一種pik3ca基因突變熒光定量pcr檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種采用熒光定量PCR檢測(cè)基因突變的方法，特別涉及一種PIK3CA基因突變熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法。本發(fā)明的方法包括：設(shè)計(jì)特異性引物和探針；配制熒光定量PCR反應(yīng)體系和設(shè)計(jì)反應(yīng)條件；利用特異性引物擴(kuò)增樣品中的突變基因靶序列；利用探針和擴(kuò)增產(chǎn)物的雜交，檢測(cè)反應(yīng)體系中FAM、HEX、Cy5熒光信號(hào)強(qiáng)度作為結(jié)果的判斷標(biāo)準(zhǔn)。使用本發(fā)明提供的試劑盒可同時(shí)檢測(cè)PIK3CA基因的8種突變，特異性強(qiáng)，選擇能力強(qiáng)，可在突變含量只有0.1％的臨床樣本中檢測(cè)出低至5個(gè)拷貝的PIK3CA突變分子。檢測(cè)速度快，只需90分鐘即可完成檢測(cè)。
【專利說(shuō)明】—種PIK3CA基因突變熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種采用熒光定量PCR檢測(cè)基因突變的方法，特別涉及一種PIK3CA基因突變熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法，可在突變含量只有0.1 %的臨床樣本中檢測(cè)出低至5個(gè)拷貝的PIK3CA突變分子。
【背景技術(shù)】
[0002]磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol-3_kinase,PI3K)是一個(gè)重要的信號(hào)傳導(dǎo)通路分子。其由一個(gè)催化亞基PllO和一個(gè)調(diào)節(jié)亞基p85構(gòu)成。根據(jù)PI3K的pllO結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和底物分子不同可將其分為I型、II型和III型等3個(gè)亞型。PI3K介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)化、凋亡和腫瘤的發(fā)生中起重要作用，調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖和存活。研究發(fā)現(xiàn)，PI3K-AKT信號(hào)通路失調(diào)可導(dǎo)致肺癌、卵巢癌、乳癌、惡性膠質(zhì)瘤、子宮內(nèi)膜癌和鼻咽癌等惡性腫瘤的發(fā)生。
[0003]PI3K 的催化亞基 pllO α 由 PIK3CA(phosphatidylinositol3_kinase catalyticalpha)基因編碼。PIK3CA是一個(gè)長(zhǎng)度為34kb的基因，定位于3號(hào)染色體3q26.32，含20個(gè)外顯子，編碼1068個(gè)氨基酸，生成124kDa蛋白質(zhì)。其功能是催化4，5-PIP2成為3，4，5-PIP3，激活PI3K-AKT信號(hào)通路，參與信號(hào)通路的功能發(fā)揮。研究發(fā)現(xiàn)PIK3CA是PI3K信號(hào)通路中最常發(fā)生突變的基因，在人類癌癥中呈現(xiàn)高頻突變。例如，Samuels等人報(bào)道，PIK3CA在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、胃癌、乳腺癌和肺癌組織中突變率分別為27%、25(%、8(%和4(%，而在結(jié)腸癌組織中突變率則高達(dá)32% [1]。Campbell等研究發(fā)現(xiàn)在卵巢癌中PIK3CA亦存在高頻突變，突變率達(dá)到18.8%。這 種非隨機(jī)高頻突變顯示了其在腫瘤發(fā)生中的重要意義[2]。
[0004]絕大部分(80%~90% )的PIK3CA基因突變聚集在該基因的第9號(hào)外顯子和第20號(hào)外顯子上，分別對(duì)應(yīng)該酶的螺旋區(qū)(包括E542K、E545K和E54?等突變類型)和激酶區(qū)(包括H1047R和H1047L等突變類型)。
[0005]近年來(lái)，數(shù)個(gè)特異性抑制PI3K/AKT/mT0R通路的靶向藥物已進(jìn)入后期臨床研究(www.clinicaltrial.gov)。這些祀向藥物主要針對(duì)PIK3CA基因突變陽(yáng)性的患者。例如⑶C-0941是Genentech公司推出的專門針對(duì)PIK3CA的靶向藥物，其作用原理是通過(guò)與PIK3CA的催化亞基單位pllO結(jié)合，非競(jìng)爭(zhēng)性、不可逆地抑制PIK3CA激酶活性，阻斷PIK3CA介導(dǎo)的信號(hào)通路，抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)，導(dǎo)致癌細(xì)胞凋亡。該藥物已在不同的腫瘤治療實(shí)驗(yàn)中顯示出了極好的療效[3]。另一方面，PIK3CA基因突變可以預(yù)測(cè)癌癥患者對(duì)某些靶向藥物的反應(yīng)性。例如，治療結(jié)直腸癌的祀向藥物愛(ài)必妥(Cetuximab)和帕尼單抗(Panitumumab)對(duì)于PIK3CA基因突變的結(jié)直腸癌患者無(wú)效。而用于治療乳腺癌的分子靶向藥物赫賽汀(Trastuzumab)對(duì)PIK3CA基因突變患者的療效亦欠佳，其預(yù)后不及PIK3CA為野生型的患者。關(guān)于PIK3CA基因突變對(duì)表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKI)治療非小細(xì)胞肺癌的預(yù)后及療效預(yù)測(cè)價(jià)值的研究結(jié)果表明，PIK3CA基因突變與疾病進(jìn)展時(shí)間(TTP)和總生存期(OS)相關(guān)，應(yīng)當(dāng)將其納入EGFR-TKI治療耐藥及生存預(yù)測(cè)標(biāo)志物中。
[0006]上述及其他大量的研究表明，在制定臨床治療方案之前，應(yīng)用分子診斷技術(shù)準(zhǔn)確地檢測(cè)病人腫瘤細(xì)胞中PIK3CA基因突變狀態(tài)，從而選擇合適的靶向治療藥物，是應(yīng)用靶向藥物對(duì)癌癥實(shí)行個(gè)性化治療的前提和基礎(chǔ)；同時(shí)PIK3CA基因突變檢測(cè)亦可為臨床評(píng)判病人的預(yù)后提供幫助。
[0007]目前在臨床上檢測(cè)PIK3CA基因突變的通用方法為傳統(tǒng)的DNA直接測(cè)序法。DNA直接測(cè)序法檢測(cè)靈敏度只有20~30%，亦即腫瘤樣本中必須要含有20~30%的突變陽(yáng)性細(xì)胞才能被檢測(cè)出來(lái)；對(duì)于小樣本病理組織的檢測(cè)，直接測(cè)序法的檢測(cè)精度有限，難以滿足實(shí)際應(yīng)用的需求。同時(shí)，該方法容易造成污染，出現(xiàn)假陽(yáng)性；操作復(fù)雜，耗時(shí)長(zhǎng)(通常需要2~3天才能出檢測(cè)結(jié)果)。針對(duì)此類問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種快速、高效、高靈敏度、操作簡(jiǎn)便的PIK3CA基因突變檢測(cè)方法和試劑盒，僅需90分鐘即可完成PIK3CA基因8種突變的檢測(cè)，為臨床個(gè)體化用藥提供準(zhǔn)確實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0008]為了提高臨床檢驗(yàn)?zāi)芰ΓF(xiàn)提供一種快速有效檢測(cè)PIK3CA基因突變的熒光定量PCR方法，該方法可以在90分鐘檢測(cè)出PIK3CA基因的8種突變類型。
[0009]本發(fā)明的技術(shù)方案包含以下步驟:
[0010]1.根據(jù)人類PIK3CA基因9號(hào)、20號(hào)外顯子的野生型基因序列和相對(duì)應(yīng)的突變型基因序列，設(shè)計(jì)出多對(duì)特異性高效引物和探針，9號(hào)外顯子探針以FAM信號(hào)進(jìn)行熒光標(biāo)記，20號(hào)外顯子探針以Cy5信號(hào)進(jìn)行熒光標(biāo)記；以PIK3CA基因中的保守序列為內(nèi)控，設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物和探針，探針以HEX信號(hào)進(jìn)行熒光標(biāo)記。
[0011]2.建立熒光定量PCR擴(kuò)增突變基因序列的反應(yīng)體系，利用特異性引物通過(guò)PCR反應(yīng)大量擴(kuò)增目的基因序列。
[0012]3.利用特異性探針和擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雜交，檢測(cè)反應(yīng)體系中FAM和HEX熒光信號(hào)的強(qiáng)度，以HEX的信號(hào)達(dá)到設(shè)定閾值(Ct > 18)時(shí)表明樣品DNA中包含PIK3CA基因，且上樣量在允許范圍內(nèi)，說(shuō)明FAM的信號(hào)可信、有效；以FAM信號(hào)達(dá)到設(shè)定閾值時(shí)所需的循環(huán)次數(shù)Ct值作為陰陽(yáng)性判斷的標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)Ct值等于O或35時(shí)，檢測(cè)結(jié)果判定為陰性，Ct值< 32時(shí)，檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性。
[0013]本發(fā)明提供一種用于檢測(cè)PIK3CA基因突變的試劑盒，所建立的熒光定量PCR反應(yīng)體系為:
[0014]
【權(quán)利要求】
1.用于檢測(cè)PIK3CA基因突變的特異性引物和探針，包括下列標(biāo)簽序列和10組30條引物和探針。 (1)標(biāo)簽序列:taactactgtcgacactgacag (2)PIK 3 CA基因突變的特異性引物和探針核苷酸序列，見(jiàn)本發(fā)明說(shuō)明書表2，P-SEQ-1 ~P-SEQ-30。
2.一種檢測(cè)PIK3CA基因突變的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，包括權(quán)利要求1所述的10組30條引物和探針。
3.如權(quán)利要求2所述的檢測(cè)PIK3CA基因突變的檢測(cè)試劑盒，包括以下熒光定量PCR反應(yīng)體系:
4.如權(quán)利要求2所述的檢測(cè)PIK3CA基因突變的檢測(cè)試劑盒，熒光定量PCR反應(yīng)條件為: 95°C預(yù)變性5分鐘后進(jìn)入以下循環(huán):72°C 15秒，95°C 15秒，64°C 45秒，進(jìn)行15個(gè)循環(huán)；72°C 15秒，95°C 15秒，60°C 45秒，共45個(gè)循環(huán)，熒光信號(hào)收集溫度設(shè)定在退火溫度。
5.如權(quán)利要求2所述的檢測(cè)PIK3CA基因突變的檢測(cè)試劑盒，檢測(cè)結(jié)果判定方法為:以HEX的信號(hào)達(dá)到設(shè)定閾值(Ct > 18)時(shí)表明樣品DNA中包含PIK3CA基因，且上樣量在允許范圍內(nèi)，說(shuō)明FAM的信號(hào)可信、有效；以FAM信號(hào)達(dá)到設(shè)定閾值時(shí)所需的循環(huán)次數(shù)Ct值作為陰陽(yáng)性判斷的標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)Ct值等于O或35時(shí)，檢測(cè)結(jié)果判定為陰性，Ct值< 32時(shí)，檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性。
6.如權(quán)利要求2所述的檢測(cè)PIK3CA基因突變的檢測(cè)試劑盒，待檢測(cè)樣品包括新鮮病理組織、石蠟包埋病理組織、石蠟切片和血液。
7.一種用于檢測(cè)PIK3CA基因突變的引物和探針，其特征在于，由P-SEQ-1~P-SEQ-30的寡核苷酸引物和探針或序列與其有至少70%同一性的寡核苷酸組成。
【文檔編號(hào)】G01N21/64GK103773837SQ201310260412
【公開(kāi)日】2014年5月7日 申請(qǐng)日期:2013年6月25日 優(yōu)先權(quán)日:2013年6月25日
【發(fā)明者】周細(xì)武, 邱英華, 徐玉蓮 申請(qǐng)人:寧波有成生物醫(yī)藥科技有限公司