些雜質(zhì)分子的光吸收譜所形成。其面積的計(jì)算方法是:以掃描藻紅蛋白溶液時(shí)，每相鄰兩個(gè)步長(zhǎng)下(步長(zhǎng)為1.0-5.0nm)獲得的吸光值作為計(jì)算該A區(qū)域每個(gè)微小塊梯形面積的上底和下底，而兩個(gè)相鄰步長(zhǎng)就是計(jì)算每個(gè)微小塊梯形面積時(shí)的高。計(jì)算出A區(qū)域中所有的微小塊梯形面積，計(jì)算A區(qū)域中所有的微小塊梯形面積相加的總和值。
[0008]B域面積的含義和計(jì)算:B區(qū)域面積是指從b分點(diǎn)至c分點(diǎn)，藻紅蛋白溶液的吸光值與橫坐標(biāo)圍成的面積。B域面積實(shí)際上就是代表了典型、特有的藻紅蛋白吸收光譜所形成。其面積的計(jì)算方法是:以掃描藻紅蛋白溶液時(shí)，每相鄰兩個(gè)步長(zhǎng)下(步長(zhǎng)為1.0-5.0nm)獲得的吸光值作為計(jì)算該B區(qū)域每個(gè)微小塊梯形面積的上底和下底，而兩個(gè)相鄰步長(zhǎng)就是計(jì)算每個(gè)微小塊梯形面積時(shí)的高。計(jì)算出B區(qū)域中所有的微小塊梯形面積，計(jì)算A區(qū)域中所有的微小塊梯形面積相加的總和值。
[0009]C區(qū)域面積的含義和計(jì)算:C區(qū)域面積是指從c分點(diǎn)至800nm波長(zhǎng),藻紅蛋白溶液的吸光值與橫坐標(biāo)圍成的面積。C區(qū)域面積實(shí)際上代表了分離提取的藻紅蛋白溶液中，可能存在的其他藻膽蛋白(例如藻藍(lán)蛋白)吸收光譜所形成。其面積的計(jì)算方法是:以掃描藻紅蛋白溶液時(shí)，每相鄰兩個(gè)步長(zhǎng)下(步長(zhǎng)為1.0-5.0nm)獲得的吸光值作為計(jì)算該C區(qū)域每個(gè)微小塊梯形面積的上底和下底，而兩個(gè)相鄰步長(zhǎng)就是計(jì)算每個(gè)微小塊梯形面積時(shí)的高。計(jì)算出C區(qū)域中所有的微小塊梯形面積，計(jì)算C區(qū)域中所有的微小塊梯形面積相加的總和值。
[0010]獲得上述3個(gè)區(qū)域面積的數(shù)值后，接著用公式計(jì)算分離提取的藻紅蛋白溶液的純度P(% ) = 100*B區(qū)域面積/(A區(qū)域面積+B區(qū)域面積+C區(qū)域面積)。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0011]圖1為本發(fā)明藻紅蛋白的掃描光譜圖，以及計(jì)算藻紅蛋白純度時(shí)，藻紅蛋白的掃描光譜所呈現(xiàn)的不同物質(zhì)占有的面積域的確定。即A區(qū)域面積的確定:從a分點(diǎn)至b分點(diǎn)，藻紅蛋白溶液的吸光值與橫坐標(biāo)圍成的面積，代表了分離提取的藻紅蛋白中，小分子雜質(zhì)蛋白及其他一些雜質(zhì)分子的光吸收譜所形成。B區(qū)域面積的確定:從b分點(diǎn)至c分點(diǎn)，藻紅蛋白溶液的吸光值與橫坐標(biāo)圍成的面積，代表了典型、特有的藻紅蛋白吸收光譜。C區(qū)域面積的確定:從c分點(diǎn)至SOOnm波長(zhǎng)，藻紅蛋白溶液的吸光值與橫坐標(biāo)圍成的面積，代表了分離提取的藻紅蛋白中，可能存在的其他藻膽蛋白(例如藻藍(lán)蛋白)吸收光譜所形成。
[0012]【具體實(shí)施方式】及實(shí)施例證
[0013]下面結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。下述實(shí)施例是說(shuō)明性的，不是限定性的，不能以下述實(shí)施例來(lái)限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明提出的計(jì)算方法，同樣可適用于其他藻膽蛋白，例如藻藍(lán)蛋白，別藻藍(lán)蛋白的純度計(jì)算。
[0014]具體實(shí)施例證1:
[0015]取從海洋紅藻中分離純化的藻紅蛋白樣品I溶液4毫升，用紫外可見(jiàn)光光度計(jì)，從280-800nm全程掃描，掃描步長(zhǎng)l.0nm，獲得樣品I藻紅蛋白溶液的吸收光譜圖，測(cè)得該樣品純化液在280nm、565nm和625nm波長(zhǎng)的吸光值分別為0.6915，1.5884，0.5366 ;純度比值A(chǔ)565A280為2.2970，純度比值A(chǔ)625A565為0.3378。根據(jù)本發(fā)明的計(jì)算方法，吸收光譜圖計(jì)算的A區(qū)域面積為51.81，B區(qū)域面積為146.22，C區(qū)域面積為12.43，計(jì)算出的該樣品藻紅蛋白純度為69.47%。
[0016]具體實(shí)施例證2:
[0017]取從海洋紅藻中分離純化的藻紅蛋白樣品2溶液4毫升，用紫外可見(jiàn)光光度計(jì)，從280-800nm全程掃描，掃描步長(zhǎng)5.0nm，獲得樣品I藻紅蛋白溶液的吸收光譜圖，測(cè)得該樣品純化液在280nm、565nm和625nm波長(zhǎng)的吸光值分別為0.2333，0.3508，0.0555 ;純度比值A(chǔ)565A280為1.5036，純度比值A(chǔ)625A565為0.1582。根據(jù)本發(fā)明的計(jì)算方法，吸收光譜圖計(jì)算的A區(qū)域面積為20.29，B區(qū)域面積為36.58，C區(qū)域面積為4.23，計(jì)算出的該樣品藻紅蛋白純度為59.86%。
[0018]具體實(shí)施例證3:
[0019]取從海洋紅藻中分離純化的藻紅蛋白樣品3溶液4毫升，用紫外可見(jiàn)光光度計(jì)，從280-800nm全程掃描，掃描步長(zhǎng)l.0nm，獲得樣品I藻紅蛋白溶液的吸收光譜圖，測(cè)得該樣品純化液在280nm、565nm和625nm波長(zhǎng)的吸光值分別為0.1265，0.2781，0.0147 ;純度比值A(chǔ)565A280為2.1984，純度比值A(chǔ)625A565為0.0529。根據(jù)本發(fā)明的計(jì)算方法，吸收光譜圖計(jì)算的A區(qū)域面積為9.626，B區(qū)域面積為27.19，C區(qū)域面積為0.97，計(jì)算出的該樣品藻紅蛋白純度為71.96%。
[0020]具體實(shí)施例證4:
[0021]取從海洋紅藻中分離純化的藻紅蛋白樣品4溶液4毫升，用紫外可見(jiàn)光光度計(jì)，從280-800nm全程掃描，掃描步長(zhǎng)l.0nm，獲得樣品I藻紅蛋白溶液的吸收光譜圖，測(cè)得該樣品純化液在280nm、565nm和625nm波長(zhǎng)的吸光值分別為0.0796，0.2337，0.0005 ;純度比值A(chǔ)565A280為2.9359，純度比值A(chǔ)625A565為0.0021。根據(jù)本發(fā)明的計(jì)算方法，吸收光譜圖計(jì)算的A區(qū)域面積為5.495，B區(qū)域面積為19.21，C區(qū)域面積為0.01，計(jì)算出的該樣品藻紅蛋白純度為77.82%。
[0022]具體實(shí)施例證5:
[0023]取從海洋紅藻中分離純化的藻紅蛋白樣品5溶液4毫升，用紫外可見(jiàn)光光度計(jì)，從280-800nm全程掃描，掃描步長(zhǎng)l.0nm，獲得樣品I藻紅蛋白溶液的吸收光譜圖，測(cè)得該樣品純化液在280nm、565nm和625nm波長(zhǎng)的吸光值分別為0.3107，1.4598，0.0195 ;純度比值A(chǔ)565A280為4.6984，純度比值A(chǔ)625A565為0.0134。根據(jù)本發(fā)明的計(jì)算方法，吸收光譜圖計(jì)算的A區(qū)域面積為23.59，B區(qū)域面積為119.75，C區(qū)域面積為0.6965，計(jì)算出的該樣品藻紅蛋白純度為83.14%。
[0024]具本實(shí)施例證6:
[0025]取從海洋紅藻中分離純化的藻紅蛋白樣品6溶液4毫升，用紫外可見(jiàn)光光度計(jì)，從280-800nm全程掃描，掃描步長(zhǎng)5.0nm，獲得樣品I藻紅蛋白溶液的吸收光譜圖，測(cè)得該樣品純化液在280nm、565nm和625nm波長(zhǎng)的吸光值分別為0.1483，0.8348，0.0046 ;純度比值A(chǔ)565A280為5.6291，純度比值A(chǔ)625A565為0.0055。根據(jù)本發(fā)明的計(jì)算方法，吸收光譜圖計(jì)算的A區(qū)域面積為10.06, B區(qū)域面積為67.41，C區(qū)域面積為0.055，計(jì)算出的該樣品藻紅蛋白純度為86.95%。
[0026]具體實(shí)施例證7:
[0027]取從海洋紅藻中分離純化的藻紅蛋白樣品7溶液4毫升，用紫外可見(jiàn)光光度計(jì)，從280-800nm全程掃描，掃描步長(zhǎng)l.0nm，獲得樣品I藻紅蛋白溶液的吸收光譜圖，測(cè)得該樣品純化液在280nm、565nm和625nm波長(zhǎng)的吸光值分別為0.2928，1.4943，0.0098 ;純度比值A(chǔ)565A280為5.1035，純度比值A(chǔ)625A565為0.0066。根據(jù)本發(fā)明的計(jì)算方法，吸收光譜圖計(jì)算的A區(qū)域面積為20.13，B區(qū)域面積為117.76，C區(qū)域面積為0.5902，計(jì)算出的該樣品藻紅蛋白純度為85.03%。
[0028]從以上的實(shí)施例證的計(jì)算結(jié)果清楚地表明，按照本發(fā)明專利提出的計(jì)算方法，可獲得不同純化樣品的藻紅蛋白純度值信息情況，B區(qū)域面積越大，A區(qū)域面積和C區(qū)域面積越小，所獲得的藻紅蛋白樣品的純度越高，這樣的產(chǎn)品質(zhì)量就越好。上述純度計(jì)算結(jié)果表明樣品6操紅蛋白的純度最聞，達(dá)到86.95% ;而樣品2操紅蛋白的純度最低,僅為59.86% ；其他樣品藻紅蛋白的純度值介于最高和最低值之間。因而，采用本發(fā)明專利提出的方法，可以方便、準(zhǔn)確地計(jì)算出樣品藻紅蛋白的純度值，并可根據(jù)不同樣品的純度值情況，評(píng)價(jià)藻紅蛋白產(chǎn)品質(zhì)量的優(yōu)劣性。
【權(quán)利要求】
1.一種藻紅蛋白純度的計(jì)算方法，其特征在于:從海洋紅藻中分離提取出藻紅蛋白，用紫外-可見(jiàn)光光度計(jì)，從280-800nm全程掃描，掃描步長(zhǎng)1.0-5.0nm，獲得藻紅蛋白溶液的吸收光譜圖.根據(jù)獲得的吸收光譜圖，從a分點(diǎn)(280nm)開(kāi)始至800nm，將吸收光譜與橫坐標(biāo)所圍包的區(qū)域面積分成3個(gè)區(qū)域面積，即分成A區(qū)域面積，B區(qū)域面積和C區(qū)域面積.其中A區(qū)域面積是指從a分點(diǎn)起至剛開(kāi)始出現(xiàn)典型藻紅蛋白吸收譜的b分點(diǎn)，吸收譜與橫坐標(biāo)所圍包的區(qū)域面積，此區(qū)域面積代表了分離提取的藻紅蛋白中，小分子雜質(zhì)蛋白及其他一些雜質(zhì)分子的光吸收譜所形成。B區(qū)域面積是指從剛開(kāi)始出現(xiàn)典型藻紅蛋白吸收譜的b分點(diǎn)至典型藻紅蛋白吸收譜的結(jié)束點(diǎn)c分點(diǎn)，吸收譜與橫坐標(biāo)所圍包的區(qū)域面積，此區(qū)域面積代表了典型、特有的藻紅蛋白吸收光譜所形成。C區(qū)域面積是指從c分點(diǎn)起至800nm，吸收譜與橫坐標(biāo)所圍包的區(qū)域面積，此區(qū)域面積代表了分離提取的藻紅蛋白中，可能存在的其他藻膽蛋白(例如藻藍(lán)蛋白)吸收譜所形成。以每相鄰兩個(gè)步長(zhǎng)下獲得的吸光值作為計(jì)算各個(gè)區(qū)域每個(gè)微小塊梯形面積的上底和下底，步長(zhǎng)為計(jì)算每個(gè)微小塊梯形面積時(shí)的高?？偤透鱾€(gè)區(qū)域中所有的微小塊梯形面積，分別獲得A區(qū)域面積、B區(qū)域面積和C區(qū)域面積。藻紅蛋白的純度P(%)的計(jì)算表達(dá)為P(%) = 100*B區(qū)域面積/(A區(qū)域面積+B區(qū)域面積+C區(qū)域面積)。
【文檔編號(hào)】G01N21/31GK104165846SQ201310194791
【公開(kāi)日】2014年11月26日 申請(qǐng)日期:2013年5月15日 優(yōu)先權(quán)日:2013年5月15日
【發(fā)明者】林汝榕, 邢炳鵬, 蔡文旋, 柯秀蓉, 張稚蘭 申請(qǐng)人:國(guó)家海洋局第三海洋研究所