一種生物素標(biāo)記兔抗羅非魚IgM多克隆抗體的制備方法及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】一種生物素標(biāo)記兔抗羅非魚IgM多克隆抗體的制備方法，含以下步驟：采集羅非魚血清經(jīng)純化處理得純化的羅非魚IgM；將羅非魚IgM免疫兔得兔抗羅非魚IgM多克隆抗體，采用ELISA檢測兔抗羅非魚IgM多克隆抗體的抗羅非魚血清效價；將純化的羅非魚IgM加強(qiáng)免疫后，收集、分離得含有兔抗羅非魚IgM多克隆抗體的血清，經(jīng)純化處理，加入生物素混勻，得生物素標(biāo)記兔抗羅非魚IgM多克隆抗體；采用該法制成的生物素標(biāo)記兔抗羅非魚IgM多克隆抗體特異性好，純度和效價高，能與羅非魚IgM發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)；還公開了上述方法制成的生物素標(biāo)記兔抗羅非魚IgM多克隆抗體在ELISA中的應(yīng)用及在Western-Blot中的應(yīng)用。
【專利說明】一種生物素標(biāo)記兔抗羅非魚IgM多克隆抗體的制備方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于多克隆抗體【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及為一種生物素標(biāo)記兔抗羅非魚IgM多克隆抗體的制備方法及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]免疫球蛋白是動物體液免疫應(yīng)答中的重要分子，作為低等脊椎動物的硬骨魚類的主要免疫球蛋白就是IgM。該分子是一個四聚體，每個單體包含2條重鏈和2條輕鏈。高度純化的魚類血清IgM在魚類免疫學(xué)中有重要的用途，如制備單克隆、多克隆抗體，檢測魚類病原體及魚類免疫應(yīng)答水平；探索IgM的產(chǎn)生、分布，還可用于研究免疫系統(tǒng)的進(jìn)化。
[0003]羅非魚已被農(nóng)業(yè)部列為產(chǎn)業(yè)化開發(fā)的優(yōu)質(zhì)魚類品種，近年來，隨著養(yǎng)殖環(huán)境的破壞，養(yǎng)殖密度的增加，導(dǎo)致病害日趨嚴(yán)重，進(jìn)而導(dǎo)致藥物濫用、殘留嚴(yán)重，商品魚出口受阻，嚴(yán)重影響了我國羅非魚養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，研究開發(fā)魚類疫苗，對羅非魚的養(yǎng)殖與病害防制有重要意義。高純度血清免疫球蛋白IgM及其抗體的制備是研究魚類免疫應(yīng)答、免疫檢測方法的基礎(chǔ)。目前，市面上還沒有兔抗羅非魚IgM抗體商品的出現(xiàn)，這為羅非魚免疫應(yīng)答水平的監(jiān)測、及其免疫檢測方法的建立提供了不利因素。因此，有必要制備特異性好、高純度、高效價的兔抗羅非魚IgM的多克隆抗體，為羅非魚病害防治研究提供基礎(chǔ)材料。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種生物素標(biāo)記兔抗羅非魚IgM多克隆抗體的制備方法，采用該制備方法制成的生物素標(biāo)記兔抗羅非魚IgM多克隆抗體特異性好，且純度和效價高，并能與羅非魚IgM發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)。
[0005]本發(fā)明的目的還在與提供采用上述生物素標(biāo)記兔抗羅非魚IgM多克隆抗體的制備方法制成的生物素標(biāo)記兔抗羅非魚IgM多克隆抗體。
[0006]本發(fā)明的第三個目的在于提供采用上述方法制成的生物素標(biāo)記兔抗羅非魚IgM多克隆抗體在ELISA法檢測羅非魚血清抗體效價中的應(yīng)用。
[0007]本發(fā)明的第四個目的在于提供采用上述方法制成的生物素標(biāo)記兔抗羅非魚IgM多克隆抗體在Western-Blot中的應(yīng)用。
[0008]本發(fā)明的第一個目的是通過如下技術(shù)方案來實現(xiàn)的:一種生物素標(biāo)記兔抗羅非魚IgM多克隆抗體的制備方法，含以下步驟:
[0009](I)選取健康羅非魚的尾動脈血，靜置使血清充分析出，離心，取上清，得羅非魚血清；
[0010](2)取羅非魚的血清，用等體積PBS稀釋后，加入飽和硫酸銨攪拌處理，離心，取沉淀，溶解后，進(jìn)行純化處理，得純化的羅非魚IgM ；
[0011](3)第一次免疫時，按200 μ g/只SPF級新西蘭兔的免疫劑量，取步驟(2)純化的羅非魚IgM與等體積的完全弗氏佐劑混合，充分乳化后在SPF級新西蘭兔背部皮下進(jìn)行多點注射免疫，10-14天后進(jìn)行第二次、第三次以及第四次免疫，第二、三、四次免疫是將純化的羅非魚IgM按200 μ g/只SPF級新西蘭兔的免疫劑量與等體積的不完全弗氏佐劑混合，充分乳化，在新西蘭兔背部皮下多點注射免疫，每次間隔10-14天，第四次免疫后第10天，對免疫的新西蘭兔耳靜脈采血，ELISA檢測新西蘭兔血清中抗羅非魚IgM抗體的效價；
[0012](4)四免后，用純化的羅非魚IgM按100μ g/只的免疫劑量加強(qiáng)免疫新西蘭兔，
2?4天內(nèi)進(jìn)行心臟采血，收集、分離得到含有抗羅非魚IgM的兔多克隆抗體的血清，再經(jīng)純化處理，得兔抗羅非魚IgM多克隆抗體，將兔抗羅非魚IgM多克隆抗體與生物素混勻，獲得生物素標(biāo)記兔抗羅非魚IgM多克隆抗體。
[0013]本發(fā)明步驟⑵中飽和硫酸銨的用量為羅非魚血清的1.5?3倍，其pH為7.4，PBS的pH也為7.4。
[0014]本發(fā)明步驟(2)和步驟(4)中純化處理采用ProteinA+ProteinG親和層析柱過柱純化處理。
[0015]本發(fā)明步驟(4)中四免后血清效價達(dá)到1:640000以上，用純化的羅非魚IgM按100 μ g/只的免疫劑量加強(qiáng)免疫新西蘭兔。
[0016]本發(fā)明步驟(4)中兔抗羅非魚IgM多克隆抗體在與生物素混勻前先經(jīng)透析處理。
[0017]本發(fā)明步驟(4)中所述的兔抗羅非魚IgM多克隆抗體與生物素的濃度和用量相同。
[0018]本發(fā)明步驟⑷中將兔抗羅非魚IgM多克隆抗體與生物素混勻，作用3?5小時后，進(jìn)行透析處理以及采用BCA試劑盒測定其濃度并分裝，獲得生物素標(biāo)記兔抗羅非魚IgM多克隆抗體。
[0019]本發(fā)明步驟(I)中優(yōu)選在37°C靜置2小時，4°C冰箱過夜使血清充分析出，4000rpm/min離心IOmin,取上清,得羅非魚血清。
[0020]本發(fā)明步驟⑵中離心時的轉(zhuǎn)速優(yōu)選為7000rpm,離心時間優(yōu)選為30min。
[0021]本發(fā)明的第二個目的是通過如下技術(shù)方案來實現(xiàn)的:一種生物素標(biāo)記兔抗羅非魚IgM多克隆抗體，其特征是:采用上述的生物素標(biāo)記兔抗羅非魚IgM多克隆抗體的制備方法制成。
[0022]本發(fā)明的第三個目的是通過如下技術(shù)方案來實現(xiàn)的:上述生物素標(biāo)記兔抗羅非魚IgM多克隆抗體的制備方制成的生物素標(biāo)記兔抗羅非魚IgM多克隆抗體在ELISA法檢測羅非魚血清抗體效價中的應(yīng)用。
[0023]本發(fā)明的第四個目的是通過如下技術(shù)方案來實現(xiàn)的:上述生物素標(biāo)記兔抗羅非魚IgM多克隆抗體的制備方制成的生物素標(biāo)記兔抗羅非魚IgM多克隆抗體在Western-Blot中的應(yīng)用。
[0024]本發(fā)明具有如下有益效果:
[0025]本發(fā)明制備的生物素標(biāo)記兔抗羅非魚IgM多克隆抗體具有特異性好、純度高、效價高的特點，可與羅非魚IgM發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)、可用于ELISA實驗的要求。本發(fā)明生物素標(biāo)記兔抗羅非魚IgM多克隆抗體的制備與應(yīng)用，為羅非魚有害細(xì)菌、病毒的疫苗研制、免疫水平檢測以及免疫檢測方法的建立提供一個重要工具，具有重要的理論意義和生產(chǎn)價值?！緦＠綀D】

【附圖說明】
[0026]圖1為本發(fā)明實施例1中羅非魚IgM純化的SDS-PAGE圖譜；
[0027]圖2為實施例3中熒光掃描儀掃描顯色圖，為Western-blot顯色圖譜，在80KD處重鏈有一明顯的雜交條帶。
【具體實施方式】
[0028]結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明:
[0029]實施例1
[0030]本實施例提供的兔抗羅非魚IgM多克隆抗體的制備方法，步驟如下所示:
[0031](I)健康的羅非魚5尾，體重400_450g，從尾動脈采血，37°C放置2h，4°C靜置過夜使血清充分析出，4°C 4000rpm/min,離心30min,取上清；
[0032](2)將羅非魚血清用等體積0.01mol/L PBS (pH7.4)稀釋后，加入兩倍ρΗ7.4的飽和硫酸銨，邊加溶液邊攪拌；加完后繼續(xù)攪拌I小時，進(jìn)行離心，7000rpm，30min，取沉淀；
[0033](3)將沉淀用PBS溶解后，ProteinG+ProteinA親和層析柱過柱純化IgM，BCA試劑盒測定濃度，如圖1所示，為純化后IgM SDS-PAGE圖譜；
[0034](4)將200 μ g純化羅非魚IgM與等體積的完全弗氏佐劑混合，充分乳化后在兔背部皮下多點注射免疫，10-14天內(nèi)，用200 μ g純化羅非魚IgM與等體積的不完全弗氏佐劑混合進(jìn)行第二次、第三次、第四次免疫，乳化充分后，在兔背部皮下多點注射免疫，先后共注射免疫四次，每次免疫間隔10-14天，第四次免疫10后，兔耳靜脈采血，ELISA檢測血清中兔抗羅非魚IgM多克隆抗體的效價；
[0035](5)用100 μ g純化的羅非魚IgM加強(qiáng)免疫第四次免疫后的新西蘭兔，2-4天后，收集、分離得到的含有抗羅非魚IgM的兔多克隆抗體的血清，ELISA檢測兔血清抗羅非魚IgM的效價；
[0036]所測兔血清抗羅非魚IgM的效價為1:640000以上；
[0037](6)用蛋白純化儀,ProteinG+ProteinA親和層析柱過柱純化兔抗羅非魚IgM的多克隆抗體；
[0038](7)用BCA試劑盒測定收集樣品的濃度進(jìn)行分裝，所測純化多抗?jié)舛葹?.539mg/mL ；ELISA測定純化后兔多抗的滴度；
[0039]所測純化兔抗羅非魚IgM多克隆抗體滴度為3.125μ g/mL,即效價為1:320000。
[0040](8)純化的兔抗IgM多克隆抗體，過夜透析，與等量的生物素溶液混合,作用4個小時以上，標(biāo)記好的生物素-兔抗IgM多克隆抗體過夜透析，得生物素-兔抗羅非魚IgM多克隆抗體用于ELISA檢測得到良好的線性數(shù)據(jù)，證實生物素、兔抗羅非魚IgM多克隆抗體標(biāo)記成功，ELISA測定抗體滴度和最佳工作稀釋度。測定抗體滴度為5.69μ g/mL，抗體效價為1:160000，最佳工作稀釋度為1:10000。
[0041]實施例2
[0042]本實施例提供的生物素標(biāo)記兔抗羅非魚IgM多克隆抗體應(yīng)用步驟如下:
[0043](I)試驗羅非魚經(jīng)1.93 X IO3Cfu/尾低劑量無乳鏈球菌腹腔注射，采集48h，72h，一周、12天尾動脈血,37°C靜置2小時，4°C冰箱過夜使血清充分析出，4000rpm/min離心lOmin，取上清，得羅非魚血清；[0044](2)取無乳鏈球菌菌液，12000rpm/min離心5min，超聲波破碎，BCA試劑盒測定裂解菌液濃度，按80 μ g/ml濃度100 μ I/孔包被100 μ L/孔包被ELISA板，4°C過夜；
[0045](3)甩掉包被液，1%牛血清白蛋白封閉ELISA板，37°C作用2個小時；
[0046](4) PBST洗板三次，PBS溶液梯度稀釋(I)步所得血清，100 μ L/孔加入ELISA板中，37°C作用I個小時；
[0047](5) PBST洗板三次，PBS溶液1:10000稀釋生物素-兔抗羅非魚IgM多克隆抗體，
100μ L/孔加入ELISA板中，37°C作用I個小時；
[0048](6) PBST洗板三次，PBS溶液1:10000稀釋HRP-鏈親和霉素，100 μ L/孔加入ELISA板中，37°C作用I個小時；
[0049](7) PBST洗板三次，每孔加入100 μ LTMB工作液，37°C作用20分鐘；
[0050](8)每孔加入50 μ L終止液終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀讀數(shù)，確定羅非魚血清效價。結(jié)果顯示48h羅非魚血清效價最高，達(dá)1:51200，隨后血清效價降低，12天血清效價為1:6400。證實所制備的生物素標(biāo)記兔抗羅非魚IgM多克隆抗體可以用于檢測羅非魚血清抗體效價的監(jiān)測。
[0051]實施例3
[0052]本實施例提供的兔抗羅非魚IgM多克隆抗體應(yīng)用于Western-blot,步驟如下:
[0053](I)將5 μ g羅非魚IgM用12%分離膠進(jìn)行常規(guī)SDS-PAGE電泳；
[0054](2)電泳結(jié)束后，電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜(NC)上；
[0055](3)轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，剪下Marker條帶在氨基黑染液中染5min，再用脫色液脫色，直到蛋白帶清晰為止；
[0056]⑷NC膜加入5%脫脂奶粉中，37°C封閉lh，TBST洗3次，每次IOmin ；
[0057](5)加入純化后的多抗(稀釋至3.125 μ g/mL)，37°C孵育60min，TBST洗3次’每次 IOmin ；
[0058](6)加入突光標(biāo)記 Donkey ant1-Rabbit IgGl: 15000, 37°C溫育 60min, TBST 洗 3次，每次IOmin ；
[0059](7)熒光掃描儀掃描顯色，如圖2所示，為Western-blot顯色圖譜，在80KD處重鏈有一明顯的雜交條帶。
[0060]以上實施例僅用于闡述本發(fā)明，而本發(fā)明的保護(hù)范圍并非僅僅局限于以上實施例。所述【技術(shù)領(lǐng)域】的普通技術(shù)人員依據(jù)以上本發(fā)明公開的內(nèi)容和各參數(shù)所取范圍，均可實現(xiàn)本發(fā)明的目的。
【權(quán)利要求】
1.一種生物素標(biāo)記兔抗羅非魚IgM多克隆抗體的制備方法，其特征是含以下步驟: (1)選取健康羅非魚的尾動脈血，靜置使血清充分析出，離心，取上清，得羅非魚血清； (2)取羅非魚的血清，用等體積PBS稀釋后，加入飽和硫酸銨攪拌處理，離心，取沉淀，溶解后，進(jìn)行純化處理，得純化的羅非魚IgM ； (3)第一次免疫時，按200μ g/只SPF級新西蘭兔的免疫劑量，取步驟(2)純化的羅非魚IgM與等體積的完全弗氏佐劑混合，充分乳化后在SPF級新西蘭兔背部皮下進(jìn)行多點注射免疫，10-14天后進(jìn)行第二次、第三次以及第四次免疫，第二、三、四次免疫是將純化的羅非魚IgM按200 μ g/只SPF級新西蘭兔的免疫劑量與等體積的不完全弗氏佐劑混合，充分乳化，在新西蘭兔背部皮下多點注射免疫，每次間隔10-14天，第四次免疫后第10天，對免疫的新西蘭兔耳靜脈采血，ELISA檢測新西蘭兔血清中抗羅非魚IgM抗體的效價； (4)四免后，用純化的羅非魚IgM按100μ g/只的免疫劑量加強(qiáng)免疫新西蘭兔，2?4天內(nèi)進(jìn)行心臟采血，收集、分離得到含有抗羅非魚IgM的兔多克隆抗體的血清，再經(jīng)純化處理，得兔抗羅非魚IgM多克隆抗體，將兔抗羅非魚IgM多克隆抗體與生物素混勻，獲得生物素標(biāo)記兔抗羅非魚IgM多克隆抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物素標(biāo)記兔抗羅非魚IgM多克隆抗體的制備方法，其特征是:步驟⑵中飽和硫酸銨的用量為羅非魚血清的1.5?3倍，其pH為7.4，PBS的pH也為7.4。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物素標(biāo)記兔抗羅非魚IgM多克隆抗體的制備方法，其特征是:步驟⑵和步驟⑷中純化處理采用ProteinA+ProteinG親和層析柱過柱純化處理。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物素標(biāo)記兔抗羅非魚IgM多克隆抗體的制備方法，其特征是:步驟⑷中四免后血清效價達(dá)到1:640000以上，用純化的羅非魚IgM按100 μ g/只的免疫劑量加強(qiáng)免疫新西蘭兔。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物素標(biāo)記兔抗羅非魚IgM多克隆抗體的制備方法，其特征是:步驟(4)中兔抗羅非魚IgM多克隆抗體在與生物素混勻前先經(jīng)透析處理。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物素標(biāo)記兔抗羅非魚IgM多克隆抗體的制備方法，其特征是:步驟(4)中所述的兔抗羅非魚IgM多克隆抗體與生物素的濃度和用量相同。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物素標(biāo)記兔抗羅非魚IgM多克隆抗體的制備方法，其特征是:步驟(4)中將兔抗羅非魚IgM多克隆抗體與生物素混勻，作用3?5小時后，進(jìn)行透析處理以及采用BCA試劑盒測定其濃度并分裝，獲得生物素標(biāo)記兔抗羅非魚IgM多克隆抗體。
8.—種生物素標(biāo)記兔抗羅非魚IgM多克隆抗體，其特征是:采用權(quán)利要求1-7任一項所述的生物素標(biāo)記兔抗羅非魚IgM多克隆抗體的制備方法制成。
9.權(quán)利要求8所述的生物素標(biāo)記兔抗羅非魚IgM多克隆抗體在ELISA法檢測羅非魚血清抗體效價中的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求8所述的生物素標(biāo)記兔抗羅非魚IgM多克隆抗體在Western-Blot中的應(yīng)用。
【文檔編號】G01N33/573GK103454411SQ201310268486
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2013年6月28日 優(yōu)先權(quán)日:2013年5月27日
【發(fā)明者】馬艷平, 柯浩, 劉振興, 馮國清, 郝樂 申請人:廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物衛(wèi)生研究所