熒光定量檢測沙門氏菌免疫層析試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種熒光定量檢測沙門氏菌免疫層析試劑盒，所述試劑盒包括試紙條、免疫磁珠和熒光標記液，所述試紙條由樣品墊、硝酸纖維素包被膜、吸水紙順次搭接粘貼在聚乙烯塑料底板上構成；所述硝酸纖維素包被膜的檢測區(qū)包被有沙門氏菌單克隆抗體或多克隆抗體，質控區(qū)包被有抗兔IgG；所述免疫磁珠表面偶聯(lián)有沙門氏菌單克隆抗體；所述熒光標記液中含有熒光膠乳標記沙門氏菌單克隆抗體或多克隆抗體和熒光膠乳標記兔IgG。本發(fā)明結合了磁珠技術和免疫層析熒光定量檢測技術，利用免疫磁珠對檢測樣本中的沙門氏菌進行富集濃縮后再定量檢測，與單純的熒光定量層析檢測試劑盒相比，大大提高了檢測效率。
【專利說明】熒光定量檢測沙門氏菌免疫層析試劑盒
[0001]

【技術領域】
[0002] 本發(fā)明屬于醫(yī)學檢驗領域，具體地說，本發(fā)明涉及一種熒光定量檢測沙門氏菌免 疫層析試劑盒。

【背景技術】
[0003] 食品是人類社會賴以生存和發(fā)展的物質基礎，且隨著食品安全事故頻發(fā)造成的極 其嚴重的人身和財產(chǎn)安全，食品安全成為了當今社會各界關注的焦點問題之一。
[0004] 沙門氏菌（Salmonella)是一種人畜共患的食源性致病菌。沙門氏菌屬廣泛分布于 自然界中，在人和動物中有廣泛的宿主。沙門氏菌污染肉類食物的概率很高，如家畜中豬、牛、 羊、貓、犬，家禽中雞、鴨、鵝等。動物源性食品是人類食物的重要組成部分。細菌性食物中毒 在動物源性食品中毒中最為常見，且其中由沙門氏菌引起的食物中毒屢居首位。由沙門氏 菌引起的食物中毒主要是由食用了受沙門氏菌污染的肉、蛋、奶等動物源性食品所引起。
[0005] 能引起食物中毒的沙門氏菌的菌種主要有豬霍亂沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、腸 炎沙門氏菌等，它們能產(chǎn)生耐熱毒素，在75°c經(jīng)Ih仍具有毒力，因而常引起人的食物 中毒。由于其在全球范圍內的危害性與廣泛性，世界各國學者進行了大量研究，以求建立一 種快速、準確、高靈敏度、易操作且能夠定量的沙門氏菌檢測技術。
[0006] 常見的相關檢測技術有：PCR，ELISA，LAMP，膠體金免疫層析法。
[0007] 聚合酶鏈式反應（PCR)技術，主要由高溫變性、低溫退火和適溫延伸三個步驟反 復的熱循環(huán)構成：即在高溫（95°C )下，待擴增的靶DNA雙鏈受熱變性成為兩條單鏈DNA 模板；而后在低溫（37 ~ 55°C )情況下，兩條人工合成的寡核苷酸引物與互補的單鏈DNA 模板結合，形成部分雙鏈；在Taq酶的最適溫度（72°C )下，以物3'端為合成的起點，以 單核苷酸為原料，沿模板以5'一 3'方向延伸，合成DNA新鏈。這樣，每一雙鏈的DNA模 板，經(jīng)過一次解鏈、退火、延伸三個步驟的熱循環(huán)后就成了兩條雙鏈DNA分子。如此反復進 行，每一次循環(huán)所產(chǎn)生的DNA均能成為下一次循環(huán)的模板，每一次循環(huán)都使兩條人工合成 的引物間的DNA特異區(qū)拷貝數(shù)擴增一倍，PCR產(chǎn)物得以2n的指數(shù)形式迅速擴增，經(jīng)過25 ?30個循環(huán)后，理論上可使基因擴增109倍以上，實際上一般可達106?107倍。具有特 異性強、敏感性高、操作簡便、快速高效等特點。
[0008] 酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA)，原理是包被抗體或抗原，直接加入酶標記的抗原或抗 體進行反應，可用于目的抗原或抗體的直接檢測。將ELISA方法應用于食品中沙門氏菌 的檢測，通過單克隆抗體大大降低了假陽性率。但ELISA方法的靈敏度較分子生物學方法 低，且必須經(jīng)過增菌篩選純培養(yǎng)步驟，因此難以在短時間內得到檢測結果。
[0009] 環(huán)介導等溫擴增技術（LAMP)是一種連續(xù)、恒溫、基于酶反應的新型核酸擴增方法， 其特點是針對靶基因的6個區(qū)域設計4條特異性引物，利用具有鏈置換活性的DNA聚合酶， 可在65°C等溫條件下擴增60 min，即可完成反應，將目的基因擴增109?1010倍。LAMP是 比分離培養(yǎng)更快速、靈敏的檢測技術。該技術用于檢測病原菌特異性強、靈敏度高，等溫高 效，整個擴增反應操作簡便、快捷，實驗裝置簡單、費用相對較低；但LAMP技術對試驗設計 的要求較高，需要設計的引物數(shù)目相對較多、結構復雜，需要考慮到靶序列的片段及莖環(huán) 結構等因素，在檢測高度變異的病原體時，實驗設計相對比較困難，在一次反應中只能檢測 一個病原體，而且陽性反應并不只呈現(xiàn)單條帶，而出現(xiàn)拖尾和一些低分子質量的帶，一旦 產(chǎn)生非特異性擴增，則不易鑒別。
[0010] 膠體金免疫層析技術（GICA)，是一種將膠體金標記技術、免疫檢測技術和層析分 析技術等多種方法有機結合在一起的固相標記免疫檢測技術，其原理是以條狀纖維層析材 料為固相，通過毛細作用使樣品溶液在層析條上泳動，并同時使樣品中的待測物與層析材 料上針對待測物的受體（抗原或抗體）發(fā)生高特異性、高親和性的免疫反應，層析過程中 免疫復合物被富集或截留在層析材料的一定區(qū)域（檢測帶），運用可目測的標記物（膠 體金）而得到直觀的實驗現(xiàn)象（顯色）。但這種方法中標記物的穩(wěn)定性較差，顏色單一， 靈敏度較低，受基質的背景干擾大，且只能定性檢測，不能做到精確定量。但該技術具有便 捷、快速、準確和無污染等特點被廣泛應用醫(yī)學檢測和臨床診斷，在病原體檢測方面，其敏 感性、特異性具有其他免疫學方法無可比擬的優(yōu)勢，且該方法無需特殊儀器設備，對檢測人 員的專業(yè)要求低，有良好的基層應用開發(fā)前景。
[0011] 沙門氏菌作為致病菌檢測的一項重要指標，在公共衛(wèi)生、食品衛(wèi)生、畜牧獸醫(yī)和出 入境檢驗檢疫中均有重要的意義。為探求快速、準確、高靈敏度、易操作且能夠定量的檢測 方法，世界各國學者進行了大量研究，從以傳統(tǒng)方法為基礎發(fā)展到以免疫學、分子生物學為 基礎的快速檢測方法，，并在實踐中不斷取得新進展。
[0012]


【發(fā)明內容】

[0013] 本發(fā)明的目的是針對上述現(xiàn)有技術的缺陷，提供一種熒光定量檢測沙門氏菌免疫 層析試劑盒。本發(fā)明的試劑盒檢測特異性強，靈敏度高，檢測速度快，可實現(xiàn)準確的定量檢測。
[0014] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了以下技術方案： 一種熒光定量檢測沙門氏菌的免疫層析試劑盒，該試劑盒包括試紙條、沙門氏菌單克 隆抗體-免疫磁珠和熒光標記液；所述試紙條由樣品墊、硝酸纖維素包被膜、吸水紙順次搭 接粘貼在聚乙烯塑料底板上構成；所述硝酸纖維素包被膜包括檢測區(qū)和質控區(qū)；所述檢測 區(qū)包被有沙門氏菌單克隆抗體或多克隆抗體，所述質控區(qū)包被抗兔IgG ;所述熒光標記液 中含有熒光膠乳標記沙門氏菌單克隆抗體或多克隆抗體和熒光膠乳標記兔IgG。
[0015] 所述沙門氏菌單克隆抗體-免疫磁珠偶聯(lián)物中的免疫磁珠為微米級別的羧基磁珠； 所述熒光標記液的激發(fā)波長（Ex)為310?550 nm，發(fā)射波長（Em)為340?620 nm。
[0016] 本發(fā)明所述的一種食源性沙門氏菌的免疫層析試紙條的檢測原理是雙抗夾心法， 將直徑范圍〇. IMflTlMffl的熒光膠乳微球與沙門氏菌單克隆抗體或多克隆抗體偶聯(lián)，當此熒 光膠乳標記的沙門氏菌單克隆抗體或多克隆抗體與檢測樣本中足夠的沙門氏菌抗原結合 形成復合物，該復合物在層析作用下移動至包被膜的檢測區(qū)，在包被膜的檢測區(qū)包被有能 與沙門氏菌抗原結合的單克隆抗體或多克隆抗體，該抗體結合在沙門氏菌抗原的另一表位 上，形成雙抗體夾心的復合物。利用熒光定量光譜監(jiān)測系統(tǒng)，由光源激發(fā)包被膜上檢測區(qū)T 線處聚積的熒光膠乳，熒光膠乳發(fā)射出的熒光被相應的檢測系統(tǒng)接收，通過光電變換將光 信號轉化成電信號，并由自動控制系統(tǒng)將信號輸出，顯示出最終的定量結果。
[0017] 本發(fā)明所述的食源性沙門氏菌熒光免疫層析試劑盒與PCR方法、ELISA方法相比， 具有操作簡便、適合不同數(shù)量樣本檢測且檢測速度快（2小時左右即可有結果）等優(yōu)點；與 膠體金免疫層析試紙條相比，本發(fā)明具有靈敏度更高，且可實現(xiàn)定量檢測等優(yōu)點。
[0018] 本發(fā)明所述的食源性沙門氏菌熒光定量檢測試劑盒，采用熒光標記液與樣本預先 混合的方法，使反應與信號釋放更加均一，與其他層析法相比，其批量生產(chǎn)的精密度和準確 度達到最好效果。配合相應的熒光定量檢測儀，僅需10秒時間即可對沙門氏菌做出靈敏的 定量檢測結果輸出。
[0019] 本發(fā)明結合了磁珠腹肌樣本技術和免疫層析熒光定量檢測技術，利用免疫磁珠對 檢測樣本中的沙門氏菌進行了富集濃縮后再進行定量檢測，與單純的熒光定量層析檢測試 劑盒相比，大大提高了檢測效率。
[0020]

【專利附圖】

【附圖說明】
[0021] 圖1是本發(fā)明的所述熒光定量檢測沙門氏菌層析試劑盒中試紙條的結構示意圖； 圖2是本發(fā)明的所述熒光定量檢測沙門氏菌層析試劑盒中試紙條的結構示意圖； 圖3是本發(fā)明的所述熒光定量檢測沙門氏菌層析試劑盒中用于放置試紙條的檢測卡 的結構示意圖。
[0022] 附圖標記： 1、樣品墊；2、硝酸纖維素包被膜；3、檢測區(qū)（T線);4、質控區(qū)（C線);5、吸水紙；6、底板； 7、卡外殼；8、顯窗；9、加樣孔。
[0023]

【具體實施方式】
[0024] 實施例一：檢測豬肉樣本中沙門氏菌的熒光免疫層析試劑盒 在該實施例中，熒光定量檢測沙門氏菌免疫層析試劑盒，包括試紙條、免疫磁珠溶液和 熒光標記液。
[0025] 其中，試紙條由樣品墊、包括檢測區(qū)（T區(qū)）和質控區(qū)（C區(qū)）的纖維素包被膜、吸水 紙按試紙條的常規(guī)方法依次相互搭接地粘貼在底板上。
[0026] 在該實施例中，包被膜的檢測區(qū)T線包被有濃度為0. 3mg/ml，用量為 90 iil/27-35Cm的沙門氏菌單克隆抗體或多克隆抗體。在包被膜的質控區(qū)C線包被有濃度 為0. 3mg/ml，用量為90iil/27-35Cm的羊抗兔IgG抗體，用于結合熒光標記的兔IgG抗體， 用于檢測試紙條的有效性。
[0027] (1)檢測豬肉樣本中沙門氏菌免疫磁珠的制備 磁珠活化：取100 U L羧基修飾磁珠至I. 5mL離心管中，用等體積一水嗎啉乙磺酸溶液 (MES，pH5,25mM)洗滌2次，用磁力架分離后吸出上清。用MES (pH5,25mM)分別配制50mg/ mL的碳二亞胺（EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺（NHS)溶液，向磁珠中分別加入50 ii L EDC和NHS 溶液，置于混勻儀上保持磁珠懸浮，室溫活化30分鐘，離心管置于磁力架上磁分離，移除上 清，加入IOOy L MES (pH5,25mM)，重新洗滌2次，最后移除上清。 磁珠與抗體偶聯(lián)：將60 ii g沙門氏菌單克隆抗體與活化的磁珠混合，用MES(pH5, 25mM) 調節(jié)總體積至100 U L，在旋轉混合器上室溫反應30分鐘。加入含有1% (w/v)牛血清白蛋 白BSA的PBS溶液，封閉反應30分鐘。取下離心管置于磁力架上磁分離，移除上清，磁珠用 IOOiiL PBS洗滌四次。加入以含0. 02% (w/v)疊氮化鈉NaN3、l% (w/v)牛血清白蛋白BSA 的PBS作為保存液，4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0028] (2)熒光標記液的制備 熒光膠乳的共價活化：超聲波處理膠乳微球體30秒后，調節(jié)膠乳微球體濃度為 I. OX 1012/mL，15000rpm離心10分鐘，離心后收集沉淀物用蒸餾水溶解，并用200W超聲波 分散30秒；先加入50 ii L的50mg/mL EDC，振蕩混勻，再加入50 ii L的50mg/mL N-羥基硫 代琥珀酰亞胺，振蕩混勻，室溫下平衡30分鐘后在15000rpm離心10分鐘，沉淀用50mM檸 檬酸緩沖液溶解，靜置于4°C冰箱。
[0029] 熒光膠乳標記蛋白的制備：將活化后的熒光膠乳于200W超聲波處理30秒，按 照IOOI^g蛋白/100ML熒光膠乳的比例加入待標記的沙門氏菌單克隆抗體和兔IgG抗體， 混勻室溫攪拌反應2小時，離心洗滌，每次15000rpm下離心10分鐘，共洗滌3次，沉淀用 PBS-TBN溶解并100W超聲波處理30秒，然后用PBS-TBN稀釋至離心前體積，4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0030] 將上述制備好的熒光膠乳微粒標記的沙門氏菌單克隆抗體和熒光膠乳微粒標記 兔IgG抗體用抗體稀釋液按1:100、1:1000比例稀釋混合，分裝備用。
[0031] (3)定量檢測豬肉樣本中沙門氏菌 在無菌操作的條件下，先將檢樣進行表面消毒(沸水內燙3s飛s，或灼燒消毒)，再用無 菌剪子剪取檢樣l〇g，將剪取的豬肉樣本放于裝有90mL滅菌生理鹽水的均質袋中，置均質 器中以8000r/min的速度處理1分鐘后過濾，做成1:10的均質稀釋液。取ImL均質液加 入30ML免疫磁珠富集，將富集捕獲沙門氏菌的免疫磁珠用80MLPBS重懸，60°C水浴溫育 15min，用磁性分離架分離出免疫磁珠，保留沙門氏菌上清液；取50ML的樣本與熒光標記液 等量混合，混勻lmin，配制成樣品取出檢測卡平置，向檢測卡加樣窗中加入80 y L樣品，不 要帶氣泡，開始層析反應；待層析反應進行15分鐘后，用廣州萬孚生物技術股份有限公司 自主研制的"飛測"熒光檢測儀(型號：WF-0901/1型）檢測熒光強度，讀取檢測結果。
[0032] 實施例二：檢測雞蛋樣本中沙門氏菌的熒光免疫層析試劑盒的制備 在該實施例中，熒光定量檢測沙門氏菌免疫層析試劑盒，包括試紙條、免疫磁珠溶液和 熒光標記液。
[0033] 其中，試紙條由樣品墊、包括檢測區(qū)（T區(qū)）和質控區(qū)（C區(qū)）的纖維素包被膜、吸水 紙按試紙條的常規(guī)方法依次相互搭接地粘貼在底板上。
[0034] 在該實施例中，包被膜的檢測區(qū)T線包被有濃度為2. 5mg/ml，用量為 90 iil/27-35Cm的沙門氏菌單克隆抗體或多克隆抗體。在包被膜的質控區(qū)C線包被有濃度 為2. 5mg/ml，用量為90iil/27-35Cm的羊抗兔IgG抗體，用于結合熒光標記的兔IgG抗體， 用于檢測試紙條的有效性。
[0035] 檢測雞蛋樣本中沙門氏菌免疫磁珠的制備 磁珠活化：取100 y L羧基修飾磁珠至I. 5mL離心管中，用等體積一水嗎啉乙磺酸溶液 (MES，pH5,25mM)洗滌2次，用磁力架分離后吸出上清。用MES (pH5,25mM)分別配制50mg/ mL的碳二亞胺（EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺（NHS)溶液，向磁珠中分別加入50 ii L EDC和NHS 溶液，置于混勻儀上保持磁珠懸浮，室溫活化30分鐘，離心管置于磁力架上磁分離，移除上 清，加入100 UL MES (pH5,25mM)，重新洗滌2次，最后移除上清。 磁珠與抗體偶聯(lián)：將60 ii g沙門氏菌單克隆抗體與活化的磁珠混合，用MES (pH5， 25mM)調節(jié)總體積至100 ii L，在旋轉混合器上室溫反應30分鐘。加入含有1% (w/v)牛血 清白蛋白BSA的PBS溶液，封閉反應30分鐘。取下離心管置于磁力架上磁分離，移除上清， 磁珠用100 U L PBS洗滌四次。加入以含0. 02% (w/v)疊氮化鈉NaN3、l% (w/v)牛血清白 蛋白BSA的PBS作為保存液，4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0036] (2)熒光標記液的制備 熒光膠乳的共價活化：超聲波處理膠乳微球體30秒后，調節(jié)膠乳微球體濃度為 I. OX 1013/mL，15000rpm離心10分鐘，離心后收集沉淀物用蒸餾水溶解，并用200W超聲波 分散30秒；先加入50 ii L的50mg/mL EDC，振蕩混勻，再加入50 ii L的50mg/mL N-羥基硫 代琥珀酰亞胺，振蕩混勻，室溫下平衡30分鐘后在15000rpm離心10分鐘，沉淀用50mM檸 檬酸緩沖液溶解，靜置于4°C冰箱。
[0037] 熒光膠乳標記蛋白的制備：將活化后的熒光膠乳于200W超聲波處理30秒，按照 80呢蛋白/100ML熒光膠乳的比例加入待標記的沙門氏菌單克隆抗體和兔IgG抗體，混勻室 溫攪拌反應2小時，離心洗滌，每次15000rpm下離心10分鐘，共洗滌3次，沉淀用PBS-TBN 溶解并100W超聲波處理30秒，然后用PBS-TBN稀釋至離心前體積，4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0038] 將上述制備好的熒光膠乳微粒標記的沙門氏菌單克隆抗體和熒光膠乳微粒標記 兔IgG抗體用抗體稀釋液按1:50、1:1000比例稀釋混合，分裝備用。
[0039] (3)定量檢測雞蛋樣本中沙門氏菌 A、鮮蛋、糟蛋外殼：將蛋放入滅菌小燒杯或平皿中，加入定量滅菌生理鹽水，用滅菌棉 拭子充分擦拭蛋殼表面，以擦洗液作為檢樣待檢； 鮮蛋蛋液：將鮮蛋在流水下洗凈，待干后再用75%酒精棉消毒蛋殼，然后打開蛋殼取出 蛋白、蛋黃或全蛋液，放入帶有玻璃珠的滅菌瓶內，充分搖勻待檢； 在無菌操作的條件下，先將IOmL的檢樣放于裝有90mL滅菌生理鹽水的均質袋中，置均 質器中以8000r/min的速度處理1分鐘后過濾，做成1:10的均質稀釋液。取ImL均質液 加入30ML免疫磁珠富集，將富集捕獲沙門氏菌的免疫磁珠用80MLPBS重懸，60°C水浴溫育 15min，用磁性分離架分離出免疫磁珠，保留沙門氏菌上清液；取50ML的樣本與熒光標記液 等量混合，混勻lmin，配制成樣品取出檢測卡平置，向檢測卡加樣窗中加入80 y L樣品，不 要帶氣泡，開始層析反應；待層析反應進行15分鐘后，由廣州萬孚生物技術股份有限公司 自主研制的"飛測"熒光檢測儀(型號：WF-0901/1型）讀取測試結果。
[0040] 實施例三：檢測牛乳樣本中沙門氏菌的熒光免疫層析試劑盒的制備 在該實施例中，熒光定量檢測沙門氏菌免疫層析試劑盒，包括試紙條、免疫磁珠溶液和 熒光標記液。
[0041] 其中，試紙條由樣品墊、包括檢測區(qū)（T區(qū)）和質控區(qū)（C區(qū)）的纖維素包被膜、吸水 紙按試紙條的常規(guī)方法依次相互搭接地粘貼在底板上。
[0042] 在該實施例中，包被膜的檢測區(qū)T線包被有濃度為3. 5mg/ml，用量為 90 iil/27-35Cm的沙門氏菌單克隆抗體或多克隆抗體。在包被膜的質控區(qū)C線包被有濃度 為3. 5mg/ml，用量為90iil/27-35Cm的羊抗兔IgG抗體，用于結合熒光標記的兔IgG抗體， 用于檢測試紙條的有效性。
[0043] ( 1)檢測牛乳樣本中沙門氏菌免疫磁珠的制備 磁珠活化：取100 y L羧基修飾磁珠至I. 5mL離心管中，用等體積一水嗎啉乙磺酸溶液 (MES，pH5,25mM)洗滌2次，用磁力架分離后吸出上清。用MES (pH5,25mM)分別配制50mg/ mL的碳二亞胺（EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺（NHS)溶液，向磁珠中分別加入50 ii L EDC和NHS 溶液，置于混勻儀上保持磁珠懸浮，室溫活化30分鐘，離心管置于磁力架上磁分離，移除上 清，加入100 UL MES (pH5,25mM)，重新洗滌2次，最后移除上清。 磁珠與抗體偶聯(lián)：將60 ii g沙門氏菌單克隆抗體與活化的磁珠混合，用MES(pH5, 25mM) 調節(jié)總體積至100 U L，在旋轉混合器上室溫反應30分鐘。加入含有1% (w/v)牛血清白蛋 白BSA的PBS溶液，封閉反應30分鐘。取下離心管置于磁力架上磁分離，移除上清，磁珠用 IOOiiL PBS洗滌四次。加入以含0. 02% (w/v)疊氮化鈉NaN3、l% (w/v)牛血清白蛋白BSA 的PBS作為保存液，4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0044] (2)熒光標記液的制備 熒光膠乳的共價活化：超聲波處理膠乳微球體30秒后，調節(jié)膠乳微球體濃度為 I. OX 1013/mL，15000rpm離心10分鐘，離心后收集沉淀物用蒸餾水溶解，并用200W超聲波 分散30秒；先加入50 ii L的50mg/mL EDC，振蕩混勻，再加入50 ii L的50mg/mL N-羥基硫 代琥珀酰亞胺，振蕩混勻，室溫下平衡30分鐘后在15000rpm離心10分鐘，沉淀用50mM檸 檬酸緩沖液溶解，靜置于4°C冰箱。
[0045] 熒光膠乳標記蛋白的制備：將活化后的熒光膠乳于200W超聲波處理30秒，按照 80呢蛋白/100ML熒光膠乳的比例加入待標記的沙門氏菌單克隆抗體和兔IgG抗體，混勻室 溫攪拌反應2小時，離心洗滌，每次15000rpm下離心10分鐘，共洗滌3次，沉淀用PBS-TBN 溶解并100W超聲波處理30秒，然后用PBS-TBN稀釋至離心前體積，4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0046] 將上述制備好的熒光膠乳微粒標記的沙門氏菌單克隆抗體和熒光膠乳微粒標記 兔IgG抗體用抗體稀釋液按1:50、1:1000比例稀釋混合，分裝備用。
[0047] (3)定量檢測生牛乳樣本中沙門氏菌 在無菌操作的條件下，將檢樣搖勻并開啟包裝，塑料或紙盒(袋）裝，用75%酒精棉球消 毒盒蓋或袋口，用滅菌剪刀剪開；玻璃瓶裝，以無菌操作去掉瓶口的紙罩或瓶蓋，瓶口經(jīng)火 焰消毒。用滅菌吸管吸取IOmL(液態(tài)乳中添加固體顆粒狀物的，應均質后取樣)的檢樣，放于 裝有90mL滅菌生理鹽水的均質袋中，置均質器中以8000r/min的速度處理1分鐘后過濾， 做成1:10的均質稀釋液。取ImL均質液加入30ML免疫磁珠富集，將富集捕獲沙門氏菌的 免疫磁珠用80MLPBS重懸，60°C水浴溫育15min，用磁性分離架分離出免疫磁珠，保留沙門 氏菌上清液；取50ML的樣本與熒光標記液等量混合，混勻lmin，配制成樣品取出檢測卡平 置，向檢測卡加樣窗中加入80 y L樣品，不要帶氣泡，開始層析反應；待層析反應進行15分 鐘后，由廣州萬孚生物技術股份有限公司自主研制的"飛測"熒光檢測儀?號：WF-0901/1 型）讀取測試結果。
[0048] 本發(fā)明所述的沙門氏菌免疫層析檢測試劑盒，在具體實例中，半成品通過以下工序組 裝而成：由樣品墊、包被膜、吸水紙順次搭接粘貼在底板上，構成試紙條，可再用現(xiàn)有技術中 的卡外殼7 (如圖3所示)，固定成檢測卡，所述卡外殼涂有可供熒光儀掃描識別的產(chǎn)品信息 噴碼，經(jīng)熒光定量檢測儀掃描后寫入ID芯片中，熒光定量檢測儀采用的定量計算公式為檢 測信號值與計算濃度的半對數(shù)直線方程式或其他計算方程式，可自動進行結果判定)。分裝 好的免疫磁珠、熒光標記液和其他配件組裝成試劑盒。
[0049] 本發(fā)明所述熒光定量檢測食源性沙門氏菌的免疫層析試劑盒，在使用時，組裝在 由塑料上殼和塑料下殼扣合而成的塑料卡外殼(檢測卡）中，塑料上殼設有兩個開孔，加樣 孔9和顯示窗8,加樣孔9對應于所述的熒光定量檢測沙門氏菌的免疫層析試紙條樣品墊， 結果顯示窗8對應于所述熒光定量檢測沙門氏菌的免疫層析試紙條的檢測區(qū)和質控區(qū)，該 熒光定量檢測沙門氏菌的免疫層析試紙條可以從該塑料外殼中取出。
[0050] 本發(fā)明通過對實施例中的200例樣本進行檢測，同時用膠體金免疫層析試劑盒、 酶聯(lián)免疫吸附（ELISA)試劑盒和環(huán)介導等溫擴增（LAMP)試劑盒分別進行檢測比較。目前， 市面上銷售的應用了膠體金、ELISA、LAMP技術檢測食源性沙門氏菌的試劑盒只能對樣本中 的目標檢測物進行定性或半定量檢測，相比之下，本發(fā)明結合了免疫磁珠富集技術和熒光 定量檢測技術，可對樣本進行精確定量?，F(xiàn)將該檢測效果比較如下：

【權利要求】
1. 熒光定量檢測沙門氏菌免疫層析試劑盒，其特征是，該試劑盒包括試紙條、免疫磁珠 和熒光標記液；所述試紙條由樣品墊、硝酸纖維素包被膜、吸水紙順次搭接粘貼在聚乙烯塑 料底板上構成；所述硝酸纖維素包被膜包括檢測區(qū)（T區(qū)）和質控區(qū)（C區(qū));所述檢測區(qū)包被 有沙門氏菌單克隆抗體或多克隆抗體，所述質控區(qū)包被抗兔IgG ;所述免疫磁珠表面偶聯(lián) 有沙門氏菌單克隆抗體；所述熒光標記液中含有熒光膠乳標記沙門氏菌單克隆抗體或多克 隆抗體和熒光膠乳標記兔IgG。
2. 根據(jù)權利要求1所述的熒光定量檢測沙門氏菌免疫層析試劑盒，其特征是，所述硝 酸纖維素包被膜檢測區(qū)（T區(qū))，包被有濃度為0. 2?4 mg/mL，用量為90 ML/27?35cm的 沙門氏菌單克隆抗體或多克隆抗體。
3. 根據(jù)權利要求1所述的熒光定量檢測沙門氏菌免疫層析試劑盒，其特征是，所述 硝酸纖維素包被膜質控區(qū)（C區(qū))，抗兔IgG的包被液濃度為0. 2?4 mg/mL，用量為90 ML/27 ?35cm。
4. 根據(jù)權利要求1-3任一項所述的熒光定量檢測沙門氏菌免疫層析試劑盒，其特征 是，所述磁珠為微米級別的羧基磁珠，使用碳二亞胺（EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺（NHS)共價 交聯(lián)的方式將沙門氏菌單克隆抗體標記在磁珠上形成免疫磁珠。
5. 根據(jù)權利要求1-3任一項所述的熒光定量檢測沙門氏菌免疫層析試劑盒，其特征 是，所述熒光標記液中的熒光膠乳標記沙門氏菌單克隆抗體或多克隆抗體的濃度為〇. 2? 5 Mg/mL，突光膠乳標記兔IgG的濃度為0. 2?5 Mg/mL。
6. 根據(jù)權利要求5所述的熒光定量檢測沙門氏菌免疫層析試劑盒，其特征是，所述熒 光標記液的激發(fā)波長（Ex)為310?550 nm，發(fā)射波長（Em)為340?620 nm。
7. 根據(jù)權利要求1所述的熒光定量檢測沙門氏菌免疫層析試劑盒，其特征是，所述熒 光膠乳直徑范圍為〇. lMm?lMm。
【文檔編號】G01N21/64GK104374917SQ201310354148
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2013年8月14日 優(yōu)先權日:2013年8月14日
【發(fā)明者】王繼華, 唐時幸, 劉曉云 申請人:廣州萬孚生物技術股份有限公司