一種精確區(qū)分細(xì)胞周期的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種精確區(qū)分細(xì)胞周期的方法。本發(fā)明人根據(jù)細(xì)胞周期細(xì)胞核內(nèi)DNA、RNA的變化規(guī)律以及有絲分裂期細(xì)胞核內(nèi)蛋白磷酸化的特點，通過多參數(shù)同時定位細(xì)胞，運(yùn)用流式細(xì)胞儀對其進(jìn)行熒光檢測，有效地將細(xì)胞周期準(zhǔn)確分為GO、Gl、S、G2、M五個群體。本發(fā)明首次揭示了一種精密區(qū)分細(xì)胞周期的方法、方法簡單易行，解決了現(xiàn)有方法不能將細(xì)胞周期精確區(qū)分得不足，結(jié)果穩(wěn)定可靠，適用于各種細(xì)胞的檢測。
【專利說明】-種精確區(qū)分細(xì)胞周期的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，更具體地，本發(fā)明涉及一種精確區(qū)分細(xì)胞周期的分析 方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 細(xì)胞周期是指以有絲分裂方式增殖的細(xì)胞從親代分裂結(jié)束到子細(xì)胞分裂結(jié)束所 經(jīng)歷的過程，在這個過程中，細(xì)胞遺傳物質(zhì)復(fù)制并加倍，且在分裂結(jié)束時平均分配到兩個子 細(xì)胞中去。通常細(xì)胞周期由G0期、G1期、S期、G2期和Μ期組成，如圖1。細(xì)胞在G0期處 于阻留靜止的狀態(tài)；G1期：細(xì)胞開始RNA和蛋白質(zhì)的合成，但DNA含量仍保持二倍體；S期： DNA開始合成，這時細(xì)胞核內(nèi)DNA的含量介于G1期和G2期之間，當(dāng)DNA復(fù)制結(jié)束成為4倍 體時，細(xì)胞進(jìn)入G2期。G2期的細(xì)胞繼續(xù)合成RNA及蛋白質(zhì)，直到進(jìn)入有絲分裂期（M期）， 細(xì)胞內(nèi)遺傳物質(zhì)平均分配到兩個子細(xì)胞中，并使細(xì)胞一分為二。這兩個子細(xì)胞或者重新開 始下一個細(xì)胞周期，或者進(jìn)入靜止期（G0期）。細(xì)胞周期是調(diào)控細(xì)胞正常生長、分裂的重要 事件。細(xì)胞周期的研究有助于揭示抗腫瘤制劑的作用機(jī)制。在腫瘤細(xì)胞增殖中，細(xì)胞周期 的調(diào)控失效，使細(xì)胞無限分裂；反之，若細(xì)胞周期調(diào)控正常則可迫使細(xì)胞從活躍的生長分裂 期進(jìn)入靜止的G0期。使用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期的變化已非常普遍。流式細(xì)胞儀（Flow Cytometer)是通過光源照射高速流動狀態(tài)下的細(xì)胞，檢測其標(biāo)記熒光染料后受激發(fā)射熒光 的強(qiáng)度，從而獲得細(xì)胞大小、內(nèi)部結(jié)構(gòu)、組成特性等物理和生物學(xué)特征，具有檢測速度快、分 析參數(shù)多、獲取信息量大、靈敏度高、準(zhǔn)確性好、方法靈活等優(yōu)點。傳統(tǒng)流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞 周期的方法是對細(xì)胞內(nèi)的脫氧核糖核酸（DNA)進(jìn)行分析、用核酸染料標(biāo)記DNA，通過流式細(xì) 胞儀所檢測到的DNA含量直方圖可將細(xì)胞周期分為G0/G1期、S期、G2/M期三個細(xì)胞群體。 該方法基于細(xì)胞周期DNA含量變化，因為G0、G1期DNA含量相同為二倍體、G2、M期DNA含量 相同為四倍體，只能粗略地把細(xì)胞周期合并為G0/G1、S、G2/M三個細(xì)胞群體，計算其比例， 如圖2。
[0003] 綜上，本領(lǐng)域目前缺乏能將細(xì)胞周期區(qū)分得更為準(zhǔn)確詳細(xì)，實現(xiàn)G0期與G1期分 開，G2和Μ期分開的技術(shù)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種精確區(qū)分細(xì)胞周期的方法。
[0005] 在本發(fā)明的第一方面，提供一種精確測定細(xì)胞周期的方法，所述方法包括：
[0006] (1)以DNA染料、RNA染料、熒光標(biāo)記的有絲分裂磷蛋白（ΜΡΜ-2)抗體（較佳地為 單克隆抗體）對細(xì)胞進(jìn)行染色，所述的DNA染料、RNA染料和熒光標(biāo)記具有不同的發(fā)射波長； DNA染料熒光用于區(qū)分細(xì)胞核染色體的倍型，RNA染料熒光用于區(qū)分細(xì)胞中RNA的量，ΜΡΜ-2 的熒光標(biāo)記用于區(qū)分細(xì)胞是否處于分裂期；
[0007] (2)用具有三通道或三通道以上的流式細(xì)胞儀對染色后樣品進(jìn)行檢測分析根據(jù)細(xì) 胞中DNA染料、RNA染料、熒光標(biāo)記的發(fā)射波長，在流式細(xì)胞儀激光束的激發(fā)下產(chǎn)生不同的 熒光，熒光可被光學(xué)系統(tǒng)收集后轉(zhuǎn)化為電信號進(jìn)而輸送到計算機(jī)進(jìn)行運(yùn)算分析，根據(jù)流式 細(xì)胞結(jié)果圖，將細(xì)胞分為5個群體，分別為GO期、G1期、S期、G2期和Μ期；
[0008] 較佳地，5個細(xì)胞群體中，細(xì)胞DNA量、RNA和量ΜΡΜ-2表達(dá)量差異在于：若DNA含量 為二倍體（2Ν)且RNA表達(dá)量低于整體細(xì)胞RNA量，即圈定Hochest33342標(biāo)記的二倍體細(xì)胞 群中PyroninY突光強(qiáng)度低于整體細(xì)胞平均突光強(qiáng)度（mean fluorescence intensity, MFI) 的群體，為GO期細(xì)胞群；若DNA含量為二倍體（2N)且RNA表達(dá)量開始升高，即圈定 Hochest33342標(biāo)記的二倍體細(xì)胞群中PyroninY熒光強(qiáng)度等于整體細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度的 群體，為G1期細(xì)胞群；若DNA含量為四倍體（4N)且MPM-2不表達(dá)，即圈定Hochest33342標(biāo) 記的四倍體細(xì)胞群中MPM-2熒光陰性的群體，為G2期細(xì)胞群；若DNA含量為四倍體（4N)且 MPM-2開始表達(dá)，即圈定Hochest33342標(biāo)記的四倍體細(xì)胞群中MPM-2熒光陽性的群體，為Μ 期細(xì)胞群；若DNA含量介于二倍體與四倍體之間，圈定Hochest33342標(biāo)記的二倍體與四倍 體之間細(xì)胞群為S期細(xì)胞群。
[0009] 在一個優(yōu)選例中，所述的DNA染料是：Hochest33342 ;和/或
[0010] 所述的RNA染料是：Pyronin Y ;和/或
[0011] 所述的有絲分裂磷蛋白抗體的熒光標(biāo)記包括：Cy5、Cy3、FITC、羅丹明、PE、PerCP、 APC、PE-Cy7。
[0012] 在另一優(yōu)選例中，所述的方法中，用多聚甲醛（較佳地，終濃度為0. 5% (w/v))的磷 酸鹽溶液對細(xì)胞進(jìn)行固定。
[0013] 在另一優(yōu)選例中，所述的方法中，DNA染料熒光通道采集數(shù)據(jù)設(shè)定為線性模式，RNA 染料熒光通道采集數(shù)據(jù)設(shè)定為線性模式，有絲分裂磷蛋白抗體熒光標(biāo)記通道采集數(shù)據(jù)設(shè)定 為對數(shù)模式。
[0014] 在另一優(yōu)選例中，所述的方法中，細(xì)胞獲取速度保持低速，優(yōu)選的< 500events/s， 更佳的 200_500events/s。
[0015] 在另一優(yōu)選例中，所述的Hochest33342的激發(fā)光波長為355nm，發(fā)射光波長為 460nm ;或
[0016] 所述的Pyronin Y的激發(fā)光波長為488nm，發(fā)射光波長為560nm ;
[0017] 所述的有絲分裂磷蛋白熒光標(biāo)記是Cy5,其激發(fā)光波長為633nm，發(fā)射光波長為 668nm〇
[0018] 在另一優(yōu)選例中，所述方法的步驟為：
[0019] (1)將細(xì)胞進(jìn)行固定；
[0020] (2)洗滌細(xì)胞并重懸，形成單個細(xì)胞懸液；
[0021] ⑶離心，向細(xì)胞沉淀中加入冷的無水甲醇混勻，低溫過夜；
[0022] (4)按照步驟（2)所述方法用染色洗滌液洗滌；
[0023] (5)用熒光標(biāo)記的有絲分裂磷蛋白抗體（較佳地濃度0. 5mg/ml)對細(xì)胞染色；
[0024] (6)按照步驟（2)所述方法用染色緩沖液洗滌；
[0025] (7)重懸細(xì)胞，以 Hochest33342 和 Pyronin Y 染色；
[0026] (8)流式細(xì)胞儀檢測，計算細(xì)胞分別處于每個期的比例；其中H〇CheSt33342激發(fā) 發(fā)射采用355/460nm，Pyronin Y激發(fā)發(fā)射488/560nm，有絲分裂磷蛋白抗體的激發(fā)發(fā)射通 道根據(jù)突光標(biāo)記種類來選擇，其激發(fā)發(fā)射波長不同于Hochest33342和Pyronin Y。
[0027] 在另一優(yōu)選例中，所述方法的步驟為：
[0028] (1)固定：取約1X107個的細(xì)胞，加入新鮮配制的固定液，終濃度為0. 5%(w/v)， 37°C二氧化碳培養(yǎng)箱孵育10分鐘；
[0029] (2)洗滌：把步驟（1)所得的細(xì)胞用離心機(jī)在400g轉(zhuǎn)速5分鐘的條件下，離心洗 滌去上清，用冷的磷酸鹽緩沖液lml重懸細(xì)胞，劇烈混勻成單個細(xì)胞；
[0030] (3)通透：將步驟⑵中的所得細(xì)胞重懸液400g離心去上清，向細(xì)胞沉淀中加入 冷的無水甲醇lml ;-邊加入一邊混勻，-20°C過夜；
[0031] (4)按照步驟（2)所述方法用染色洗滌液洗滌2遍；
[0032] (5)染色：取2X106個細(xì)胞，加入100ul染色洗滌液，其中含有0. 2ul核磷蛋白染 料偶聯(lián)熒光素的有絲分裂磷蛋白抗體（濃度〇. 5mg/ml)，37°C孵育lh ;
[0033] (6)按照步驟（2)所述方法用染色緩沖液洗滌2遍；
[0034] (7)細(xì)胞用500ul HBSS重懸，加入核酸染料Hochest33342,終濃度為2ug/ml ;以 及加入Pyronin Y，終濃度為2ug/ml ;37°C 20分鐘；
[0035] (8)流式細(xì)胞儀檢測，計算細(xì)胞分別處于每個期的比例；其中H〇CheSt33342激發(fā) 發(fā)射采用355/460nm，Pyronin Y激發(fā)發(fā)射488/560nm，有絲分裂磷蛋白抗體的激發(fā)發(fā)射通 道根據(jù)突光素來選擇，注意避開Hochest33342、Pyronin Y這兩個通道即可。
[0036] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種試劑盒，所述試劑盒用于精確測定細(xì)胞周期，其中 含有：DNA染料、RNA染料、熒光標(biāo)記的有絲分裂磷蛋白抗體。
[0037] 在一個優(yōu)選例中，其中還含有選自以下的一種或多種試劑：細(xì)胞固定液，洗滌液， 細(xì)胞通透試劑，洗滌液，Hanks'平衡鹽溶液
[0038] 本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見 的。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0039] 圖1、細(xì)胞周期模式圖。
[0040] 圖2、傳統(tǒng)方法核酸染料PI單染的流式直方圖，只能將細(xì)胞周期模糊區(qū)分為G0/ Gl、S、G2/M 期。
[0041] 圖3、三參數(shù)同時染DNA和RNA核磷蛋白的新方法，把細(xì)胞精確分為GO、G1、S、G2、 Μ期。
[0042] 3A、DNA含量與RNA含量的二維散點圖，可把G0、G1期分開；
[0043] 3B、DNA含量與MPM-2表達(dá)的二維散點圖，可把G2、M期分開；
[0044] 3C、細(xì)胞周期DNA表達(dá)含量的直方圖，S期DNA表達(dá)處于二倍體和四倍體之間。
[0045] 圖4、精確區(qū)分Jurkat T細(xì)胞60、61、3、62、厘期，并計算每個期的細(xì)胞比例。
[0046] 圖4A、精確區(qū)分Jurkat T細(xì)胞GO、G1期群并分別計算細(xì)胞GO、G1期比例。
[0047] 圖4B、精確區(qū)分Jurkat T細(xì)胞G2、Μ期并分別計算細(xì)胞G2、Μ期比例。
[0048] 圖4C、計算Jurkat Τ細(xì)胞S期比例。
[0049] 圖5、精確區(qū)分7721細(xì)胞GO、Gl、S、G2、Μ期，并計算每個期的細(xì)胞比例。
[0050] 圖5Α、精確區(qū)分7721細(xì)胞GO、G1期細(xì)胞群并分別計算細(xì)胞GO、G1期比例。
[0051] 圖5B、精確區(qū)分7721細(xì)胞G2、Μ期細(xì)胞群并分別計算7721細(xì)胞G2、Μ期比例。
[0052] 圖5C、計算7721細(xì)胞S期比例。

【具體實施方式】
[0053] 本發(fā)明人經(jīng)過深入的研究，根據(jù)細(xì)胞分裂周期的一般性原理，同時結(jié)合細(xì)胞中RNA 生成以及有絲分裂期細(xì)胞核內(nèi)蛋白發(fā)生磷酸化的特點，首次揭示了一種精密區(qū)分細(xì)胞周期 的方法。同時，本發(fā)明人深入研究后，選擇到了多種熒光染料和抗體標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)的DNA、RNA 以及有絲分裂核磷蛋白，通過觀察這些熒光染料在細(xì)胞內(nèi)的染色情況（熒光信號），可準(zhǔn)確 地獲得細(xì)胞內(nèi)DNA、RNA以及有絲分裂期核磷蛋白的量，從而根據(jù)它們的量精確地區(qū)分細(xì)胞 周期。所述方法簡單易行，可獲得穩(wěn)定可靠的結(jié)果，適用于各種細(xì)胞的檢測。
[0054] 本發(fā)明首次將這三種染料同時使用，把細(xì)胞周期精確分為GO、Gl、S、G2、Μ期五個 群體。具體地，所述方法包括：（1)以DNA染料、RNA染料、熒光標(biāo)記的有絲分裂核磷蛋白抗 體（MPM-2)對細(xì)胞進(jìn)行染色，所述的DNA染料、RNA染料和熒光標(biāo)記產(chǎn)生的熒光信號是不同 的（即激發(fā)/發(fā)射光譜顯著不同）；(2)根據(jù)細(xì)胞中DNA染料、RNA染料、熒光標(biāo)記的信號 強(qiáng)度，獲得細(xì)胞DNA、RNA和MPM-2表達(dá)量；若DNA含量為二倍體（2N)且RNA表達(dá)量低于整 體細(xì)胞RNA量，即圈定Hoch est33342標(biāo)記的二倍體細(xì)胞群中PyroninY熒光強(qiáng)度低于整體 細(xì)胞的平均突光強(qiáng)度（mean fluorescence intensity, MFI)群體，為G0期細(xì)胞群；若DNA 含量為二倍體（2N)且RNA表達(dá)量開始升高，即圈定Hochest33342標(biāo)記的二倍體細(xì)胞群中 PyroninY熒光強(qiáng)度等于整體細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度的群體，為G1期細(xì)胞群；若DNA含量為四 倍體（4N)且MPM-2不表達(dá)，即圈定Hochest33342標(biāo)記的四倍體細(xì)胞群中MPM-2熒光陰性的 群體，為G2期細(xì)胞群；若DNA含量為四倍體（4N)且MPM-2開始表達(dá)，即圈定Hoch est33342 標(biāo)記的四倍體細(xì)胞群中MPM-2熒光陽性的群體，為Μ期細(xì)胞群；若DNA含量介于二倍體與四 倍體之間，圈定Hoch est33342標(biāo)記的二倍體與四倍體之間細(xì)胞群為S期細(xì)胞群。
[0055] 如本發(fā)明所用，所述的"DNA染料"是指可以標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)的DNA的染色標(biāo)記物；以 所述的DNA染料處理細(xì)胞后，可通過染料所呈現(xiàn)的信號強(qiáng)度來得知細(xì)胞內(nèi)的總DNA量。
[0056] 如本發(fā)明所用，所述的"RNA染料"是指可以標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)的RNA的染色標(biāo)記物；以 所述的RNA染料處理細(xì)胞后，可通過染料所呈現(xiàn)的信號強(qiáng)度來得知細(xì)胞內(nèi)的總RNA量。
[0057] 作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的DNA染料是H〇CheSt33342,所述的RNA染料是 Pyronin Y。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，這兩種染料的組合應(yīng)用，檢測結(jié)果清楚、區(qū)分度非常理想。
[0058] 任何可觀察熒光標(biāo)記和/或染色標(biāo)記的儀器及方法都可應(yīng)用于本發(fā)明，只要其能 夠識別本發(fā)明所述的多種染料或熒光標(biāo)記，并能夠確定染料或熒光標(biāo)記的量。作為本發(fā)明 的優(yōu)選方式，借助流式細(xì)胞儀多通道同時采集信號的特點來實現(xiàn)方便的檢測區(qū)分。此外，激 光共聚焦顯微鏡等儀器也是可應(yīng)用的。
[0059] 作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，為了能將細(xì)胞周期區(qū)分得更為準(zhǔn)確詳細(xì)，實現(xiàn)G0期與G1 期分開，G2和Μ期分開，本發(fā)明的方法采用三種染料分別為DNA染料Hoch est33342、RNA染 料Pyronin Y、核磷蛋白MPM-2抗體偶聯(lián)熒光素，共同將細(xì)胞周期區(qū)分GO、Gl、S、G2、Μ期這 5個群體。在Hochest33342結(jié)合DNA的條件下，Pyronin Υ可以作為RNA的特異性染料，由 于G1期RNA表達(dá)量開始升高，而DNA仍然保持二倍體的狀態(tài)，據(jù)此區(qū)分GO、G1期。細(xì)胞進(jìn) 入有絲分裂期后，大量蛋白直接或間接被Μ期促進(jìn)因子（MPF)磷酸化，MPM-2抗體結(jié)合到發(fā) 生磷酸化的氨基酸抗原表位（如LTPLK和FTPLQ多肽區(qū)），ΜΡΜ-2用來作為有絲分裂期（Μ 期）的標(biāo)志物，據(jù)此區(qū)分G2、Μ期。
[0060] 用于ΜΡΜ-2抗體標(biāo)記的熒光標(biāo)記沒有特別的限制，只要其能夠與DNA染料與RNA 染料實現(xiàn)顯著區(qū)分即可。例如所述的熒光標(biāo)記可以是（但不限于）<75、073、？11'(：、羅丹 明、PE、PerCP 等等。
[0061] 作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的Hochest33342的激發(fā)光波長為355nm，發(fā)射光波 長為460nm ;或所述的Pyronin Y的激發(fā)光波長為488nm，發(fā)射光波長為560nm ;所述的熒光 標(biāo)記是Cy5,其激發(fā)光波長為633nm，發(fā)射光波長為668nm。
[0062] 本發(fā)明還提供了一種用于對外源基因進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)示蹤的試劑盒，所述試劑盒中含 有：DNA染料、RNA染料、熒光標(biāo)記的MPM-2抗體。
[0063] 任何其它對于細(xì)胞染色有用的試劑都可包含在所述的試劑盒中，其它對于細(xì)胞的 培養(yǎng)有用的試劑或培養(yǎng)基也可包含在所述的試劑盒中。例如，所述的試劑盒中還含有選自 以下的一種或多種試劑：細(xì)胞固定液（如含多聚甲醛的磷酸鹽溶液），洗滌液，細(xì)胞通透試 劑（如無水甲醇），洗滌液，Hanks'平衡鹽溶液。
[0064] 作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的試劑盒中還含有使用說明書。
[0065] 本發(fā)明利用細(xì)胞周期中DNA、RNA含量變化和分裂期核蛋白磷酸化等的表達(dá)規(guī)律， 用實驗滿足了細(xì)胞周期分為GO、Gl、S、G2、Μ期五部分的理論要求，克服了單一參數(shù)對細(xì)胞 周期定位模糊性的缺陷。目前國內(nèi)外專門用于精確區(qū)分細(xì)胞周期的方法較少，本發(fā)明的方 法填補(bǔ)了這方面的空白，為科研工作者研究細(xì)胞生長發(fā)育、開發(fā)腫瘤細(xì)胞周期抑制藥物提 供了便捷的工具。
[0066] 下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條 件如J.薩姆布魯克等編著，分子克隆實驗指南，第三版，科學(xué)出版社，2002中所述的條件， 或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計算。
[0067] 試劑
[0068] 本發(fā)明所涉及的試劑，包括以下組成：
[0069] 1) 0· 01Μ磷酸鹽緩沖液（PBS)
[0070] 8g NaCl、0. 2g KC1、1. 44g Na2HP04 和 0· 24g ΚΗ2Ρ04,溶于 800ml 蒸餾水中，用 HC1 調(diào)節(jié)溶液的pH值至7. 4,最后加蒸餾水定容至1L即可。
[0071] 2)Hanks' 平衡鹽溶液（HBSS)
[0072] HBSS10X 儲備液：40g NaC12. 0g，KC10. 5g，Na2HP040. 5g，NaHC03 定容至 500ml ;
[0073] Trisl. 0M 儲備液：Tris 堿 8. 0g，Tris-HC168. 5g，定容至 500ml，pH 值為 7. 3 ;
[0074] 制備 100ml HBSS :
[0075] HBSS10X 儲備液：10ml ;
[0076] 去離子水： 80ml ;
[0077] Tris 1. 0M 2. 75ml ；
[0078] CaCl2 1. 1M 170ul ；
[0079] MgS040 . 4M 200ul ；
[0080] 葡萄糖 220mg ;
[0081] 調(diào)節(jié)pH至7. 4,定容至100ml。
[0082] 3)染色洗滌液
[0083] 含 4% (w/v) BSA 的 PBS 溶液。
[0084] 4)固定液
[0085] 4%(w/v)多聚甲醛的磷酸鹽溶液。
[0086] 5)抗體
[0087] 突光素（Cy5)標(biāo)記的單克隆小鼠抗人MPM-2抗體（Anti-phospho-Ser/Thr-Pro, MPM-2)，濃度為 0· 5mg/ml。
[0088] 方法
[0089] (1)固定：取約IX 107個的細(xì)胞，加入新鮮配制的固定液（多聚甲醛的磷酸鹽溶 液），終濃度為〇. 5% (w/v)，37°C二氧化碳培養(yǎng)箱孵育10分鐘；
[0090] (2)洗滌：把步驟（1)所得的細(xì)胞用離心機(jī)在400g轉(zhuǎn)速5分鐘的條件下，離心洗 滌去上清，用冷的磷酸鹽緩沖液lml重懸細(xì)胞，劇烈混勻成單個細(xì)胞；
[0091] (3)通透：將步驟（2)中的所得細(xì)胞重懸液400g離心去上清，向細(xì)胞沉淀中加入 冷的無水甲醇lml ;-邊加入一邊混勻，-20°C過夜；
[0092] (4)按照步驟（2)所述方法用染色洗滌液洗滌2遍；
[0093] (5)染色：取2X106個細(xì)胞，加入100ul染色洗滌液，其中含有0. 2ul核磷蛋白染 料偶聯(lián)熒光素的MPM-2抗體（濃度0. 5mg/ml)，37°C孵育lh ;
[0094] (6)按照步驟（2)所述方法用染色緩沖液洗滌2遍；
[0095] (7)細(xì)胞用500ul HBSS重懸，加入核酸染料Hochest33342,終濃度為2ug/ml ;以 及加入Pyronin Y，終濃度為2ug/ml ;37°C 20分鐘；
[0096] (8)流式細(xì)胞儀檢測，計算細(xì)胞分別處于每個期的比例；其中h〇cheSt33342激發(fā) 發(fā)射采用355/460nm，Pyronin Y激發(fā)發(fā)射488/560nm，MPM-2的激發(fā)發(fā)射通道根據(jù)熒光素來 選擇，注意避開hochest33342、Pyronin Y這兩個通道即可。
[0097] 本方法所需流式細(xì)胞儀需要具備3個通道，儀器需要配有紫外激光，如汞燈。流式 細(xì)胞儀器設(shè)置：Pyronin Y通道采集數(shù)據(jù)設(shè)定為線性模式，Hochest33342通道采集數(shù)據(jù)設(shè) 定為線性模式，MPM-2通道采集數(shù)據(jù)設(shè)定為對數(shù)模式，細(xì)胞獲取速度保持低速（低于500)。 [0098] 實施例1、懸浮細(xì)胞的細(xì)胞周期精確區(qū)分
[0099] 以人急性T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞（Jurkat T)的分析為例，本發(fā)明所述的運(yùn)用流式 細(xì)胞儀的可精確定位細(xì)胞周期的試劑盒的方法，包括以下步驟：
[0100] 1)固定：取約1X107個的細(xì)胞，加入新鮮配置的固定液，終濃度為〇. 5%(w/v)， 37°C二氧化碳培養(yǎng)箱孵育15分鐘；
[0101] 2)洗滌：把步驟1)所得的細(xì)胞用離心機(jī)在400g轉(zhuǎn)速5分鐘的條件下，離心洗滌 去上清，用冷的磷酸鹽緩沖液lml重懸細(xì)胞，混勻成單個細(xì)胞；
[0102] 3)通透：將步驟（2)中的所得細(xì)胞重懸液400g離心去上清，向細(xì)胞沉淀中加入冷 的無水甲醇lml ;-邊加入一邊混勻，-20°C過夜；
[0103] 4)按照步驟2)所述方法用染色洗滌液洗滌2遍；
[0104] 5)染色：取1X106個細(xì)胞，加入100ul染色洗滌液含有0. 2ul偶聯(lián)熒光素的MPM-2 抗體（濃度 mg/ml)，37°C lh ;
[0105] 6)按照步驟2)所述方法用染色緩沖液洗滌2遍；
[0106] 7)細(xì)胞用500ul HBSS重懸，加入核酸染料Hochest33342,終濃度為2ug/ml， Pyronin Y 終濃度為 2ug/ml，37°C 20 分鐘；
[0107] 8)流式細(xì)胞儀檢測，計算細(xì)胞分別處于每個期的比例；本實驗所用流式細(xì)胞儀 型號為Beckman Coulter Moflo XDP，設(shè)置：Pyronin Y用FL2,采集數(shù)據(jù)為線性模式； Hochest33342通道為FL11，采集數(shù)據(jù)設(shè)定為線性模式；MPM-2通道用FL6,采集數(shù)據(jù)設(shè)定為 對數(shù)模式。細(xì)胞獲取速度控制在200-500events/s。
[0108] 采用上述實施例精確區(qū)分Jurkat T細(xì)胞60、61、5、62^期的方法，獲得的流式細(xì) 胞圖如圖4。其中，圖4A為精確區(qū)分Jurkat T細(xì)胞GO、G1期群并分別計算細(xì)胞GO、G1期 比例。圖4B采用上述實施例精確區(qū)分Jurkat T細(xì)胞G2、Μ期并分別計算細(xì)胞G2、Μ期比 例。圖4C采用上述實施例計算Jurkat Τ細(xì)胞S期比例。
[0109] 實施例2、貼壁細(xì)胞的細(xì)胞周期精確區(qū)分
[0110] 以人肝癌細(xì)胞系（SMMG-7721)的分析為例，本發(fā)明所述的運(yùn)用流式細(xì)胞儀的可精 確定位細(xì)胞周期的試劑盒的方法，包括以下步驟：
[0111] 1)固定：細(xì)胞加胰酶37°c 5分鐘消化成單個懸浮細(xì)胞，取約IX 107個的細(xì)胞，力口 入新鮮配置的固定液，終濃度為〇. 5%(w/v)，37°C二氧化碳培養(yǎng)箱孵育15分鐘；
[0112] 2)洗滌：把步驟1)所得的細(xì)胞用離心機(jī)在400g轉(zhuǎn)速5分鐘的條件下，離心洗滌 去上清，用冷的磷酸鹽緩沖液重懸細(xì)胞，混勻成單個細(xì)胞；
[0113] 3)通透：將步驟（2)中的所得細(xì)胞重懸液400g離心去上清，向細(xì)胞沉淀中加入冷 的無水甲醇lml ;-邊加入一邊混勻，-20°C過夜；
[0114] 4)按照步驟2)所述方法用染色洗滌液洗滌2遍；
[0115] 5)染色：取3X106個細(xì)胞，加入100ul染色洗滌液含有0. 2ul偶聯(lián)熒光素的MPM-2 抗體（0.5mg/ml)，37°C孵育 lh;
[0116] 6)按照步驟2)所述方法用染色緩沖液洗滌2遍；
[0117] 7)細(xì)胞用500ul HBSS重懸，加入核酸染料Hochest33342,終濃度為2ug/ml， Pyronin Y終濃度為2ug/ml，37°C孵育20分鐘；
[0118] 8)流式細(xì)胞儀檢測，計算細(xì)胞分別處于每個期的比例；本實驗所用流式細(xì)胞儀 型號為Beckman Coulter Moflo XDP，設(shè)置：Pyronin Y用FL2,采集數(shù)據(jù)為線性模式； Hochest33342通道為FL11，采集數(shù)據(jù)設(shè)定為線性模式；MPM-2通道用FL6,采集數(shù)據(jù)設(shè)定為 對數(shù)模式。細(xì)胞獲取速度控制在200-500events/s。
[0119] 采用上述實施例精確區(qū)分7721細(xì)胞G0、G1、S、G2、M期的方法，結(jié)果如圖5。其中， 圖5A采用上述實施例精確區(qū)分7721細(xì)胞GO、G1期細(xì)胞群并分別計算細(xì)胞GO、G1期比例。 本實施例中MPM-2的熒光標(biāo)簽（熒光素）為Cy5。圖5B采用上述實施例精確區(qū)分7721細(xì) 胞G2、Μ期細(xì)胞群并分別計算7721細(xì)胞G2、Μ期比例。圖5C采用上述實施例計算7721細(xì) 胞S期比例。
[0120] 在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨 引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可 以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范 圍。
【權(quán)利要求】
1. 一種利用流式細(xì)胞儀精確測定細(xì)胞周期的方法，其特征在于，所述方法包括步驟： (1) 以DNA染料、RNA染料、熒光標(biāo)記的有絲分裂磷蛋白抗體對細(xì)胞進(jìn)行染色，所述的 DNA染料、RNA染料和熒光標(biāo)記具有不同的發(fā)射波長； (2) 用具有三通道或三通道以上的流式細(xì)胞儀對染色后樣品進(jìn)行檢測分析；根據(jù)流式 細(xì)胞結(jié)果圖將細(xì)胞分為5個群體，分別為GO期、G1期、S期、G2期和Μ期。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的DNA染料是：Hochest33342 ;和/或 所述的RNA染料是：Pyronin Y ;和/或 所述的有絲分裂磷蛋白抗體的熒光標(biāo)記包括：Cy5、Cy3、FITC、羅丹明、PE、PerCP、APC、 PE-Cy7。
3. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，包括步驟：用多聚甲醛的磷酸鹽溶液對細(xì)胞 進(jìn)行固定。
4. 如權(quán)利要求1-3任一項所述的方法，其特征在于，DNA染料熒光通道采集數(shù)據(jù)設(shè)定為 線性模式，RNA染料熒光通道采集數(shù)據(jù)設(shè)定為線性模式，有絲分裂磷蛋白抗體熒光標(biāo)記通道 采集數(shù)據(jù)設(shè)定為對數(shù)模式。
5. 如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，細(xì)胞獲取速度保持低速，優(yōu)選的 < 500events/s，更佳的 200_500events/s。
6. 如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述的Hochest33342的激發(fā)光波長為 355nm，發(fā)射光波長為460nm ;或 所述的Pyronin Y的激發(fā)光波長為488nm，發(fā)射光波長為560nm ; 所述的有絲分裂磷蛋白突光標(biāo)記是Cy5,其激發(fā)光波長為633nm，發(fā)射光波長為668nm。
7. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法的步驟為： (1) 將細(xì)胞進(jìn)行固定； (2) 洗滌細(xì)胞并重懸，形成單個細(xì)胞懸液； (3) 離心，向細(xì)胞沉淀中加入冷的無水甲醇混勻，低溫過夜； (4) 按照步驟（2)所述方法用染色洗滌液洗滌； (5) 用熒光標(biāo)記的有絲分裂磷蛋白抗體對細(xì)胞染色； (6) 按照步驟（2)所述方法用染色緩沖液洗滌； (7) 重懸細(xì)胞，以 Hochest33342 和 Pyronin Y 染色； (8) 流式細(xì)胞儀檢測，計算細(xì)胞分別處于每個期的比例；其中H〇CheSt33342激發(fā)發(fā)射 采用355/460nm，Pyronin Y激發(fā)發(fā)射488/560nm，有絲分裂磷蛋白抗體的激發(fā)發(fā)射通道根 據(jù)突光標(biāo)記種類來選擇，其激發(fā)發(fā)射波長不同于Hochest33342和Pyronin Y。
8. 如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法的步驟為： (1) 固定：取約1X107個的細(xì)胞，加入新鮮配制的固定液，終濃度為〇. 5%(w/v)，37°C二 氧化碳培養(yǎng)箱孵育10分鐘； (2) 洗滌：把步驟（1)所得的細(xì)胞用離心機(jī)在400g轉(zhuǎn)速5分鐘的條件下，離心洗滌去 上清，用冷的磷酸鹽緩沖液lml重懸細(xì)胞，劇烈混勻成單個細(xì)胞； (3) 通透：將步驟（2)中的所得細(xì)胞重懸液400g離心去上清，向細(xì)胞沉淀中加入冷的 無水甲醇lml ;-邊加入一邊混勻，-20°C過夜； (4) 按照步驟（2)所述方法用染色洗滌液洗滌2遍； (5) 染色：取2 X 106個細(xì)胞，加入lOOul染色洗滌液，其中含有0. 2ul核磷蛋白染料偶 聯(lián)熒光素的有絲分裂磷蛋白抗體，37°C孵育lh ; (6) 按照步驟（2)所述方法用染色緩沖液洗滌2遍； (7) 細(xì)胞用500ul HBSS重懸，加入核酸染料Hochest33342,終濃度為2ug/ml ;以及加 入 Pyronin Y，終濃度為 2ug/ml ;37°C 20 分鐘； (8) 流式細(xì)胞儀檢測，計算細(xì)胞分別處于每個期的比例；其中H〇CheSt33342激發(fā)發(fā)射 采用355/460nm，Pyronin Y激發(fā)發(fā)射488/560nm，有絲分裂磷蛋白抗體的激發(fā)發(fā)射通道根 據(jù)突光素來選擇，注意避開此〇1168丨33342、？5^〇11；[11￥這兩個通道即可。
9. 一種試劑盒，其特征在于，所述試劑盒用于精確測定細(xì)胞周期，其中含有：DNA染料、 RNA染料、熒光標(biāo)記的有絲分裂磷蛋白抗體。
10. 如權(quán)利要求9所述的試劑盒，其特征在于，其中還含有選自以下的一種或多種試 齊? :細(xì)胞固定液，洗滌液，細(xì)胞通透試劑，洗滌液，Hanks'平衡鹽溶液。
【文檔編號】G01N15/14GK104215561SQ201310208041
【公開日】2014年12月17日 申請日期:2013年5月29日 優(yōu)先權(quán)日:2013年5月29日
【發(fā)明者】邱琳, 陳 峰 申請人:中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院