沙門氏菌的cleia檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開沙門氏菌的CLEIA檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法，所述試劑盒包括沙門氏菌抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記沙門氏菌抗體和含有對(duì)碘苯酚、魯米諾和過氧化氫的化學(xué)發(fā)光溶液。相應(yīng)檢測(cè)方法將沙門氏菌抗體包被在96孔酶標(biāo)板上作為捕獲抗體,以辣根過氧化物酶標(biāo)記的沙門氏菌抗體為檢測(cè)抗體，以對(duì)碘苯酚為增強(qiáng)劑的魯米諾-過氧化氫為化學(xué)發(fā)光溶液，建立檢測(cè)沙門氏菌含量的雙抗體夾心化學(xué)發(fā)光酶免疫檢測(cè)方法。本發(fā)明方法靈敏度高，選擇性好，易于操作，檢測(cè)速度快，成本低廉，可實(shí)現(xiàn)沙門氏菌的大規(guī)模在線檢測(cè)，適于在食品安全、環(huán)境監(jiān)測(cè)等【技術(shù)領(lǐng)域】廣泛應(yīng)用。
【專利說明】沙門氏菌的CLEIA檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種沙門氏菌的檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法，更具體地說，是涉及一種利用化學(xué)發(fā)光酶免疫技術(shù)檢測(cè)沙門氏菌的檢測(cè)試劑盒及利用其所進(jìn)行的檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]沙門氏菌(Salmonella spp.)是一群寄生于人和動(dòng)物腸道內(nèi)的革蘭氏陰性桿菌，生化特性和抗原結(jié)構(gòu)相似，兼性厭氧。作為一種常見的食源性致病菌沙門氏菌污染畜禽肉、蛋類、生鮮奶等多數(shù)動(dòng)物源性食品的情況相當(dāng)普遍，并且也廣泛存在于自然環(huán)境中，是微生物引起食物中毒的主要病原之一，在公共衛(wèi)生學(xué)上意義重大。據(jù)報(bào)道，衛(wèi)生部已發(fā)布國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《食品中致病菌限量》的征求意見稿，該標(biāo)準(zhǔn)擬自正式發(fā)布后6個(gè)月施行，這是我國(guó)首次制定食品中致病菌限量標(biāo)準(zhǔn)。其中，沙門氏菌在各類食品樣品中不得檢出這類病菌。
[0003]目前，國(guó)內(nèi)外各公共衛(wèi)生機(jī)構(gòu)檢測(cè)沙門氏菌仍采用傳統(tǒng)培養(yǎng)檢測(cè)方法，這種方法雖然結(jié)果準(zhǔn)確，但整個(gè)過程復(fù)雜繁瑣、耗時(shí)耗力，已明顯不能滿足日益發(fā)展的國(guó)際貿(mào)易的需要，也越來越成為相關(guān)檢測(cè)部門的沉重負(fù)擔(dān)。為了尋找新的高效、簡(jiǎn)便且準(zhǔn)確的檢測(cè)技術(shù)及方法，國(guó)內(nèi)外學(xué)者進(jìn)行了大量研究，在現(xiàn)有快速檢測(cè)方法的基礎(chǔ)上不斷創(chuàng)新，常規(guī)的PCR方法雖然符合快速簡(jiǎn)便等要求，但是它易污染，假陽性高；而以免疫學(xué)、分子生物學(xué)為基礎(chǔ)研究了一些較新的快速檢測(cè)方法，并在實(shí)踐中不斷取得新進(jìn)展。
[0004]化學(xué)發(fā)光酶免疫分析(Chemiluminescentenzyme immunoassay, CLEIA)是以酶標(biāo)記生物活性物質(zhì)進(jìn)行免疫反應(yīng)，免疫反應(yīng)復(fù)合物上的酶再作用于發(fā)光底物，在信號(hào)試劑作用下發(fā)光，用發(fā)光信號(hào)測(cè)定儀進(jìn)行發(fā)光測(cè)定。目前常用的標(biāo)記酶為辣根過氧化物酶(HRP)和堿性磷酸酶(ALP)，它們有各自的發(fā)光底物，HRP最常用發(fā)光底物是魯米諾及其衍生物。在CLEIA中，使用過氧化物酶標(biāo)記抗體，進(jìn)行免疫反應(yīng)后，利用魯米諾作為發(fā)光底物，在過氧化物酶和過氧化氫作用下魯米諾發(fā)光，酶免疫反應(yīng)物中酶的濃度決定了化學(xué)發(fā)光的強(qiáng)度。此傳統(tǒng)的化學(xué)發(fā)光體系(HRP-過氧化氫-魯米諾)為幾秒內(nèi)瞬時(shí)閃光，存在發(fā)光強(qiáng)度低、不易測(cè)量等缺點(diǎn)。后來，在發(fā)光系統(tǒng)中加入增強(qiáng)發(fā)光劑，以增強(qiáng)發(fā)光信號(hào)，并在較長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)保持穩(wěn)定，便于重復(fù)測(cè)量，從而提高分析靈敏度和準(zhǔn)確性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種可用于沙門氏菌的CLEIA檢測(cè)試劑盒及利用該試劑盒檢測(cè)沙門氏菌的方法。該方法應(yīng)當(dāng)具有較高靈敏度，易于操作，檢測(cè)速度快，成本低廉，并可實(shí)現(xiàn)大通量同步檢測(cè)。
[0006]本發(fā)明所述的沙門氏菌的CLEIA檢測(cè)試劑盒包括沙門氏菌抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記沙門氏菌抗體和化學(xué)發(fā)光溶液；所述化學(xué)發(fā)光溶液中含有對(duì)碘苯酚、魯米諾和過氧化氫。
[0007]【具體實(shí)施方式】中，本發(fā)明的試劑盒所述的沙門氏菌抗體為羊或兔抗沙門氏菌抗體或沙門氏菌單克隆抗體。所述的辣根過氧化物酶標(biāo)記沙門氏菌抗體為用辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊或兔抗沙門氏菌抗體或沙門氏菌單克隆抗體。
[0008]另一【具體實(shí)施方式】中，化學(xué)發(fā)光溶液中所含對(duì)碘苯酚、魯米諾和過氧化氫的摩爾濃度分別為0.05?0.25mM、0.1?5mM和0.1?5mM。
[0009]本發(fā)明另一方面的目的在于提供一種沙門氏菌的CLEIA檢測(cè)方法，該方法利用上述檢測(cè)試劑盒，包括如下步驟:
[0010]①制備檢測(cè)樣品；
[0011 ] ②沙門氏菌抗體包被；
[0012]③使步驟①制備的樣品與步驟②所制備的包被的沙門氏菌抗體接觸，并加入辣根過氧化物酶標(biāo)記沙門氏菌抗體和化學(xué)發(fā)光溶液，反應(yīng)完成后，測(cè)定化學(xué)發(fā)光值并計(jì)算樣品中沙門氏菌含量。
[0013]具體地，本發(fā)明所述的沙門氏菌的CLEIA檢測(cè)方法是化學(xué)發(fā)光酶免疫檢測(cè)方法，該方法中以包被在96孔酶標(biāo)板上的沙門氏菌抗體作為捕獲抗體，以辣根過氧化物酶標(biāo)記的沙門氏菌抗體為檢測(cè)抗體，以對(duì)碘苯酚為增強(qiáng)劑的魯米諾-過氧化氫為化學(xué)發(fā)光溶液。其中所述的沙門氏菌抗體可以為單抗或多抗，優(yōu)選羊或兔抗沙門氏菌抗體或沙門氏菌單克隆抗體。所述的化學(xué)發(fā)光溶液中，對(duì)碘苯酚、魯米諾和過氧化氫的摩爾濃度分別為0.05?
0.25mM、0.1 ?5mM 和 0.1 ?5mM。分別優(yōu)選 0.15mM, 1.25mM, 2.5mM。
[0014]更進(jìn)一步，所述方法包括如下具體步驟:
[0015]①制備檢測(cè)樣品:
[0016]②包被捕獲抗體:將濃度為2 μ g/mL的沙門氏菌抗體按照100 μ I/孔加入96孔酶標(biāo)板中，于4°C冰箱中過夜包被，再用磷酸鹽洗液PBST洗滌3次，拍干，每孔用200 μ I封閉溶液于37°C恒溫箱中反應(yīng)I小時(shí)，磷酸鹽洗液PBST洗滌3次后將酶標(biāo)板拍干待用；
[0017]③樣品檢測(cè)
[0018]每孔加入100 μ I步驟①所制備的檢測(cè)樣品，37°C恒溫箱中反應(yīng)2小時(shí)，用PBST洗滌三次，拍干；將濃度為I μ g/mL的辣根過氧化物酶標(biāo)記的沙門氏菌檢測(cè)抗體，按照100 μ I/孔加入到96孔酶標(biāo)板中，放置37°C恒溫箱反應(yīng)I小時(shí)，用PBST洗滌三次，拍干；力口入100 μ I/孔化學(xué)發(fā)光液，反應(yīng)5min后，用多功能酶標(biāo)儀測(cè)定化學(xué)發(fā)光值，發(fā)光計(jì)數(shù)值直接相關(guān)于樣本中沙門氏菌的含量。
[0019]使用本發(fā)明所述的試劑盒及檢測(cè)，應(yīng)用了以碘苯酚為增強(qiáng)劑的魯米諾-過氧化氫為化學(xué)發(fā)光體系，利用雙抗體夾心模型免疫反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)定量樣本中的沙門氏菌含量，提高了檢測(cè)靈敏度。與ELISA測(cè)定法相比，靈敏度可顯著提高一個(gè)數(shù)量級(jí)以上，且操作簡(jiǎn)便、快捷、可高通量進(jìn)行，具有十分廣泛的應(yīng)用前景與開發(fā)價(jià)值?？梢栽谑称飞抽T氏菌污染的監(jiān)控中實(shí)現(xiàn)廣泛應(yīng)用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]本發(fā)明附圖1幅，為實(shí)施例中沙門氏菌靈敏度檢測(cè)試驗(yàn)結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0021]若無特殊說明，本部分所使用的主要試劑、儀器均由商業(yè)途徑獲得，主要商品來源包括:[0022]兔抗沙門氏菌抗體，Santa ;辣根過氧化物酶標(biāo)記的沙門氏菌抗體，Santa ；BSA (牛血清白蛋白)，Sigma ;對(duì)碘苯酹，Sigma ;魯米諾，Sigma ;過氧化氫，Sigma。
[0023]各種試劑的配制按照如下方法:
[0024]a.磷酸鹽緩沖液(PBS):用800mL蒸餾水溶解8g氯化鈉(NaCl)，0.2g氯化鉀(KCl )，1.44g磷酸氫二鈉(Na2HPO4)和0.24g磷酸二氫鉀(KH2PO4),用鹽酸(HCl)調(diào)節(jié)溶液的pH值至7.4，加水至1L，搖勻。
[0025]b.磷酸鹽洗液(PBST):用800mL蒸餾水溶解8g氯化鈉(NaCl)，0.2g氯化鉀(KCl)，1.44g磷酸氫二鈉(Na2HPO4)和0.24g磷酸二氫鉀(KH2PO4),用鹽酸(HCl)調(diào)節(jié)溶液的pH值至7.4，加水至1L，再加入200 μ L的表面活性劑Tween20，搖勻。
[0026]c.捕獲抗體:用PBS稀釋使溶液中兔抗沙門氏菌抗體重量百分比濃度為2 μ g/mL。
[0027]d.辣根過氧化物酶標(biāo)記的檢測(cè)抗體:用PBS稀釋使溶液中辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗沙門氏菌抗體重量百分比濃度為I μ g/mL。
[0028]e.封閉溶液:用雙蒸水稀釋使溶液中BSA(牛血清白蛋白)重量百分比濃度為2%。
[0029]f.0.1M的Tris-HCl緩沖液:用800mL雙蒸水溶解12.1g三羥甲基氨基甲烷(Tris)，用鹽酸(HCl)調(diào)節(jié)溶液的pH值至8.5，加水至1L，搖勻。
[0030]g.化學(xué)發(fā)光液:用0.1M的Tris-HCl緩沖液稀釋使溶液中對(duì)碘苯酚溶液的摩爾濃度為0.05?0.25mM，魯米諾溶液的摩爾濃度為0.1?5mM，過氧化氫的摩爾濃度為0.1?5mM。
[0031]起始原料應(yīng)當(dāng)是疑似沙門氏菌污染的畜禽肉、蛋類、生鮮奶等材料。
[0032]下述非限制性實(shí)施例，其對(duì)本方法的建立及其應(yīng)用作進(jìn)一步的說明，可以使本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。
[0033]實(shí)施例1
[0034]檢測(cè)所使用的原料樣品為疑似沙門氏菌污染的牛肉樣品。
[0035]取濃度為2 μ g/mL沙門氏菌抗體按照100 μ I/孔加入96孔酶標(biāo)板中，于4°C冰箱中過夜包被，再用磷酸鹽洗液PBST洗滌3次，拍干，每孔用200 μ I封閉溶液于37°C恒溫箱中反應(yīng)I小時(shí)，磷酸鹽洗液PBST洗滌3次后將酶標(biāo)板拍干待用；
[0036]每孔加入100μ I待檢測(cè)樣品，37°C恒溫箱中反應(yīng)2小時(shí)，用PBST洗滌三次，拍干；將濃度為I μ g/mL的辣根過氧化物酶標(biāo)記的沙門氏菌檢測(cè)抗體，按照100 μ I/孔加入到96孔酶標(biāo)板中，放置37°C恒溫箱反應(yīng)I小時(shí)，用PBST洗滌三次，拍干；加入100 μ I/孔化學(xué)發(fā)光液，反應(yīng)5min后，用多功能酶標(biāo)儀測(cè)定化學(xué)發(fā)光值，發(fā)光計(jì)數(shù)值直接相關(guān)于樣本中沙門氏菌的含量。所述化學(xué)發(fā)光液中含有對(duì)碘苯酚溶液的摩爾濃度為0.15mmol/L，魯米諾溶液的摩爾濃度為1.25mM，過氧化氫的摩爾濃度為2.5mM。
[0037]實(shí)施例2
[0038]按照實(shí)施例1的方法檢測(cè)疑似沙門氏菌污染的牛肉樣品。
[0039]除將碘苯酚濃度分別設(shè)定為0.05mM, 0.1mM, 0.15mM, 0.25mM和0.5mM ;其他組分濃度不變，經(jīng)化學(xué)發(fā)光酶免疫分析測(cè)定，考察對(duì)碘苯酚濃度變化對(duì)化學(xué)發(fā)光液發(fā)光性能的影響。檢測(cè)結(jié)果如下表所示:
[0040][0041]
【權(quán)利要求】
1.沙門氏菌的CLEIA檢測(cè)試劑盒，包括沙門氏菌抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記沙門氏菌抗體和化學(xué)發(fā)光溶液； 所述化學(xué)發(fā)光溶液中含有對(duì)碘苯酚、魯米諾和過氧化氫。
2.權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的沙門氏菌抗體為羊或兔抗沙門氏菌抗體或沙門氏菌單克隆抗體。
3.權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的辣根過氧化物酶標(biāo)記沙門氏菌抗體為用辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊或兔抗沙門氏菌抗體或沙門氏菌單克隆抗體。
4.權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的化學(xué)發(fā)光溶液中，對(duì)碘苯酚、魯米諾和過氧化氫!的摩爾濃度分別為0.05~0.25mM、0.1~5mM和0.1~5mM。
5.權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于所述的化學(xué)發(fā)光溶液中，對(duì)碘苯酚、魯米諾和過氧化氫的摩爾濃度分別為0.15mM, 1.25mM和2.5mM。
6.沙門氏菌的CLEIA檢測(cè)方法，使用權(quán)利要求1所述的試劑盒，包括如下步驟: ①制備檢測(cè)樣品； ②沙門氏菌抗體包被； ③使步驟①制備的樣品與步驟②所制備的包被的沙門氏菌抗體接觸，并加入辣根過氧化物酶標(biāo)記沙門氏菌抗體和化學(xué)發(fā)光溶液，反應(yīng)完成后，測(cè)定化學(xué)發(fā)光值并計(jì)算樣品中沙門氏菌含量。
7.權(quán)利要求6所述的沙門氏菌的CLEIA檢測(cè)方法，其特征在于所述的包被捕獲抗體包括如下步驟:將濃度為2 μ g/mL的沙門氏菌抗體按照100 μ I/孔加入96孔酶標(biāo)板中，于4°C冰箱中過夜包被，再用磷酸鹽洗液PBST洗滌3次，拍干，每孔用200 μ I封閉溶液于37°C恒溫箱中反應(yīng)I小時(shí)，磷酸鹽洗液PBST洗滌3次后將酶標(biāo)板拍干待用。
8.權(quán)利要求6所述的沙門氏菌的CLEIA檢測(cè)方法，其特征在于所述的步驟③中辣根過氧化物酶標(biāo)記沙門氏菌抗體濃度為I μ g/mL。
【文檔編號(hào)】G01N33/577GK103513036SQ201310320908
【公開日】2014年1月15日 申請(qǐng)日期:2013年7月29日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月29日
【發(fā)明者】徐靜, 曹際娟, 鄒明強(qiáng), 李錦豐, 房芳 申請(qǐng)人:徐靜, 曹際娟, 鄒明強(qiáng), 李錦豐, 房芳