一種簡(jiǎn)便快速檢測(cè)l-半胱氨酸的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種快速簡(jiǎn)單檢測(cè)L-半胱氨酸的紫外比色方法。該方法基于L-半胱氨酸與1-氯-2,4-二硝基苯在沸水浴中快速生成黃色絡(luò)合物，并且十六烷基三甲基溴化銨可加速該反應(yīng)的速率。本反應(yīng)肉眼可檢測(cè)到20μM的L-半胱氨酸。在紫外檢測(cè)儀下的檢出限為0.5μM。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單方便、耗時(shí)短、快速特異、肉眼可視、靈敏經(jīng)濟(jì)等。
【專利說明】一種簡(jiǎn)便快速檢測(cè)L-半胱氨酸的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及有機(jī)材料的顯色反應(yīng)用于檢測(cè)領(lǐng)域，具體地說一種簡(jiǎn)便快速檢測(cè)L-半胱氨酸的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]L-半胱氨酸是一種含巰基的氨基酸，是重要的生理活性物質(zhì)之一。它作為還原性谷胱甘肽的底物能夠增加谷胱甘肽的生成量，從而保護(hù)細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，減輕心肌細(xì)胞在缺血再灌流中的損傷。L-半胱氨酸參與細(xì)胞的還原和肝臟內(nèi)的磷脂代謝過程，有保護(hù)肝細(xì)胞、促進(jìn)肝功能的作用。此外，L-半胱氨酸還有刺激前T淋巴細(xì)胞分化為成熟的淋巴細(xì)胞的作用及增加人體對(duì)某些毒素的抵抗力。生物體內(nèi)半胱氨酸的含量變化及代謝失調(diào)均會(huì)導(dǎo)致一些疾病的發(fā)生，通過測(cè)定生物體內(nèi)半胱氨酸的含量，可實(shí)現(xiàn)對(duì)某些代謝疾病的診斷。因此，實(shí)現(xiàn)快速、靈敏的檢測(cè)半胱氨酸具有十分重要的意義。目前，L-半胱氨酸的定量測(cè)定一般是利用其還原性及其與某些有機(jī)試劑發(fā)生反應(yīng)后，用電化學(xué)、化學(xué)發(fā)光法、催化動(dòng)力學(xué)方法及熒光方法進(jìn)行測(cè)定，這些方法操作復(fù)雜、靈敏度不高或選擇性較差，而且以上方法有的需要大型儀器，有的需要專業(yè)人員，有的檢出限較高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的在于利用L-半胱氨酸與1-氯-2，4- 二硝基苯在沸水浴條件下發(fā)生親核取代反應(yīng)，快速靈敏檢測(cè)L-半胱氨酸。
[0004]本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的:
[0005]一種簡(jiǎn)便快速檢測(cè)L-半胱氨酸的方法，利用L-半胱氨酸與1-氯-2，4- 二硝基苯在沸水浴條件下發(fā)生親核取代反應(yīng)，從而快速靈敏的定量檢測(cè)待測(cè)溶液中L-半胱氨酸。
[0006]進(jìn)一步的說，待測(cè)溶液中加入1-氯-2，4- 二硝基苯，并在十六烷基三甲基溴化銨及沸水浴條件下催化親核取代反應(yīng)生成黃色絡(luò)合物，從而利用紫外可見分光光度計(jì)對(duì)黃色的絡(luò)合產(chǎn)物在355nm處測(cè)定紫外吸收值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)待測(cè)物中L-半胱氨酸進(jìn)行定量檢測(cè)。
[0007]更進(jìn)一步的說，取待測(cè)溶液800ml加入20-200 μ I A液、5-20 μ I B液和2-10 μ IC液進(jìn)行混勻，混勻后在沸水浴條件下反應(yīng)2-15min生成黃色絡(luò)合物；從而利用紫外可見分光光度計(jì)對(duì)黃色的絡(luò)合產(chǎn)物在355nm處測(cè)定紫外吸收值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)待測(cè)物中L-半胱氨酸進(jìn)行定量檢測(cè)。
[0008]所述標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制，
[0009]I )L_半胱氨酸母液的配制:將L-半胱氨酸在棕色容量瓶中用去離子水定容，配置母液；
[0010]2) L-半胱氨酸濃度梯度稀釋:將母液分別稀釋至不同梯度濃度；
[0011]3)構(gòu)建緩沖條件:將不同梯度濃度的母液中分別加入A液、B液與C液，再用去離子水定容充分混勻后于沸水浴中反應(yīng)2-15min ；[0012]4)紫外分光光度計(jì)測(cè)定:將上述不同梯度濃度母液用紫外分光光度計(jì)測(cè)定波長(zhǎng)為355nm的數(shù)值，而后繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0013]進(jìn)一步的說，所述標(biāo)準(zhǔn)曲線的獲取:
[0014]I )L_半胱氨酸母液的配制:將0.0121g L-半胱氨酸在50ml棕色容量瓶中用去離子水定容，配置2mM母液；
[0015]2) L-半胱氨酸濃度梯度稀釋:將2mM母液分別稀釋到ImM，100 μ M，10 μ Μ，待用；
[0016]3)構(gòu)建緩沖條件:將濃度分別為1禮，100 μ M，10 μ M，I μ M的四組L-半胱氨酸溶液取200 μ I, 400 μ I, 600 μ I, 800 μ I加入100 μ I A液，并用去離子水將溶液總體積補(bǔ)足到900 μ 1，充分混勻；
[0017]4)在步驟(3)中所得液體加入5-20 μ I B液與2-10 μ I C液，與沸水浴中反應(yīng)2_15min ；
[0018]5)紫外分光光度計(jì)測(cè)定:將步驟4)所得液體用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定波長(zhǎng)為355nm ；
[0019]6)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:采用origin軟件對(duì)得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理繪圖，獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0020]所述A液的配方為:濃度為0.05-0.5M的PBS緩沖液，pH5_7;B液為:濃度為
0.01-0.3M的十六烷基三甲基溴化銨的水溶液；C液為:50-100mM的1-氯-2，4- 二硝基苯的乙醇溶液。
[0021]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的積極效果是:
[0022]目前，測(cè)定L-半胱氨酸的方法以電化學(xué)、化學(xué)發(fā)光法、催化動(dòng)力學(xué)方法及熒光方法為主，操作復(fù)雜、靈敏度不高、選擇性較差。該反應(yīng)利用L-半胱氨酸與1-氯_2，4- 二硝基苯在沸水浴中發(fā)生親核取代反應(yīng)，快速檢測(cè)L-半胱氨酸，具有檢測(cè)速度快、費(fèi)用低、操作步驟簡(jiǎn)單、肉眼可視等優(yōu)點(diǎn)，為現(xiàn)場(chǎng)快速靈敏檢測(cè)L-半胱氨酸提供了新的技術(shù)手段。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0023]圖1為本發(fā)明實(shí)施例提供的在十六烷基三甲基溴化銨催化下L-半胱氨酸與1-氯-2，4- 二硝基苯在沸水浴中發(fā)生親核取代反應(yīng)前后溶液的顏色變化原理圖，A為反應(yīng)前溶液顏色，B為反應(yīng)后溶液顏色。
[0024]圖2為本發(fā)明實(shí)施例提供的在十六烷基三甲基溴化銨催化下不同濃度的L-半胱氨酸與1-氯_2，4- 二硝基苯在沸水浴中發(fā)生親核取代反應(yīng)前后溶液的顏色變化圖，其中 L-半胱氨酸的濃度分別為 1:100 μ M，2:80 μ Μ，3:60 μ Μ，4:40 μ Μ，5:20 μ Μ，6:10μΜ,7:0 μ Μ。
[0025]圖3為本發(fā)明實(shí)施例提供的測(cè)定L-半胱氨酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍，其中，線性范圍為0.2-40 μ Μ，檢出限為0.5μΜ。
[0026]圖4為本發(fā)明實(shí)施例提供的檢測(cè)L-半胱氨酸的特異性效果圖；其中0-10分別為:空白對(duì)照(不含任何氨基酸)，100 μ M的L-半胱氨酸，100 μ M的色氨酸，ImM的甘氨酸，谷氨酸，賴氨酸，蘇氨酸，精氨酸，絲氨酸，脯氨酸，甲硫氨酸，苯丙氨酸。
[0027]圖5為本發(fā)明實(shí)施例提供的檢測(cè)流程圖。
[0028] 【具體實(shí)施方式】
[0029]實(shí)施例1:豬肝臟中L-半胱氨酸的濃度測(cè)定。
[0030](I)樣品的獲取:取新鮮豬肝臟
[0031](2)樣品前處理:將2g樣品用組織剪剪碎，放入IOml的小瓶中，然后加入去離子水將體積補(bǔ)足到10ml，然后用勻漿器勻漿。將勻漿液中加入與其相同體積的乙醇，去除蛋白質(zhì)及其它雜質(zhì)，充分混分后10000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，取上清液。上清液用0.22 μ m的濾膜過濾，將濾液稀釋10倍，待用。
[0032](3)取待測(cè)樣800 μ I中加入100 μ I A液。
[0033](4)在步驟(3)中所得液體加入15 μ I B液與5μ1 C液，在沸水浴條件下反應(yīng)5min。
[0034](5)濃度調(diào)試:若步驟(4)得到的反應(yīng)液顏色過黃，可將待測(cè)樣適度稀釋后測(cè)定。
[0035](6)樣液中L-半胱氨酸濃度的計(jì)算:在紫外分光光度計(jì)中測(cè)定，獲得數(shù)據(jù)與標(biāo)準(zhǔn)曲線比對(duì)，計(jì)算出反應(yīng)液中的L-半胱氨酸濃度(參見圖4和圖5 )。
[0036](7)將以上步驟反復(fù)三次。
[0037](8)最終該反法的測(cè)試樣結(jié)果為:1.26±0.37 μ M0
[0038](9)根據(jù)稀釋濃度，實(shí)際樣中L-半胱氨酸濃度為:146±53 μ M (參見表I)。
[0039]所述A液為:濃度為0.1M的PBS緩沖液，pH6.8 ；Β液為:濃度為0.1M的十六烷基三甲基溴化銨的水溶液；C液為:72mM的1-氯-2，4- 二硝基苯的乙醇溶液。
[0040]實(shí)施例2:豬肝臟中L-半胱氨酸的濃度加標(biāo)測(cè)定。
[0041](I)樣品的獲取:取新鮮豬肝臟。
[0042](2)樣品前處理:將2g樣品用組織剪剪碎，放入IOml的小瓶中，然后加入去離子水將體積補(bǔ)足到10ml，然后用勻漿器勻漿。將勻漿液加入等體積的乙醇，去除蛋白質(zhì)及其它雜質(zhì)，充分混分后10000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，取上清液。上清液用0.22 μ m的濾膜過濾，將濾液稀釋10倍，加入5 μ M的標(biāo)準(zhǔn)L-半胱氨酸,待用。
[0043](3)取待測(cè)樣800ml中加入100 μ I A液。
[0044](4)在步驟(3)中所得液體加入15μ I B液與5μ1 C液，在沸水浴條件下反應(yīng)5min。
[0045](5)濃度調(diào)試:若步驟(4)得到的反應(yīng)液顏色過黃，可將待測(cè)樣適度稀釋后測(cè)定。
[0046](6)樣液中L-半胱氨酸濃度的計(jì)算:在紫外分光光度計(jì)中測(cè)定，獲得數(shù)據(jù)與標(biāo)準(zhǔn)曲線比對(duì)，計(jì)算出反應(yīng)液中的L-半胱氨酸濃度(參見圖4和圖5)。
[0047](7)將以上步驟反復(fù)三次。
[0048](8)最終該反法的測(cè)試樣結(jié)果為:5.26±1.27μΜ (參見表I)。
[0049]所述A液為:濃度為0.1M的PBS緩沖液，ρΗ6.8。B液為:濃度為0.1M的十六烷基三甲基溴化銨，溶于去離子水中;C液為:72mM的1-氯_2，4-二硝基苯，溶于乙醇中。
[0050]實(shí)施實(shí)例3:豬肝臟中L-半胱氨酸的濃度加標(biāo)測(cè)定。
[0051](I)樣品的獲取:取新鮮豬肝臟。
[0052](2)樣品前處理:將2g樣品用組織剪剪碎，放入IOml的小瓶中，然后加入去離子水將體積補(bǔ)足到10ml，然后用勻漿器勻漿。將勻漿液加入等體積的乙醇，去除蛋白質(zhì)及其它雜質(zhì)，充分混分后10000轉(zhuǎn)/分鐘離心，取上清液。上清液用0.22 μ m的濾膜過濾，將濾液稀釋10倍,加入10 μ M的標(biāo)準(zhǔn)L-半胱氨酸,待用。
[0053](3)取待測(cè)樣800ml中加入100 μ I A液。
[0054](4)在步驟(3)中所得液體加入15μ I B液與5μ1 C液，在沸水浴條件下反應(yīng)5min。
[0055](5)濃度調(diào)試:若步驟(4)得到的反應(yīng)液顏色過黃，可將待測(cè)樣適度稀釋后測(cè)定。
[0056](6)樣液中L-半胱氨酸濃度的計(jì)算:在紫外分光光度計(jì)中測(cè)定，獲得數(shù)據(jù)與標(biāo)準(zhǔn)曲線比對(duì)，計(jì)算出反應(yīng)液中的L-半胱氨酸濃度(參見圖4和圖5)。
[0057](7)將以上步驟反復(fù)三次。
[0058](8)最終該反法的測(cè)試樣結(jié)果為:9.36± 1.62 μ M (參見表I)。
[0059]所述A液為:濃度為0.1M的PBS緩沖液，ρΗ6.8。B液為:濃度為0.1M的十六烷基三甲基溴化銨，溶于去離子水中;C液為:72mM的1-氯_2，4-二硝基苯，溶于乙醇中。
[0060]實(shí)施例4:人尿液中L-半胱氨酸的濃度測(cè)定。
[0061](I)樣品的獲取:新鮮晨尿。
[0062](2)樣品前處理:將尿樣用0.22 μ m的濾膜過濾，將濾液稀釋10倍待用。
[0063](3)取待測(cè)樣800ml中加入100 μ I A液。
[0064](4)在步驟(3)中所得液體加入15μ I B液與5μ1 C液，在沸水浴條件下反應(yīng)5min。
[0065](5)濃度調(diào)試:若步驟(4)得到的反應(yīng)液顏色過黃，可將待測(cè)樣適度稀釋后測(cè)定。
[0066](6)樣液中L-半胱氨酸濃度的計(jì)算:在紫外分光光度計(jì)中測(cè)定，獲得數(shù)據(jù)與標(biāo)準(zhǔn)曲線比對(duì)，計(jì)算出反應(yīng)液中的L-半胱氨酸濃度(參見圖4和圖5)。
[0067](7)將以上步驟反復(fù)三次。
[0068](8)最終該反法的測(cè)試樣結(jié)果為'2.20±0.36 μ M0
[0069](9)根據(jù)稀釋濃度，實(shí)際樣中L-半胱氨酸濃度為:51.2±8.3μ M (參見表I)。
[0070]所述A液為:濃度為0.1M的PBS緩沖液，pH6.8。B液為:濃度為0.1M的十六烷基三甲基溴化銨，溶于去離子水中;C液為:72mM的1-氯_2，4-二硝基苯，溶于乙醇中。
[0071]實(shí)施例5:人尿液中L-半胱氨酸的濃度加標(biāo)測(cè)定。
[0072](I)樣品的獲取:新鮮晨尿。
[0073](2)樣品前處理:將尿樣用0.22 μ m的濾膜過濾，將濾液稀釋10倍，加入5 μ M的標(biāo)準(zhǔn)L-半胱氨酸，待用。
[0074](3)取待測(cè)樣800ml中加入100 μ I A液。
[0075](4)在步驟(3)中所得液體加入15μ I B液與5μ1 C液，在沸水浴條件下反應(yīng)5min。
[0076](5)濃度調(diào)試:若步驟(4)得到的反應(yīng)液顏色過黃，可將待測(cè)樣適度稀釋后測(cè)定。
[0077](6)樣液中L-半胱氨酸濃度的計(jì)算:在紫外分光光度計(jì)中測(cè)定，獲得數(shù)據(jù)與標(biāo)準(zhǔn)曲線比對(duì)，計(jì)算出反應(yīng)液中的L-半胱氨酸濃度(參見圖4和圖5)。
[0078](7)將以上步驟反復(fù)三次。
[0079](8)最終該反法的測(cè)試樣結(jié)果為:6.17±0.97μΜ (參見表I)。
[0080]所述A液為:濃度為0.1M的PBS緩沖液，ρΗ6.8。B液為:濃度為0.1M的十六烷基三甲基溴化銨，溶于去離子水中;C液為:72mM的1-氯_2，4-二硝基苯，溶于乙醇中。[0081]實(shí)施例6:人尿液中L-半胱氨酸的濃度加標(biāo)測(cè)定。
[0082](I)樣品的獲取:新鮮晨尿。
[0083](2)樣品前處理:將尿樣用0.22 μ m的濾膜過濾，將濾液稀釋10倍，加入10 μ M的
標(biāo)準(zhǔn)L-半胱氨酸，待用。
[0084](3)取待測(cè)樣800ml中加入100 μ I A液。
[0085](4)在步驟(3)中所得液體加入15μ I B液與5μ1 C液，在沸水浴條件下反應(yīng)
5min。
[0086](5)濃度調(diào)試:若步驟(4)得到的反應(yīng)液顏色過黃，可將待測(cè)樣適度稀釋后測(cè)定。
[0087](6)樣液中L-半胱氨酸濃度的計(jì)算:在紫外分光光度計(jì)中測(cè)定，獲得數(shù)據(jù)與標(biāo)準(zhǔn)
曲線比對(duì)，計(jì)算出反應(yīng)液中的L-半胱氨酸濃度(參見圖4和圖5 )。
[0088](7)將以上步驟反復(fù)三次。
[0089](8)最終該反法的測(cè)試樣結(jié)果為:10.07±0.76μΜ (參見表1)。
[0090]所述A液為:濃度為0.1M的PBS緩沖液，ρΗ6.8。B液為:濃度為0.1M的十六烷基
三甲基溴化銨，溶于去離子水中;C液為:72mM的1-氯_2，4-二硝基苯，溶于乙醇中。
[0091]表1
[0092]
【權(quán)利要求】
1.一種簡(jiǎn)便快速檢測(cè)L-半胱氨酸的方法，其特征在于:利用L-半胱氨酸與1-氯-2，4- 二硝基苯在沸水浴條件下發(fā)生親核取代反應(yīng)，從而快速靈敏的定量檢測(cè)待測(cè)溶液中L-半胱氨酸。
2.按權(quán)利要求1所述的簡(jiǎn)便快速檢測(cè)L-半胱氨酸的方法，其特征在于:待測(cè)溶液中加入1-氯-2，4- 二硝基苯，并在十六烷基三甲基溴化銨及沸水浴條件下催化親核取代反應(yīng)生成黃色絡(luò)合物，從而利用紫外可見分光光度計(jì)對(duì)黃色的絡(luò)合產(chǎn)物在355nm處測(cè)定紫外吸收值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)待測(cè)物中L-半胱氨酸進(jìn)行定量檢測(cè)。
3.按權(quán)利要求1所述的簡(jiǎn)便快速檢測(cè)L-半胱氨酸的方法，其特征在于:所述標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制， 1)L-半胱氨酸母液的配制:將L-半胱氨酸在棕色容量瓶中用去離子水定容，配置母液； 2)L-半胱氨酸濃度梯度稀釋:將母液分別稀釋至不同梯度濃度； 3)構(gòu)建緩沖條件:將不同梯度濃度的母液中分別加入A液、B液與C液，再用去離子水定容充分混勻后于沸水浴中反應(yīng)2-15min ； 4)紫外分光光度計(jì)測(cè)定:將上述不同梯度濃度母液用紫外分光光度計(jì)測(cè)定波長(zhǎng)為355nm的數(shù)值，而后繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
4.按權(quán)利要求1所述的簡(jiǎn)便快速檢測(cè)L-半胱氨酸的方法，其特征在于:取待測(cè)溶液800ml加入20-200 μ I A液、5_20μ1 B液和2_10μ1 C液進(jìn)行混勻，混勻后在沸水浴條件下反應(yīng)2-15min生成黃色絡(luò)合物；從而利用紫外可見分光光度計(jì)對(duì)黃色的絡(luò)合產(chǎn)物在355nm處測(cè)定紫外吸收值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)待測(cè)物中L-半胱氨酸進(jìn)行定量檢測(cè)。
5.按權(quán)利要求4所述的簡(jiǎn)便快速檢測(cè)L-半胱氨酸的方法，其特征在于: 所述標(biāo)準(zhǔn)曲線的獲取: I )L-半胱氨酸母液的配制:將0.0121g L-半胱氨酸在50ml棕色容量瓶中用去離子水定容，配置2mM母液； 2)L-半胱氨酸濃度梯度稀釋:將2mM母液分別稀釋到1禮，100 μ Μ, 10 μ Μ，待用； 3)構(gòu)建緩沖條件:將濃度分別為ΙπιΜ,ΙΟΟμΜ,ΙΟμΜ,ΙμΜ的四組L-半胱氨酸溶液取200 μ 1，400 μ 1，600 μ 1，800 μ I加入100 μ I A液，并用去離子水將溶液總體積補(bǔ)足到900 μ 1，充分混勻； 4)在步驟(3)中所得液體加入5-20μI B液與2-10μ1 C液，與沸水浴中反應(yīng)2_15min ； 5)紫外分光光度計(jì)測(cè)定:將步驟4)所得液體用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定波長(zhǎng)為355nm ； 6)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:采用origin軟件對(duì)得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理繪圖，獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線。
6.按權(quán)利要求3、4或5所述的簡(jiǎn)便快速檢測(cè)L-半胱氨酸的方法，其特征在于:所述A液的配方為:濃度為0.05-0.5M的PBS緩沖液，pH5-7 ；B液為:濃度為0.01-0.3M的十六烷基三甲基溴化銨的水溶液；C液為:50-100mM的1-氯-2，4- 二硝基苯的乙醇溶液。
【文檔編號(hào)】G01N21/31GK103969253SQ201310311246
【公開日】2014年8月6日 申請(qǐng)日期:2013年7月23日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月23日
【發(fā)明者】陳令新, 殷堃, 張衛(wèi)衛(wèi) 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院煙臺(tái)海岸帶研究所