一種傅立葉紅外法測(cè)定微藻生物大分子含量的方法
【專利摘要】發(fā)明涉及一種傅立葉紅外法測(cè)定微藻生物大分子含量的方法；從自然水體采集純培養(yǎng)的藻株，培養(yǎng)到OD680達(dá)到1.0，將藻液離心，去清液，濃縮加入丙三醇；采用FTIR ReactIRTM45m傅立葉紅外光譜儀對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行1000-3000cm-1的連續(xù)檢測(cè)分析；FT-IR檢測(cè)本底：利用軟件iC QuantTM對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析的生物大分子的實(shí)際含量；將測(cè)定結(jié)果代入公式計(jì)算油脂AL、蛋白質(zhì)Ap與碳本水化合物Ac的生物大分子的含量TL(mg)、TP(mg)、TC(mg)；本方法可以對(duì)細(xì)胞無(wú)傷害的同時(shí)快速檢測(cè)出微藻油脂含量，蛋白質(zhì)和碳水化合物的含量。
【專利說(shuō)明】一種傅立葉紅外法測(cè)定微藻生物大分子含量的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微藻生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】。具體地涉及微藻油脂含量，蛋白質(zhì)和碳水化合物的測(cè)量方法，尤其針對(duì)處于生長(zhǎng)培養(yǎng)中的微藻細(xì)胞進(jìn)行非侵入式的快速篩選、檢測(cè)和/或分離。

【背景技術(shù)】
[0002]微藻是一類尺寸極其微小(0.2?500 μ m)、數(shù)量巨大、在占地球面積71%的海洋中無(wú)所不在的浮游生物，是海洋生態(tài)體系中的初級(jí)生產(chǎn)者，它們生產(chǎn)著海洋其它一切異養(yǎng)生物賴以生存的有機(jī)物質(zhì)。微藻含有葉綠素a，并能進(jìn)行光合作用。由于其個(gè)體小、比表面積大、代謝活性高、生長(zhǎng)繁殖快、倍增時(shí)間短、易于培養(yǎng)，因可獲得大量的藻體；并且其生物多樣性極高，在世界上水生微藻的總種類數(shù)超過(guò)10萬(wàn)種,其中海洋微藻的總種類數(shù)可能多達(dá)幾萬(wàn)種(目前已被確認(rèn)的有4000?5000種)，可供篩選的含特異功能物質(zhì)的微藻種類繁多；目前應(yīng)用生物技術(shù)進(jìn)行大量培養(yǎng)或生產(chǎn)的微藻分屬于4個(gè)藻門(mén):藍(lán)藻門(mén)、綠藻門(mén)、金藻門(mén)和紅藻門(mén)。在形形色色的微藻中，可供人類利用的生物活性物質(zhì)的類別很多。目前世界上雖已開(kāi)發(fā)利用的微藻種類很少，但它們?cè)谌祟愃枨蟮谋＝∈称?、醫(yī)藥品、化妝品、水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物幼體的開(kāi)口餌料、化工、能源、農(nóng)業(yè)、環(huán)保等方面已顯示出其廣闊的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景。
[0003]生物柴油是一種已經(jīng)得到證明的燃料，以其為可再生性的環(huán)保燃料能源而得到世界的廣泛關(guān)注。生物柴油的主要成分是脂肪酸甲酯(FAME)，是以可再生資源(如油菜籽油、大豆油、玉米油、棉籽油、花生油、葵花子油、棕櫚油、椰子油、回收烹飪油、動(dòng)物油以及微生物油脂等)為原料而制成，具備與化石燃料，石油、柴油相近的性能。生產(chǎn)和使用生物柴油的技術(shù)已經(jīng)存在50余年，與石油柴油相比，生物柴油的某些性能更加優(yōu)良。主要表現(xiàn)在:
[0004]1.生物柴油具有相對(duì)較高的運(yùn)動(dòng)粘度，這使得生物柴油在不影響燃油霧化的情況下，更容易在汽缸內(nèi)壁形成一層油膜，從而提高運(yùn)動(dòng)機(jī)件的潤(rùn)滑性，降低機(jī)件的磨損。
[0005]2.生物柴油的閃點(diǎn)較石化柴油高，有利于安全運(yùn)輸、儲(chǔ)存。
[0006]3.十六燒值較高,一般大于50,抗爆性能優(yōu)于石化柴油。
[0007]4.生物柴油含氧量高于石化柴油，可達(dá)10%，在燃燒過(guò)程中所需的氧氣量較石化柴油少，燃燒、點(diǎn)火性能優(yōu)于石化柴油。
[0008]5.無(wú)毒性，而且生物分解性良好(98%可降解)，健康環(huán)保性能良好。除了供公交、卡車等柴油機(jī)作替代燃料外，也可作海洋運(yùn)輸、水域動(dòng)力設(shè)備、地底礦業(yè)設(shè)備，燃油發(fā)電廠等非道路用柴油機(jī)的替代燃料。
[0009]6.基本不含芳香族烴類成分，因此不具致癌性，而且硫、鉛、鹵族元素等有害物質(zhì)含量極少。
[0010]7.既可作為添加劑促進(jìn)燃燒效果，又是燃料，具有雙重效果。
[0011]8.生物柴油以一定的比例與石化柴油調(diào)和使用，可以降低油耗、提高動(dòng)力特性，降低排放污染率。研究發(fā)現(xiàn)，用生物柴油和2#柴油1:1混合，可以達(dá)到最佳的燃燒工況。
[0012]9.環(huán)境友好，采用生物柴油的燃燒生成物中，有毒有機(jī)物排放量?jī)H為普通柴油1/10，顆粒物為石化柴油20%，CO2和CO排放量?jī)H為石化柴油的10%，混和生物柴油可將含硫排放從500ppm降低到5ppm。
[0013]面對(duì)植物原料生產(chǎn)生物柴油的諸多問(wèn)題，利用微藻產(chǎn)油具有不與農(nóng)業(yè)爭(zhēng)地的明顯優(yōu)勢(shì)，而且可用海水作為天然培養(yǎng)基進(jìn)行大量繁殖。跟植物一樣，微藻也是利用光照產(chǎn)油，但卻比植物光合效率高10倍，微藻生長(zhǎng)迅速快，而且含有極其豐富的油脂。大多數(shù)微藻的產(chǎn)油量為油料作物的10-200倍，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)了最好的油料作物的產(chǎn)油量。
[0014]油脂含量所占藻細(xì)胞干重(以下簡(jiǎn)稱微藻油脂含量)是評(píng)價(jià)微藻作為生物柴油原料潛力的關(guān)鍵指標(biāo)之一。傳統(tǒng)油脂含量測(cè)定方法主要是有機(jī)溶劑稱量法，如用氯仿/甲醇或乙醚提取、揮干溶劑稱重測(cè)定油脂含量，這種方法需要大量的微藻干粉，步驟復(fù)雜，時(shí)間久，能耗大，同時(shí)在稱重法操作流程中，利用有機(jī)溶劑(氯仿和甲醇)超聲萃取藻體油脂成分，大量葉綠素溶解于甲醇溶劑可能導(dǎo)致稱重法測(cè)得油脂含量有所偏差，影響其準(zhǔn)確性，因而不適合實(shí)驗(yàn)室層面的微藻篩選。目前快速檢測(cè)微藻油脂含量的方法主要是熒光染料法，染料通過(guò)侵入藻細(xì)胞內(nèi)部，通過(guò)油脂與染料結(jié)合后定量測(cè)定微藻油脂含量，其中目前最常用的熒光染料是尼羅紅(Nile Red)。但該方法因染料對(duì)細(xì)胞的毒副作用造成很多檢測(cè)細(xì)胞死亡，同時(shí)因該法檢測(cè)靈敏度高，背景干擾嚴(yán)重，對(duì)實(shí)驗(yàn)操作人員水平和實(shí)驗(yàn)條件要求高，同時(shí)，尼羅紅熒光染色法分析時(shí)，因藻體熒光強(qiáng)度與油脂含量的線性關(guān)系是基于稱重法建立的，因此熒光法分析結(jié)果也有一定程度偏差，進(jìn)而影響該檢測(cè)方法的準(zhǔn)確度。從上世紀(jì)70年代末開(kāi)始，國(guó)內(nèi)外科研人員致力于高產(chǎn)油微藻的篩選培育，但因缺乏一種實(shí)用快速簡(jiǎn)便的微藻油脂含量的檢測(cè)方法，造成篩選周期長(zhǎng)，耗費(fèi)大量人力物力，到目前為止仍未篩選到適合微藻產(chǎn)油產(chǎn)業(yè)化發(fā)展需要的優(yōu)良藻種。因此建立簡(jiǎn)便快捷的油脂含量檢測(cè)方法已成為限制產(chǎn)油微藻篩選培育發(fā)展的關(guān)鍵因素，也是制約微藻生物柴油產(chǎn)業(yè)化的原因之一。由于微藻油脂含量(％)與藻種，生長(zhǎng)周期，培養(yǎng)條件及生產(chǎn)工藝密切相關(guān)，因此建立快速簡(jiǎn)便，非侵入，對(duì)細(xì)胞無(wú)傷害的，測(cè)定微藻油脂，蛋白質(zhì)和碳水化合物含量的方法無(wú)論對(duì)于藻種篩選還是培養(yǎng)條件優(yōu)化，以及采收時(shí)期的確定都有十分重要的意義。目前，利用傅立葉紅外法(FT-1R)快速測(cè)量微藻油脂含量，蛋白質(zhì)和碳水化合物的研究報(bào)告和相關(guān)專利技術(shù)國(guó)內(nèi)外報(bào)道較少，而且FT-1R檢測(cè)均需將生物樣品做成固體粉末，過(guò)程耗時(shí)，樣品需要量大，因此迫切需要開(kāi)發(fā)一種高效、準(zhǔn)確、原位、快速、全程跟蹤、高通量的檢測(cè)微藻產(chǎn)油能力，同時(shí)還可檢測(cè)蛋白質(zhì)和碳水化合物的含量的技術(shù)和方法體系。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0015]本發(fā)明的目的在于提供一種非侵入式，對(duì)處于生長(zhǎng)培養(yǎng)中的微藻細(xì)胞內(nèi)油脂含量，蛋白質(zhì)和碳水化合物進(jìn)行快速測(cè)量的方法，以克服公知技術(shù)中存在的缺陷。例如稱重法耗時(shí)長(zhǎng)，需要大量樣品以及尼羅紅熒光染色法毒副作用大，干擾嚴(yán)重，只能測(cè)定微藻油脂含量等問(wèn)題。
[0016]本發(fā)明采用FT-1R法對(duì)微藻細(xì)胞油脂、蛋白質(zhì)與碳水化合物含量進(jìn)行定量分析，其原理是油脂分子中的甲基與亞甲基，蛋白質(zhì)分子中的酰胺基以及碳水化合物分子中的C-OH 與 C-O-C 分別在紅外光譜的 2800-3000011' 1500-1700cm_1 和 1000-1200CHT1 處有特征吸收峰，再經(jīng)過(guò)特征峰面積的計(jì)算便可求得三種生化組分的含量。
[0017]利用FTIR ReactIR?45m 傅立葉紅外光譜儀(METTLER TOLEDO Switzerland)檢測(cè)微藻細(xì)胞生物大分子的含量，可以省去微藻干燥的過(guò)程，省時(shí)，能耗低，可實(shí)現(xiàn)原位實(shí)時(shí)在線的全程檢測(cè)，能夠監(jiān)測(cè)微藻細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中生物大分子的變化情況。本專利研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)加入抗干擾劑丙三醇可以減少待測(cè)樣品中水的影響。利用FTIR ReactIR?45m傅立葉紅外光譜儀檢測(cè)樣品之后使用軟件iC Quant?對(duì)油脂(\)、蛋白質(zhì)(Ap)與碳水化合物(A。)的特征峰面積積分,并按以下公式計(jì)算三種生物大分子的含量IY(mg)、Tp (mg)、Tc (mg)。
[0018]Al=-2.30+78.96 X Tl
[0019]Ap=-0.27+12.72 X Tp
[0020]Ac=0.07+2.05 X Tc
[0021]本發(fā)明的方法包含如下步驟:
[0022]I)藻種的準(zhǔn)備:從自然水體采集的樣品需要經(jīng)過(guò)分離篩選獲得純培養(yǎng)的藻株，擴(kuò)大培養(yǎng)(BG-11培養(yǎng)基)到100ml，藻株處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，0D680達(dá)到1.0，準(zhǔn)備FT-1R分析；如果已經(jīng)是純培養(yǎng)的藻株只需活化處理使藻株處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，擴(kuò)大培養(yǎng)(BG-11培養(yǎng)基)到100ml, 0D680達(dá)到0.8，準(zhǔn)備FT-1R分析。
[0023]2)濃縮藻液:將上述10ml藻液6000rpm離心5分鐘，去除上清液，濃縮100倍，加入Iml的BG-1l液體培養(yǎng)基。
[0024]3)添加抗干擾劑:為減少水對(duì)紅外吸收的影響，加入丙三醇，使其終濃度為40%。
[0025]4)FT_IR檢測(cè)樣品:采用FTIR ReactIR?45m傅立葉紅外光譜儀對(duì)上述待測(cè)樣品進(jìn)行l(wèi)OOOjOOOcnT1的連續(xù)檢測(cè)分析
[0026]5)FT-1R檢測(cè)本底:采用FTIR ReactIR?45m傅立葉紅外光譜儀對(duì)含有40%丙三醇Iml的BG-1l培養(yǎng)基進(jìn)行ΙΟΟΟΙΟΟΟαιΓ1的連續(xù)檢測(cè)分析，作為對(duì)照和本底初始值。
[0027]6)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析:利用軟件iC Quant?對(duì)步驟4和步驟5的結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并用步驟4的結(jié)果減去步驟5的結(jié)果即為待測(cè)樣品中生物大分子的實(shí)際含量。
[0028]7)結(jié)果計(jì)算:將上述測(cè)定結(jié)果代入公式計(jì)算油脂、蛋白質(zhì)與碳水化合物的總量。
[0029]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:本發(fā)明的一種用傅立葉紅外法(FT-1R)原位實(shí)時(shí)在線快速測(cè)量微藻液體樣品中油脂含量，蛋白質(zhì)和碳水化合物的含量方法，采用非侵入式，對(duì)細(xì)胞無(wú)傷害的方法可以同時(shí)快速檢測(cè)微藻油脂含量，蛋白質(zhì)和碳水化合物的含量。該發(fā)明可以實(shí)時(shí)檢測(cè)和監(jiān)控微藻油脂含量，蛋白質(zhì)和碳水化合物的含量的變化。該發(fā)明省去了常規(guī)傅立葉紅外法固體制片的步驟，可以在線監(jiān)測(cè)液體樣品。同時(shí)發(fā)明通過(guò)添加丙三醇減少液體樣品中水的影響。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0030]圖1為本發(fā)明的檢測(cè)流程圖

【具體實(shí)施方式】
[0031]實(shí)施例1
[0032]用本發(fā)明所述的檢測(cè)方法測(cè)定已純培養(yǎng)的小球藻(Chlorella vulgaris)的油脂含量，具體的操作步驟如下:
[0033]I)以Chlorella vulgaris為對(duì)象,首先在BG-11固體培養(yǎng)基上活化該藻種,挑取單克隆接種到20ml BG-11液體培養(yǎng)基，150轉(zhuǎn)，1500_2500Lux，28 °C培養(yǎng)48-72小時(shí)，將培養(yǎng)好的藻液20ml轉(zhuǎn)接到10ml的液體培養(yǎng)基中，28°C，1500_2500Lux，靜止培養(yǎng)48-72小時(shí)，當(dāng)OD達(dá)到1.0時(shí)候離心收集藻液，準(zhǔn)備FT-1R分析。
[0034]2)濃縮藻液:將上述10ml藻液6000rpm離心5分鐘，去除上清液，濃縮100倍，加入Iml的BG-1l液體培養(yǎng)基。
[0035]3)添加抗干擾劑:為減少水對(duì)紅外吸收的影響，加入丙三醇，使其終濃度為40%。
[0036]4)FT_IR檢測(cè)樣品:采用FTIR ReactIR?45m傅立葉紅外光譜儀對(duì)上述待測(cè)樣品進(jìn)行l(wèi)OOOjOOOcnT1的連續(xù)檢測(cè)分析
[0037]5)FT-1R檢測(cè)本底:采用FTIR ReactIR?45m傅立葉紅外光譜儀對(duì)含有40%丙三醇Iml的BG-1l培養(yǎng)基進(jìn)行ΙΟΟΟΙΟΟΟαιΓ1的連續(xù)檢測(cè)分析，作為對(duì)照和本底初始值。
[0038]6)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析:利用軟件iC Quant?對(duì)步驟4和步驟5的結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并用步驟4的結(jié)果減去步驟5的結(jié)果即為待測(cè)樣品中生物大分子的實(shí)際含量。
[0039]7)結(jié)果分析:將上述測(cè)定結(jié)果代入公式\=-2.30+78.96XTl計(jì)算小球藻油脂的含量。通過(guò)上述檢測(cè)方法測(cè)定小球藻的油脂含量為42.6%。
[0040]實(shí)施例2
[0041]用本發(fā)明所述的檢測(cè)方法測(cè)定已純培養(yǎng)的小球藻(Chlorella vulgaris)的蛋白質(zhì)含量，具體的操作步驟如下:
[0042]I)以Chlorella vulgaris為對(duì)象,首先在BG-1l固體培養(yǎng)基上活化該藻種,挑取單克隆接種到20ml BG-11液體培養(yǎng)基，150轉(zhuǎn)，1500_2500Lux，28 °C培養(yǎng)48-72小時(shí)，將培養(yǎng)好的藻液20ml轉(zhuǎn)接到10ml的液體培養(yǎng)基中，28°C，1500_2500Lux，靜止培養(yǎng)48-72小時(shí)，當(dāng)OD達(dá)到1.0時(shí)候離心收集藻液，準(zhǔn)備FT-1R分析。
[0043]2)濃縮藻液:將上述10ml藻液6000rpm離心5分鐘，去除上清液，濃縮100倍，加入Iml的BG-1l液體培養(yǎng)基。
[0044]3)添加抗干擾劑:為減少水對(duì)紅外吸收的影響，加入丙三醇，使其終濃度為40%。
[0045]4)FT_IR檢測(cè)樣品:采用FTIR ReactIR?45m傅立葉紅外光譜儀對(duì)上述待測(cè)樣品進(jìn)行l(wèi)OOOjOOOcnT1的連續(xù)檢測(cè)分析
[0046]5)FT-1R檢測(cè)本底:采用FTIR ReactIR?45m傅立葉紅外光譜儀對(duì)含有40%丙三醇Iml的BG-1l培養(yǎng)基進(jìn)行ΙΟΟΟΙΟΟΟαιΓ1的連續(xù)檢測(cè)分析，作為對(duì)照和本底初始值。
[0047]6)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析:利用軟件iC Quant?對(duì)步驟4和步驟5的結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并用步驟4的結(jié)果減去步驟5的結(jié)果即為待測(cè)樣品中生物大分子的實(shí)際含量。
[0048]7)結(jié)果分析:將上述測(cè)定結(jié)果代入公式Ap=-0.27+12.72XTP計(jì)算小球藻蛋白質(zhì)的含量。通過(guò)上述檢測(cè)方法測(cè)定小球藻的蛋白質(zhì)含量為45.3%。
[0049]實(shí)施例3
[0050]用本發(fā)明所述的檢測(cè)方法測(cè)定已純培養(yǎng)的小球藻(Chlorella vulgaris)的碳水化合物的含量，具體的操作步驟如下:
[0051]I)以Chlorella vulgaris為對(duì)象,首先在BG-11固體培養(yǎng)基上活化該藻種,挑取單克隆接種到20ml BG-11液體培養(yǎng)基，150轉(zhuǎn)，1500_2500Lux，28 °C培養(yǎng)48-72小時(shí)，將培養(yǎng)好的藻液20ml轉(zhuǎn)接到10ml的液體培養(yǎng)基中，28°C，1500_2500Lux，靜止培養(yǎng)48-72小時(shí)，當(dāng)OD達(dá)到1.0時(shí)候離心收集藻液，準(zhǔn)備FT-1R分析。
[0052]2)濃縮藻液:將上述10ml藻液6000rpm離心5分鐘，去除上清液，濃縮100倍，加入Iml的BG-1l液體培養(yǎng)基。
[0053]3)添加抗干擾劑:為減少水對(duì)紅外吸收的影響，加入丙三醇，使其終濃度為40%。
[0054]4)FT_IR檢測(cè)樣品:采用FTIR ReactIR?45m傅立葉紅外光譜儀對(duì)上述待測(cè)樣品進(jìn)行l(wèi)OOOjOOOcnT1的連續(xù)檢測(cè)分析
[0055]5)FT-1R檢測(cè)本底:采用FTIR ReactIR?45m傅立葉紅外光譜儀對(duì)含有40%丙三醇Iml的BG-1l培養(yǎng)基進(jìn)行ΙΟΟΟΙΟΟΟαιΓ1的連續(xù)檢測(cè)分析，作為對(duì)照和本底初始值。
[0056]6)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析:利用軟件iC Quant?對(duì)步驟4和步驟5的結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并用步驟4的結(jié)果減去步驟5的結(jié)果即為待測(cè)樣品中生物大分子的實(shí)際含量。
[0057]7)結(jié)果分析:將上述測(cè)定結(jié)果代入公式Αε=0.07+2.05XTc計(jì)算小球藻碳水化合物的含量。
[0058]通過(guò)上述檢測(cè)方法測(cè)定小球藻的碳水化合物含量為9.72%。
[0059]實(shí)施例4
[0060]用本發(fā)明所述的檢測(cè)方法測(cè)定已純培養(yǎng)的三角褐指藻(Phaeodactylumtricornutum)的油脂的含量,具體的操作步驟如下:
[0061]I)以Phaeodactylum tricornutum為對(duì)象，首先在BG-11固體培養(yǎng)基上活化該藻種，挑取單克隆接種到20ml BG-1l液體培養(yǎng)基，150轉(zhuǎn)，1500-2500Lux，28°C培養(yǎng)48-72小時(shí)，將培養(yǎng)好的藻液20ml轉(zhuǎn)接到10ml的液體培養(yǎng)基中，28°C，1500_2500Lux，靜止培養(yǎng)48-72小時(shí)，當(dāng)OD達(dá)到1.0時(shí)候離心收集藻液，準(zhǔn)備FT-1R分析。
[0062]2)濃縮藻液:將上述10ml藻液6000rpm離心5分鐘，去除上清液，濃縮100倍，加入Iml的BG-1l液體培養(yǎng)基。
[0063]3)添加抗干擾劑:為減少水對(duì)紅外吸收的影響，加入丙三醇，使其終濃度為40%。
[0064]4)FT_IR檢測(cè)樣品:采用FTIR ReactIR?45m傅立葉紅外光譜儀對(duì)上述待測(cè)樣品進(jìn)行l(wèi)OOOjOOOcnT1的連續(xù)檢測(cè)分析
[0065]5)FT-1R檢測(cè)本底:采用FTIR ReactIR?45m傅立葉紅外光譜儀對(duì)含有40%丙三醇Iml的BG-1l培養(yǎng)基進(jìn)行ΙΟΟΟΙΟΟΟαιΓ1的連續(xù)檢測(cè)分析，作為對(duì)照和本底初始值。
[0066]6)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析:利用軟件iC Quant?對(duì)步驟4和步驟5的結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并用步驟4的結(jié)果減去步驟5的結(jié)果即為待測(cè)樣品中生物大分子的實(shí)際含量。
[0067]7)結(jié)果分析:將上述測(cè)定結(jié)果代入公式\=_2.30+78.96XTl計(jì)算三角褐指藻油脂的含量。
[0068]通過(guò)上述檢測(cè)方法測(cè)定三角褐指藻的油脂含量為33.8%。
[0069]實(shí)施例5
[0070]用本發(fā)明所述的檢測(cè)方法測(cè)定已純培養(yǎng)的三角褐指藻(Phaeodactylumtricornutum)的蛋白質(zhì)的含量,具體的操作步驟如下:
[0071]I)以Phaeodactylum tricornutum為對(duì)象，首先在BG-11固體培養(yǎng)基上活化該藻種，挑取單克隆接種到20ml BG-1l液體培養(yǎng)基，150轉(zhuǎn)，1500-2500Lux，28°C培養(yǎng)48-72小時(shí)，將培養(yǎng)好的藻液20ml轉(zhuǎn)接到10ml的液體培養(yǎng)基中，28°C，1500_2500Lux，靜止培養(yǎng)48-72小時(shí)，當(dāng)OD達(dá)到1.0時(shí)候離心收集藻液，準(zhǔn)備FT-1R分析。
[0072]2)濃縮藻液:將上述10ml藻液6000rpm離心5分鐘，去除上清液，濃縮100倍，加入Iml的BG-1l液體培養(yǎng)基。
[0073]3)添加抗干擾劑:為減少水對(duì)紅外吸收的影響，加入丙三醇，使其終濃度為40%。
[0074]4)FT_IR檢測(cè)樣品:采用FTIR ReactIR?45m傅立葉紅外光譜儀對(duì)上述待測(cè)樣品進(jìn)行l(wèi)OOOjOOOcnT1的連續(xù)檢測(cè)分析
[0075]5)FT-1R檢測(cè)本底:采用FTIR ReactIR?45m傅立葉紅外光譜儀對(duì)含有40%丙三醇Iml的BG-1l培養(yǎng)基進(jìn)行ΙΟΟΟΙΟΟΟαιΓ1的連續(xù)檢測(cè)分析，作為對(duì)照和本底初始值。
[0076]6)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析:利用軟件iC Quant?對(duì)步驟4和步驟5的結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并用步驟4的結(jié)果減去步驟5的結(jié)果即為待測(cè)樣品中生物大分子的實(shí)際含量。
[0077]7)結(jié)果分析:將上述測(cè)定結(jié)果代入公式Ap=-0.27+12.72XTp計(jì)算三角褐指藻蛋白質(zhì)的含量。
[0078]通過(guò)上述檢測(cè)方法測(cè)定三角褐指藻的蛋白質(zhì)含量為36.4%。
[0079]實(shí)施例6
[0080]用本發(fā)明所述的檢測(cè)方法測(cè)定已純培養(yǎng)的三角褐指藻(Phaeodactylumtricornutum)的碳水化合物的含量,具體的操作步驟如下:
[0081]I)以三角褐指藻藻(Phaeodactylum tricornutum)為對(duì)象，首先在BG-11固體培養(yǎng)基上活化該藻種，挑取單克隆接種到20ml BG-1l液體培養(yǎng)基，150轉(zhuǎn)，1500-2500Lux,
28°C培養(yǎng)48-72小時(shí)，將培養(yǎng)好的藻液20ml轉(zhuǎn)接到10ml的液體培養(yǎng)基中，28 °C，1500-2500Lux,靜止培養(yǎng)48-72小時(shí)，當(dāng)OD達(dá)到1.0時(shí)候離心收集藻液，準(zhǔn)備FT-1R分析。
[0082]2)濃縮藻液:將上述10ml藻液6000rpm離心5分鐘，去除上清液，濃縮100倍，加入Iml的BG-1l液體培養(yǎng)基。
[0083]3)添加抗干擾劑:為減少水對(duì)紅外吸收的影響，加入丙三醇，使其終濃度為40%。
[0084]4)FT_IR檢測(cè)樣品:采用FTIR ReactIR?45m傅立葉紅外光譜儀對(duì)上述待測(cè)樣品進(jìn)行l(wèi)OOOjOOOcnT1的連續(xù)檢測(cè)分析
[0085]5)FT-1R檢測(cè)本底:采用FTIR ReactIR?45m傅立葉紅外光譜儀對(duì)含有40%丙三醇Iml的BG-1l培養(yǎng)基進(jìn)行ΙΟΟΟΙΟΟΟαιΓ1的連續(xù)檢測(cè)分析，作為對(duì)照和本底初始值。
[0086]6)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析:利用軟件iC Quant?對(duì)步驟4和步驟5的結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并用步驟4的結(jié)果減去步驟5的結(jié)果即為待測(cè)樣品中生物大分子的實(shí)際含量。
[0087]7)結(jié)果分析:將上述測(cè)定結(jié)果代入公式Ac=0.07+2.05XTc計(jì)算小球藻碳水化合物的含量。
[0088]通過(guò)上述檢測(cè)方法測(cè)定三角褐指藻的碳水化合物含量為26.1%。
[0089]實(shí)施例7
[0090]用本發(fā)明所述的檢測(cè)方法測(cè)定已純培養(yǎng)的布朗葡萄藻(Botryococcus braunii)的油脂的含量，具體的操作步驟如下:
[0091]I)以Botryococcus braunii為對(duì)象,首先在BG-11固體培養(yǎng)基上活化該藻種,挑取單克隆接種到20ml BG-1l液體培養(yǎng)基，150轉(zhuǎn)，1500_2500Lux，28°C培養(yǎng)48-72小時(shí)，將培養(yǎng)好的藻液20ml轉(zhuǎn)接到10ml的液體培養(yǎng)基中，28°C，1500_2500Lux，靜止培養(yǎng)48-72小時(shí)，當(dāng)OD達(dá)到1.0時(shí)候離心收集藻液，準(zhǔn)備FT-1R分析。
[0092]2)濃縮藻液:將上述10ml藻液6000rpm離心5分鐘，去除上清液，濃縮100倍，加入Iml的BG-1l液體培養(yǎng)基。
[0093]3)添加抗干擾劑:為減少水對(duì)紅外吸收的影響，加入丙三醇，使其終濃度為40%。
[0094]4)FT_IR檢測(cè)樣品:采用FTIR ReactIR?45m傅立葉紅外光譜儀對(duì)上述待測(cè)樣品進(jìn)行l(wèi)OOOjOOOcnT1的連續(xù)檢測(cè)分析
[0095]5)FT-1R檢測(cè)本底:采用FTIR ReactIR?45m傅立葉紅外光譜儀對(duì)含有40%丙三醇Iml的BG-1l培養(yǎng)基進(jìn)行ΙΟΟΟΙΟΟΟαιΓ1的連續(xù)檢測(cè)分析，作為對(duì)照和本底初始值。
[0096]6)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析:利用軟件iC Quant?對(duì)步驟4和步驟5的結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并用步驟4的結(jié)果減去步驟5的結(jié)果即為待測(cè)樣品中生物大分子的實(shí)際含量。
[0097]7)結(jié)果分析:將上述測(cè)定結(jié)果代入公式\=_2.30+78.96 X Tl計(jì)算布朗葡萄藻油脂的含量。
[0098]通過(guò)上述檢測(cè)方法測(cè)定布朗葡萄藻的油脂含量為41.7%。
[0099]實(shí)施例8
[0100]用本發(fā)明所述的檢測(cè)方法測(cè)定已純培養(yǎng)的布朗葡萄藻(Botryococcus braunii)的蛋白質(zhì)的含量，具體的操作步驟如下:
[0101]I)以Botryococcus braunii為對(duì)象,首先在BG-11固體培養(yǎng)基上活化該藻種,挑取單克隆接種到20ml BG-1l液體培養(yǎng)基，150轉(zhuǎn)，1500_2500Lux，28°C培養(yǎng)48-72小時(shí)，將培養(yǎng)好的藻液20ml轉(zhuǎn)接到10ml的液體培養(yǎng)基中，28°C，1500_2500Lux，靜止培養(yǎng)48-72小時(shí)，當(dāng)OD達(dá)到1.0時(shí)候離心收集藻液，準(zhǔn)備FT-1R分析。
[0102]2)濃縮藻液:將上述10ml藻液6000rpm離心5分鐘，去除上清液，濃縮100倍，加入Iml的BG-1l液體培養(yǎng)基。
[0103]3)添加抗干擾劑:為減少水對(duì)紅外吸收的影響，加入丙三醇，使其終濃度為40%。
[0104]4)FT_IR檢測(cè)樣品:采用FTIR ReactIR?45m傅立葉紅外光譜儀對(duì)上述待測(cè)樣品進(jìn)行l(wèi)OOOjOOOcnT1的連續(xù)檢測(cè)分析
[0105]5)FT_IR檢測(cè)本底:采用FTIR ReactIR?45m傅立葉紅外光譜儀對(duì)含有40%丙三醇Iml的BG-1l培養(yǎng)基進(jìn)行ΙΟΟΟΙΟΟΟαιΓ1的連續(xù)檢測(cè)分析，作為對(duì)照和本底初始值。
[0106]6)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析:利用軟件iC Quant?對(duì)步驟4和步驟5的結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并用步驟4的結(jié)果減去步驟5的結(jié)果即為待測(cè)樣品中生物大分子的實(shí)際含量。
[0107]7)結(jié)果分析:將上述測(cè)定結(jié)果代入公式Ap=-0.27+12.72XTp計(jì)算三角褐指藻蛋白質(zhì)的含量。
[0108]通過(guò)上述檢測(cè)方法測(cè)定布朗葡萄藻的蛋白質(zhì)含量為17%。
[0109]實(shí)施例9
[0110]用本發(fā)明所述的檢測(cè)方法測(cè)定已純培養(yǎng)的布朗葡萄藻(Botryococcus braunii)的碳水化合物的含量，具體的操作步驟如下:
[0111]I)以布朗葡萄藻(Botryococcus braunii)為對(duì)象，首先在BG-11固體培養(yǎng)基上活化該藻種，挑取單克隆接種到20ml BG-1l液體培養(yǎng)基，150轉(zhuǎn)，1500-2500Lux，28°C培養(yǎng)48-72小時(shí)，將培養(yǎng)好的藻液20ml轉(zhuǎn)接到10ml的液體培養(yǎng)基中，28°C，1500_2500Lux，靜止培養(yǎng)48-72小時(shí)，當(dāng)OD達(dá)到1.0時(shí)候離心收集藻液，準(zhǔn)備FT-1R分析。
[0112]2)濃縮藻液:將上述10ml藻液6000rpm離心5分鐘，去除上清液，濃縮100倍，加入Iml的BG-1l液體培養(yǎng)基。
[0113]3)添加抗干擾劑:為減少水對(duì)紅外吸收的影響，加入丙三醇，使其終濃度為40%。
[0114]4)FT_IR檢測(cè)樣品:采用FTIR ReactIR?45m傅立葉紅外光譜儀對(duì)上述待測(cè)樣品進(jìn)行l(wèi)OOOjOOOcnT1的連續(xù)檢測(cè)分析
[0115]5)FT_IR檢測(cè)本底:采用FTIR ReactIR?45m傅立葉紅外光譜儀對(duì)含有40%丙三醇Iml的BG-1l培養(yǎng)基進(jìn)行ΙΟΟΟΙΟΟΟαιΓ1的連續(xù)檢測(cè)分析，作為對(duì)照和本底初始值。
[0116]6)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析:利用軟件iC Quant?對(duì)步驟4和步驟5的結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并用步驟4的結(jié)果減去步驟5的結(jié)果即為待測(cè)樣品中生物大分子的實(shí)際含量。
[0117]7)結(jié)果分析:將上述測(cè)定結(jié)果代入公式Αε=0.07+2.05 X Tc計(jì)算小球藻碳水化合物的含量。
[0118]通過(guò)上述檢測(cè)方法測(cè)定布朗葡萄藻的碳水化合物含量為32%。
【權(quán)利要求】
1.一種傅立葉紅外法測(cè)定微藻生物大分子含量的方法，其特征在于:包含如下步驟: 1)藻種的準(zhǔn)備:從自然水體采集的樣品經(jīng)過(guò)分離篩選獲得純培養(yǎng)的藻株，擴(kuò)大培養(yǎng)到100ml，培養(yǎng)基為BG-1l培養(yǎng)基，藻株處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，0D680達(dá)到1.0，準(zhǔn)備FT-1R分析；如果已經(jīng)是純培養(yǎng)的藻株只需活化處理使藻株處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，擴(kuò)大培養(yǎng)到100ml，培養(yǎng)基為BG-1l培養(yǎng)基，0D680達(dá)到0.8，準(zhǔn)備FT-1R分析； 2)濃縮藻液:將上述10ml藻液6000rpm離心5分鐘，去除上清液，濃縮100倍，加入Iml的BG-1l液體培養(yǎng)基； 3)添加抗干擾劑:為減少水對(duì)紅外吸收的影響，加入丙三醇，使其終濃度為40%； 4)FT-1R檢測(cè)樣品:采用FTIR ReactIR?45m傅立葉紅外光譜儀對(duì)上述待測(cè)樣品進(jìn)行1000-3000cm_1的連續(xù)檢測(cè)分析； 5)FT-1R檢測(cè)本底:采用FTIRReactIR?45m傅立葉紅外光譜儀對(duì)含有40%丙三醇Iml的BG-1l培養(yǎng)基進(jìn)行l(wèi)OOOjOOOcnT1的連續(xù)檢測(cè)分析，作為對(duì)照和本底初始值； 6)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析:利用軟件iCQuant?對(duì)步驟4和步驟5的結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并用步驟4的結(jié)果減去步驟5的結(jié)果即為待測(cè)樣品中生物大分子的實(shí)際含量； 7)結(jié)果計(jì)算:將上述測(cè)定結(jié)果按以下公式計(jì)算油脂\、蛋白質(zhì)Ap與碳水化合物A。的生物大分子的含量 Tli(Iiig)、Tp (mg)、Tc (mg)；
Al=-2.30+78.96 X Tl
Ap=-0.27+12.72 X Tp
Ac=0.07+2.05XTe。
【文檔編號(hào)】G01N21/3563GK104237155SQ201310249852
【公開(kāi)日】2014年12月24日 申請(qǐng)日期:2013年6月21日 優(yōu)先權(quán)日:2013年6月21日
【發(fā)明者】孫洪磊, 呂靜, 何皓, 傅鵬程, 齊泮侖, 蘭玲, 付興國(guó), 胡徐騰 申請(qǐng)人:中國(guó)石油天然氣股份有限公司