熒光定量檢測單增李斯特菌免疫層析試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種熒光定量檢測單增李斯特菌免疫層析試劑盒，該試劑盒包括試紙條、免疫磁珠和熒光標(biāo)記液，所述試紙條的檢測區(qū)包被有單增李斯特菌單克隆抗體或多克隆抗體，質(zhì)控區(qū)包被有抗兔IgG抗體；所述免疫磁珠表面偶聯(lián)有單增李斯特菌單克隆抗體；所述熒光標(biāo)記液中含有熒光膠乳標(biāo)記單增李斯特菌單克隆抗體或多克隆抗體和熒光膠乳標(biāo)記兔IgG抗體。本發(fā)明結(jié)合了磁珠富集樣本技術(shù)和免疫層析熒光定量檢測技術(shù)，利用免疫磁珠對檢測樣本中的單增李斯特菌進(jìn)行了富集濃縮后，把目標(biāo)物洗脫出來，再利用熒光免疫層析技術(shù)進(jìn)行定量檢測，與單純的熒光定量層析檢測試劑盒或者一般的膠體金檢測方法等相比，大大提高了檢測效率。
【專利說明】熒光定量檢測單增李斯特菌免疫層析試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)檢驗領(lǐng)域，具體地說，本發(fā)明涉及一種熒光定量檢測單增李斯特 菌免疫層析試劑盒。

【背景技術(shù)】
[0002] 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌（Listeria Monocytogenes)是一種人畜共患的食源性 致病菌，簡稱單增李斯特菌。單增李斯特菌是一種革蘭氏陽性短桿菌，不產(chǎn)芽孢，臨床主要 表現(xiàn)為敗血癥、腦膜炎等，尤其易感染孕婦、新生兒、老年人等免疫力低下的人群和免疫缺 陷病人，孕婦感染后可引發(fā)菌血癥導(dǎo)致早產(chǎn)、死嬰等。其發(fā)病率雖不高，但致死率可高達(dá) 209T30%。它在自然界廣泛分布，蔬菜、乳制品、海產(chǎn)品、肉類和禽類等食品中都已證實是李 斯特菌的傳播載體，它可在4°C的環(huán)境中生長繁殖，是冷藏食品威脅人類健康的主要病原菌 之一。
[0003] 目前，食品中單增李斯特菌的檢測主要有三大技術(shù)手段，分別是傳統(tǒng)的分離培養(yǎng) 與鑒定技術(shù)、分子生物學(xué)檢測技術(shù)、和免疫學(xué)檢測技術(shù)。傳統(tǒng)檢測方法首先對樣品進(jìn)行增菌 處理后，分離純化出可疑微生物，進(jìn)一步對可疑菌落做生化反應(yīng)實驗、溶血實驗、動物實驗 及典型運動等鑒定，被確定為李斯特菌后進(jìn)一步進(jìn)行血清分型。我國檢測單增李斯特菌方 法主要有國標(biāo)GB 4789. 30-2010和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SNT 0184. 1-2005。傳統(tǒng)檢驗方法中，前增菌處 理是不可或缺的實驗步驟，這些增菌方法耗時不一，但至少都需要20小時，且后續(xù)鑒定程 序復(fù)雜，不能夠適應(yīng)當(dāng)今社會快速、準(zhǔn)確、靈敏、特異檢測微生物的要求。
[0004] 以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction, PCR)技術(shù)為代表的分子生物 學(xué)技術(shù)在實際應(yīng)用中也存在一些問題，如普通聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)技術(shù)需要專門的儀 器，而且存在容易交叉污染，造成假陽性及過程煩瑣的缺點。而熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (real time PCR)技術(shù)雖較好解決了交叉污染的問題，并簡化了操作流程，但需更復(fù)雜的定 量檢測儀器，不適用于現(xiàn)場快速檢測。免疫學(xué)方法是基于抗原抗體特異性反應(yīng)而建立起來 的一種檢測方法，具有快速、靈敏、特異、結(jié)果易于判斷等特點。目前，單增李斯特菌的免疫 學(xué)檢測法主要有酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA)、酶聯(lián)熒光免疫檢測系統(tǒng)等，其中應(yīng)用最為廣泛的 是ELISA法，但其操作過程需要專業(yè)人員進(jìn)行檢測，操作步驟復(fù)雜，且檢測時間較長，一般 需18~24小時。 免疫層析技術(shù)是出現(xiàn)于80年代初期的一種獨特的免疫分析方式，免疫層析技術(shù)常見 的標(biāo)記物有膠體金、膠乳顆粒、膠體硒、明膠等，運用最成功的標(biāo)記物為膠體金。膠體金免疫 層析技術(shù)不需要特殊大型設(shè)備，從而具有操作簡便、快速靈敏的優(yōu)點，是一種適用于現(xiàn)場快 速檢測的方法。但也存在以下不足之處導(dǎo)致無法實現(xiàn)準(zhǔn)確的定量檢測： (1)膠體金標(biāo)記過程是靜電吸附過程，是一種物理吸附，穩(wěn)定性較差，往往造成已標(biāo)記 上的蛋白分子又再次脫落。
[0005] (2)顯色后只能是單一的顏色--紫紅色，不能根據(jù)不同的品種或不同要求變化 顏色。
[0006] (3)樣本濃度較低，收集時比較分散，濃度比較低，檢測靈敏度不高。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是針對上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種單增李斯特菌熒光膠乳免疫 層析檢測試劑盒及制備方法。本發(fā)明的試劑盒檢測特異性強，靈敏度高，檢測速度快，可實 現(xiàn)定量檢測。
[0008] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案： 一種熒光定量檢測單增李斯特菌的免疫層析試劑盒，該試劑盒包括試紙條、免疫磁珠 和熒光標(biāo)記液，所述試紙條包含樣品墊、硝酸纖維素包被膜、吸水紙、聚乙烯塑料底板，順次 搭接粘貼；所述硝酸纖維素包被膜包括檢測區(qū)（T區(qū)）和質(zhì)控區(qū)（C區(qū));所述檢測區(qū)包被有單 增李斯特菌單克隆抗體或多克隆抗體，所述質(zhì)控區(qū)包被抗兔IgG抗體；所述免疫磁珠表面 偶聯(lián)有單增李斯特菌單克隆抗體；所述熒光標(biāo)記液中含有熒光膠乳標(biāo)記單增李斯特菌單克 隆抗體或多克隆抗體和熒光膠乳標(biāo)記兔IgG抗體。
[0009] 優(yōu)選地，所述硝酸纖維素包被膜檢測區(qū)（T區(qū))，單增李斯特菌單克隆抗體或多克隆 抗體的包被液濃度為〇. 2?4 mg/mL，用量為90 ML/27?35cm。
[0010] 優(yōu)選地，所述硝酸纖維素包被膜質(zhì)控區(qū)（c區(qū))，抗兔IgG抗體的包被液濃度為 0.2?4 mg/mL，用量為 90 ML/27?35cm。
[0011] 優(yōu)選地，所述磁珠為微米級別的羧基磁珠，使用碳二亞胺（EDC)和N-羥基琥珀酰 亞胺（NHS)共價交聯(lián)的方式將單增李斯特菌單克隆抗體標(biāo)記在磁珠上形成免疫磁珠。
[0012] 優(yōu)選地，所述熒光標(biāo)記液中的熒光膠乳標(biāo)記單增李斯特菌單克隆抗體或多克隆抗 體的濃度為0. 2~5呢/mL，熒光膠乳標(biāo)記兔IgG抗體的濃度為0. 2~5呢/mL。使用時，采用 相同的濃度使檢測效果更好。所述熒光標(biāo)記液的激發(fā)波長（Ex)為3KT550 nm，發(fā)射波長 (Em)為340?620 nm。所述突光膠乳含有突光素，直徑范圍為0. lMnTlMm。
[0013] 本發(fā)明所述的一種單增李斯特菌的免疫層析試紙條的檢測原理是雙抗夾心法，先 將經(jīng)過活化的免疫磁珠加入到樣本,將樣本中的目標(biāo)抗原吸附濃縮,去除上清液后進(jìn)行洗 脫，使目標(biāo)抗原和磁珠分離；將濃縮后樣本和直徑范圍〇. 的免疫突光膠乳微球液 體混合(免疫熒光膠乳微球已經(jīng)與單增李斯特菌單克隆抗體或多克隆抗體偶聯(lián))，當(dāng)此熒光 膠乳標(biāo)記的單增李斯特菌單克隆抗體或多克隆抗體與檢測樣本中足夠的單增李斯特菌結(jié) 合形成復(fù)合物，該復(fù)合物在層析作用下移動至包被膜的檢測區(qū)，在包被膜的檢測區(qū)包被有 能與單增李斯特菌結(jié)合的單克隆抗體或多克隆抗體，該抗體結(jié)合在單增李斯特菌的另一表 位上，形成雙抗體夾心的復(fù)合物。利用熒光定量光譜監(jiān)測系統(tǒng)，由光源激發(fā)包被膜上檢測區(qū) T線處聚積的熒光膠乳，熒光膠乳發(fā)射出的熒光被相應(yīng)的檢測系統(tǒng)接收，通過光電變換將光 信號轉(zhuǎn)化成電信號，并由自動控制系統(tǒng)將信號輸出，顯示出最終的定量結(jié)果。
[0014] 本發(fā)明所述的單增李斯特菌熒光免疫層析試劑盒與PCR方法、ELISA方法相比，具 有 操作簡便、適合不同數(shù)量樣本檢測和快速（2小時左右即可有結(jié)果）等優(yōu)點；與膠體金 免疫層析試紙條和一般的熒光試紙條相比，本發(fā)明具有靈敏度更高，且可實現(xiàn)定量檢測等 優(yōu)點。
[0015] 本發(fā)明所述的單增李斯特菌熒光免疫層析試劑盒，采用熒光標(biāo)記液與樣本預(yù)先混 合的方法，使反應(yīng)與信號釋放更加均一，與其他層析法相比，其批量生產(chǎn)的精密度和準(zhǔn)確度 達(dá)到最好效果。配合相應(yīng)的熒光定量檢測儀，僅需10秒時間即可對單增李斯特菌做出靈敏 的定量檢測結(jié)果輸出。
[0016] 本發(fā)明結(jié)合了磁珠富集樣本技術(shù)和免疫層析熒光定量檢測技術(shù)，利用免疫磁珠對 檢測樣本中的單增李斯特菌進(jìn)行了富集濃縮后再進(jìn)行定量檢測，與單純的熒光定量層析檢 測試劑盒相比，大大提高了檢測效率。
[0017]

【專利附圖】

【附圖說明】
[0018] 圖1是本發(fā)明的所述熒光定量檢測單增李斯特菌層析試劑盒中試紙條的結(jié)構(gòu)示 意圖； 圖2是本發(fā)明的所述熒光定量檢測單增李斯特菌層析試劑盒中試紙條的結(jié)構(gòu)示意圖； 圖3是本發(fā)明的所述熒光定量檢測單增李斯特菌層析試劑盒中用于放置試紙條的檢 測卡的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0019] 附圖標(biāo)記： 1、樣品墊；2、硝酸纖維素包被膜；3、檢測區(qū)（T線);4、質(zhì)控區(qū)（C線);5、吸水紙；6、底板； 7、卡外殼；8、顯窗；9、加樣孔。
[0020]

【具體實施方式】
[0021] 實施例一：檢測牛肉樣本中單增李斯特菌的熒光免疫層析試劑盒 在該實施例中，熒光定量檢測單增李斯特菌、免疫層析試劑盒，包括試紙條、免疫磁珠 溶液和熒光標(biāo)記液。
[0022] 其中，試紙條由樣品墊、包括檢測區(qū)（T區(qū)）和質(zhì)控區(qū)（C區(qū)）的纖維素包被膜、吸水 紙按試紙條的常規(guī)方法依次相互搭接地粘貼在底板上。
[0023] 在該實施例中，包被膜的檢測區(qū)T線包被有濃度為0. 3mg/ml，用量為 90 iil/27-35Cm的單增李斯特菌單克隆抗體或多克隆抗體。在包被膜的質(zhì)控區(qū)C線包被有 濃度為〇. 3mg/ml，用量為90 iil/27-35Cm的羊抗兔IgG抗體，用于結(jié)合熒光標(biāo)記的兔IgG抗 體，用于檢測試紙條的有效性。
[0024] (1)檢測牛肉樣本中單增李斯特菌的免疫磁珠的制備 磁珠活化：取100 U L羧基修飾磁珠至I. 5mL離心管中，用等體積一水嗎啉乙磺酸溶液 (MES，pH5,25mM)洗滌2次，用磁力架分離后吸出上清。用MES (pH5,25mM)分別配制50mg/ mL的碳二亞胺（EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺（NHS)溶液，向磁珠中分別加入50 ii L EDC和NHS 溶液，置于混勻儀上保持磁珠懸浮，室溫活化30分鐘，離心管置于磁力架上磁分離，移除上 清，加入100 UL MES (pH5,25mM)，重新洗滌2次，最后移除上清。 磁珠與抗體偶聯(lián)：將60 ii g單增李斯特菌單克隆抗體與活化的磁珠混合，用MES(pH5， 25mM)調(diào)節(jié)總體積至100 ii L，在旋轉(zhuǎn)混合器上室溫反應(yīng)30分鐘。加入含有1% (w/v)牛血 清白蛋白BSA的PBS溶液，封閉反應(yīng)30分鐘。取下離心管置于磁力架上磁分離，移除上清， 磁珠用100 U L PBS洗滌四次。加入以含0. 02% (w/v)疊氮化鈉NaN3、l% (w/v)牛血清白 蛋白BSA的PBS作為保存液，4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0025] (2)熒光標(biāo)記液的制備 熒光膠乳的共價活化：超聲波處理膠乳微球體30秒后，調(diào)節(jié)膠乳微球體濃度為 I. 0 X 1012/mL，15000rpm離心10分鐘，離心后收集沉淀物用蒸餾水溶解，并用200W超聲波 分散30秒；先加入50 ii L的50mg/mL EDC，振蕩混勻，再加入50 ii L的50mg/mL N-羥基硫 代琥珀酰亞胺，振蕩混勻，室溫下平衡30分鐘后在15000rpm離心10分鐘，沉淀用50mM檸 檬酸緩沖液溶解，靜置于4°C冰箱。
[0026] 熒光膠乳標(biāo)記蛋白的制備：將活化后的熒光膠乳于200W超聲波處理30秒，按照 1〇〇呢蛋白/100ML熒光膠乳的比例加入待標(biāo)記的單增李斯特菌單克隆抗體和兔IgG抗體， 混勻室溫攪拌反應(yīng)2小時，離心洗滌，每次15000rpm下離心10分鐘，共洗滌3次，沉淀用 PBS-TBN溶解并100W超聲波處理30秒，然后用PBS-TBN稀釋至離心前體積，4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0027] 將上述制備好的熒光膠乳微粒標(biāo)記的單增李斯特菌單克隆抗體和熒光膠乳微粒 標(biāo)記兔IgG抗體用抗體稀釋液按1:100、1:1000比例稀釋混合，分裝備用。
[0028] (3)定量檢測牛肉樣本中單增李斯特菌 以無菌操作將IOg牛肉樣本放于含有90mL滅菌生理鹽水均質(zhì)器中，置均質(zhì)器中以 8000r/min的速度處理1分鐘后過濾，做成1:10的均質(zhì)稀釋液。取ImL均質(zhì)液加入30ML 免疫磁珠富集，將富集捕獲單增李斯特菌的免疫磁珠用80MLPBS重懸，60°C水浴溫育15分 鐘后，再用磁性分離架分離出免疫磁珠，保留含有單增李斯特菌的上清液，吸取50ML的樣 本與熒光標(biāo)記液等量混合，混勻1分鐘后吸取80ML，往水平放置檢測卡加樣孔加入，避免帶 氣泡，開始層析反應(yīng)。反應(yīng)15分鐘，由廣州萬孚生物技術(shù)股份有限公司自主研制的"飛測" 熒光檢測儀(型號：WF-〇901/l型）讀取測試結(jié)果。
[0029] 實施例二：檢測牛奶樣本中單增李斯特菌的熒光免疫層析試劑盒的制備 在該實施例中，熒光定量檢測單增李斯特菌免疫層析試劑盒，包括試紙條、免疫磁珠溶 液和熒光標(biāo)記液。
[0030] 其中，試紙條由樣品墊、包括檢測區(qū)（T區(qū)）和質(zhì)控區(qū)（C區(qū)）的纖維素包被膜、吸水 紙按試紙條的常規(guī)方法依次相互搭接地粘貼在底板上。
[0031] 在該實施例中，包被膜的檢測區(qū)T線包被有濃度為2. 5mg/ml，用量為 90 iil/27-35Cm的單增李斯特菌單克隆抗體或多克隆抗體。在包被膜的質(zhì)控區(qū)C線包被有 濃度為2. 5mg/ml，用量為90 iil/27-35Cm的羊抗兔IgG抗體，用于結(jié)合熒光標(biāo)記的兔IgG抗 體，用于檢測試紙條的有效性。
[0032] (1)檢測牛奶樣本中單增李斯特菌免疫磁珠的制備 磁珠活化：取100 y L羧基修飾磁珠至I. 5mL離心管中，用等體積一水嗎啉乙磺酸溶液 (MES，pH5,25mM)洗滌2次，用磁力架分離后吸出上清。用MES (pH5,25mM)分別配制50mg/ mL的碳二亞胺（EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺（NHS)溶液，向磁珠中分別加入50 ii L EDC和NHS 溶液，置于混勻儀上保持磁珠懸浮，室溫活化30分鐘，離心管置于磁力架上磁分離，移除上 清，加入100 UL MES (pH5,25mM)，重新洗滌2次，最后移除上清。 磁珠與抗體偶聯(lián)：將60 ii g單增李斯特菌單克隆抗體與活化的磁珠混合，用MES(pH5， 25mM)調(diào)節(jié)總體積至100 ii L，在旋轉(zhuǎn)混合器上室溫反應(yīng)30分鐘。加入含有1% (w/v)牛血 清白蛋白BSA的PBS溶液，封閉反應(yīng)30分鐘。取下離心管置于磁力架上磁分離，移除上清， 磁珠用100 U L PBS洗滌四次。加入以含0. 02% (w/v)疊氮化鈉NaN3、l% (w/v)牛血清白 蛋白BSA的PBS作為保存液，4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0033] (2)熒光標(biāo)記液的制備 熒光膠乳的共價活化：超聲波處理膠乳微球體30秒后，調(diào)節(jié)膠乳微球體濃度為 I. 0 X 1013/mL，15000rpm離心10分鐘，離心后收集沉淀物用蒸餾水溶解，并用200W超聲波 分散30秒；先加入50 ii L的50mg/mL EDC，振蕩混勻，再加入50 ii L的50mg/mL N-羥基硫 代琥珀酰亞胺，振蕩混勻，室溫下平衡30分鐘后在15000rpm離心10分鐘，沉淀用50mM檸 檬酸緩沖液溶解，靜置于4°C冰箱。
[0034] 熒光膠乳標(biāo)記蛋白的制備：將活化后的熒光膠乳于200W超聲波處理30秒，按照 80呢蛋白/100ML熒光膠乳的比例加入待標(biāo)記的單增李斯特菌單克隆抗體和兔IgG抗體， 混勻室溫攪拌反應(yīng)2小時，離心洗滌，每次15000rpm下離心10分鐘，共洗滌3次，沉淀用 PBS-TBN溶解并100W超聲波處理30秒，然后用PBS-TBN稀釋至離心前體積，4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0035] 將上述制備好的熒光膠乳微粒標(biāo)記的單增李斯特菌單克隆抗體和熒光膠乳微粒 標(biāo)記兔IgG抗體用抗體稀釋液按1:50、1:1000比例稀釋混合，分裝備用。
[0036] (3)定量檢測牛奶樣本中單增李斯特菌 以無菌操作將IOmL牛奶樣本放于90mL滅菌生理鹽水中，8000r/min的速度離心去除上 層脂肪層，做成1:10的稀釋液。取ImL均質(zhì)液加入30ML免疫磁珠富集，將富集捕獲單增李 斯特菌的免疫磁珠用80MLPBS重懸，60°C水浴溫育15分鐘后，再用磁性分離架分離出免疫 磁珠，保留含有單增李斯特菌的上清液，吸取50ML的樣本與熒光標(biāo)記液等量混合，混勻1分 鐘后吸取80ML，往水平放置檢測卡加樣孔加入，避免帶氣泡，開始層析反應(yīng)。反應(yīng)15分鐘， 由廣州萬孚生物技術(shù)股份有限公司自主研制的"飛測"熒光檢測儀(型號：WF-0901/1型）讀 取測試結(jié)果。
[0037] 實施例三：檢測火腿腸樣本中單增李斯特菌的熒光免疫層析試劑盒的制備 在該實施例中，熒光定量檢測單增李斯特菌免疫層析試劑盒，包括試紙條、免疫磁珠溶 液和熒光標(biāo)記液。
[0038] 其中，試紙條由樣品墊、包括檢測區(qū)（T區(qū)）和質(zhì)控區(qū)（C區(qū)）的纖維素包被膜、吸水 紙按試紙條的常規(guī)方法依次相互搭接地粘貼在底板上。
[0039] 在該實施例中，包被膜的檢測區(qū)T線包被有濃度為3. 5mg/ml，用量為 90 iil/27-35Cm的單增李斯特菌單克隆抗體或多克隆抗體。在包被膜的質(zhì)控區(qū)C線包被有 濃度為3. 5mg/ml，用量為90 iil/27-35Cm的羊抗兔IgG抗體，用于結(jié)合熒光標(biāo)記的兔IgG抗 體，用于檢測試紙條的有效性。
[0040] (1)檢測火腿腸樣本中單增李斯特菌免疫磁珠的制備 磁珠活化：取100 y L羧基修飾磁珠至I. 5mL離心管中，用等體積一水嗎啉乙磺酸溶液 (MES，pH5,25mM)洗滌2次，用磁力架分離后吸出上清。用MES (pH5,25mM)分別配制50mg/ mL的碳二亞胺（EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺（NHS)溶液，向磁珠中分別加入50 ii L EDC和NHS 溶液，置于混勻儀上保持磁珠懸浮，室溫活化30分鐘，離心管置于磁力架上磁分離，移除上 清，加入100 UL MES (pH5,25mM)，重新洗滌2次，最后移除上清。 磁珠與抗體偶聯(lián)：將60 ii g單增李斯特菌單克隆抗體與活化的磁珠混合，用MES(pH5， 25mM)調(diào)節(jié)總體積至100 ii L，在旋轉(zhuǎn)混合器上室溫反應(yīng)30分鐘。加入含有1% (w/v)牛血 清白蛋白BSA的PBS溶液，封閉反應(yīng)30分鐘。取下離心管置于磁力架上磁分離，移除上清， 磁珠用100 U L PBS洗滌四次。加入以含0. 02% (w/v)疊氮化鈉NaN3、l% (w/v)牛血清白 蛋白BSA的PBS作為保存液，4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0041] (2)熒光標(biāo)記液的制備 熒光膠乳的共價活化：超聲波處理膠乳微球體30秒后，調(diào)節(jié)膠乳微球體濃度為 I. OX 1013/mL，15000rpm離心10分鐘，離心后收集沉淀物用蒸餾水溶解，并用200W超聲波 分散30秒；先加入50 ii L的50mg/mL EDC，振蕩混勻，再加入50 ii L的50mg/mL N-羥基硫 代琥珀酰亞胺，振蕩混勻，室溫下平衡30分鐘后在15000rpm離心10分鐘，沉淀用50mM檸 檬酸緩沖液溶解，靜置于4°C冰箱。
[0042] 熒光膠乳標(biāo)記蛋白的制備：將活化后的熒光膠乳于200W超聲波處理30秒，按照 80呢蛋白/100ML熒光膠乳的比例加入待標(biāo)記的單增李斯特菌單克隆抗體和兔IgG抗體， 混勻室溫攪拌反應(yīng)2小時，離心洗滌，每次15000rpm下離心10分鐘，共洗滌3次，沉淀用 PBS-TBN溶解并100W超聲波處理30秒，然后用PBS-TBN稀釋至離心前體積，4°C保存?zhèn)溆谩?[0043] 將上述制備好的熒光膠乳微粒標(biāo)記的單增李斯特菌單克隆抗體和熒光膠乳微粒 標(biāo)記兔IgG抗體用抗體稀釋液按1:50、1:1000比例稀釋混合，分裝備用。
[0044] (3)定量檢測火腿腸樣本中單增李斯特菌 以無菌操作將IOg火腿腸樣本放于含有90mL滅菌生理鹽水均質(zhì)袋中，置均質(zhì)器中以 8000r/min的速度處理1分鐘后過濾，做成1:10的均質(zhì)稀釋液。取ImL均質(zhì)液加入30ML免 疫磁珠富集，將富集捕獲單增李斯特菌的免疫磁珠用100MLPBS重懸，60°C水浴溫育15分 鐘后，再用磁性分離架分離出免疫磁珠，保留含有單增李斯特菌的上清液，吸取50ML的樣 本與熒光標(biāo)記液等量混合，混勻1分鐘后吸取80ML，往水平放置檢測卡加樣孔加入，避免帶 氣泡，開始層析反應(yīng)。反應(yīng)15分鐘，由廣州萬孚生物技術(shù)股份有限公司自主研制的"飛測" 熒光檢測儀(型號：WF-0901/1型）讀取測試結(jié)果。
[0045] 本發(fā)明所述的單增李斯特菌免疫層析檢測試劑盒，在具體實例中，半成品通過以下工 序組裝而成：由樣品墊、包被膜、吸水紙順次搭接粘貼在底板上，構(gòu)成試紙條，可再用現(xiàn)有技 術(shù)中的卡外殼7 (如圖3所示)，固定成檢測卡，所述卡外殼涂有可供熒光儀掃描識別的產(chǎn)品 信息噴碼。與寫入信息的ID芯片(現(xiàn)有技術(shù)中的ID芯片采用的定量計算公式為檢測信號 值與計算濃度的半對數(shù)直線方程式或其他計算方程式，可自動進(jìn)行結(jié)果判定)。分裝好的免 疫磁珠、熒光標(biāo)記液和其他配件組裝成試劑盒。
[0046] 本發(fā)明所述熒光定量檢測單增李斯特菌的免疫層析試劑盒，在使用時，組裝在由塑料 上殼和塑料下殼扣合而成的塑料卡外殼(檢測卡)中，塑料上殼設(shè)有兩個開孔，加樣孔9和顯 示窗8,加樣孔9對應(yīng)于所述的熒光定量檢測單增李斯特菌的免疫層析試紙條樣品墊，結(jié)果 顯示窗8對應(yīng)于所述熒光定量檢測單增李斯特菌的免疫層析試紙條的檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)，該 熒光定量檢測單增李斯特菌的免疫層析試紙條可以從該塑料外殼中取出。
[0047] 本發(fā)明通過對實施例中的200例樣本進(jìn)行檢測，同時用膠體金免疫層析試劑盒、酶聯(lián) 免疫吸附（ELISA)試劑盒和環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增（LAMP)試劑盒分別進(jìn)行檢測比較。目前，市面 上銷售的應(yīng)用了膠體金、ELISA、LAMP技術(shù)檢測單增李斯特菌的試劑盒只能對樣本中的目標(biāo) 檢測物進(jìn)行定性或半定量檢測，相比之下，本發(fā)明結(jié)合了免疫磁珠富集技術(shù)和熒光定量檢 測技術(shù)，可對樣本進(jìn)行精確定量?，F(xiàn)將該檢測效果比較如下：

【權(quán)利要求】
1. 一種熒光定量檢測單增李斯特菌免疫層析試劑盒，其特征是，所述試劑盒包括試紙 條、免疫磁珠和熒光標(biāo)記液；所述試紙條包含樣品墊、硝酸纖維素包被膜、吸水紙、聚乙烯塑 料底板，順次搭接粘貼；所述硝酸纖維素包被膜包括檢測區(qū)（T區(qū)）和質(zhì)控區(qū)（C區(qū)）；所述檢 測區(qū)包被有單增李斯特菌單克隆抗體或多克隆抗體，所述質(zhì)控區(qū)包被抗兔IgG抗體；所述 免疫磁珠表面偶聯(lián)有單增李斯特菌單克隆抗體；所述熒光標(biāo)記液中含有熒光膠乳標(biāo)記單增 李斯特困單克隆抗體或多克隆抗體和滅光I父乳標(biāo)記兔IgG抗體。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的熒光定量檢測單增李斯特菌免疫層析試劑盒，其特征是，所 述硝酸纖維素包被膜檢測區(qū)（T區(qū))，單增李斯特菌單克隆抗體或多克隆抗體的包被液濃度 為 0? 2 ?4 mg/mL，用量為 90 ML/27 ?35cm。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的熒光定量檢測單增李斯特菌免疫層析試劑盒，其特征是，所 述硝酸纖維素包被膜質(zhì)控區(qū)（C區(qū)),抗兔IgG抗體的包被液濃度為0. 2?4 mg/mL,用量為 90 ML/27 ?35cm。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項所述的熒光定量檢測單增李斯特菌免疫層析試劑盒，其 特征是，所述磁珠為微米級別的羧基磁珠，使用碳二亞胺（EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺（NHS) 共價交聯(lián)的方式將單增李斯特菌單克隆抗體標(biāo)記在磁珠上形成免疫磁珠。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項所述的熒光定量檢測單增李斯特菌免疫層析試劑盒，其 特征是，所述熒光標(biāo)記液中的熒光膠乳標(biāo)記單增李斯特菌單克隆抗體或多克隆抗體的濃度 為0. 2~5吒/mL，熒光膠乳標(biāo)記兔IgG抗體的濃度為0. 2?5吒/mL。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的熒光定量檢測單增李斯特菌免疫層析試劑盒，其特征是，所 述熒光標(biāo)記液的激發(fā)波長（Ex)為310?550 nm，發(fā)射波長（Em)為340?620 nm;所述熒 光膠乳含有熒光素，直徑范圍為〇. lMm?lMm。
【文檔編號】G01N33/12GK104374916SQ201310354147
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2013年8月15日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月15日
【發(fā)明者】王繼華, 唐時幸, 劉曉云 申請人:廣州萬孚生物技術(shù)股份有限公司