一種苯硼酸材料富集糖肽的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種苯硼酸材料富集糖肽富集方法。本方法使用具有苯硼酸修飾的硅球作為富集材料，通過優(yōu)化有機(jī)溶劑的種類和濃度、緩沖鹽類型和濃度，富集溫度等參數(shù)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)糖肽的選擇性富集。該方法具有選擇性高、吸附量大、操作簡便可控等特點(diǎn)，適用于生物樣品中糖肽的選擇性富集。
【專利說明】一種苯硼酸材料富集糖肽的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分離與純化【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種糖肽富集方法。 技術(shù)背景
[0002] 蛋白質(zhì)的糖基化修飾參與真核細(xì)胞許多重要的調(diào)節(jié)過程，包括受體激活、信 號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及細(xì)胞吞噬等[Ohtsubo and Marth, Cell, 2006]。許多疾病的發(fā)生與蛋白質(zhì) 糖基化的變異有關(guān)，比如惡性腫瘤[Wang，et al.，Glycobiology2006]、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎 [Fournier, et al. Biochimica Et Biophysica Acta-Protein Structure and Molecular Enzymology, 2000)慢性阻礙性肺部疾病[Nihlen，et al.，Scandinavian Journal of Clinical & Laboratory Investigation, 2001]、以及阿爾茨海默病等[van Rensburg，et al.，Metabolic Brain Disease, 2004]。由此，對(duì)糖蛋白的結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征非常重要。但是， 在糖蛋白中糖基化位點(diǎn)表達(dá)的化學(xué)計(jì)量位點(diǎn)相對(duì)比較低；另外酶解液中糖肽數(shù)量比較少， 導(dǎo)致在質(zhì)譜檢測(cè)時(shí)糖肽信號(hào)強(qiáng)度比較低；因此，在對(duì)酶解液進(jìn)行質(zhì)譜分析前，需要對(duì)糖肽進(jìn) 行富集[Temporini，et al. , Mass Spectrometry Reviews, 2008] 〇
[0003] 目前，發(fā)展了許多富集糖肽的策略包括凝集素親和色譜法、肼化學(xué)法、硼酸親和色 譜法及親水作用色譜法等。凝集素親和作用色譜被廣泛應(yīng)用在分離和富集糖蛋白和糖肽中 [Dalziel，et al. 1999]。但存在糖基化覆蓋率低的問題[Kubota, et al. Anal. Chem. 2008]; 肼化學(xué)對(duì)糖肽的選擇性高，但是該方法存在丟失糖鏈的信息的問題[Zhang，H. ;et al. Nat. Biotechnol. 2003.];親水作用色譜對(duì)不同的糖鏈結(jié)構(gòu)有保留，在糖肽富集的行列中表現(xiàn) 出很好的效果，糖基化覆蓋率高。但是該方法容易受到極性非糖肽的干擾[Wada，Y. ;et al. Anal. Chem. 2004.]。硼酸親和色譜法能與順勢(shì)二醇形成硼酸酯結(jié)構(gòu)也可以用來富集糖 肽[Zhou, W. ;et al. Chem. Commun. 2008]。該方法通常在堿性緩沖鹽體系下進(jìn)行富集。但非 糖肽與硼酸材料之間存在的氫鍵作用降低了該方法的選擇性。降低或消除硼酸材料與非糖 肽之間的氫鍵作用，同時(shí)增強(qiáng)糖肽與硼酸材料之間的作用對(duì)提高硼酸材料對(duì)糖肽的選擇性 是非常必要的。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明涉及一種苯硼酸材料富集糖肽的方法。
[0005] 本方法使用具有苯硼酸修飾的硅球作為富集材料，通過優(yōu)化有機(jī)溶劑的種類和濃 度、緩沖鹽類型和濃度，富集溫度等參數(shù)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)糖肽的選擇性富集。本方法涉及的色譜 模式為親水作用色譜和親和作用色譜原理。
[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種具有高選擇性、糖基化覆蓋率廣和操作簡單的糖肽富 集方法，能對(duì)痕量糖肽進(jìn)行選擇性富集。
[0007] -種苯硼酸材料富集糖肽富集方法，其特征在于：以苯硼酸修飾的硅球?yàn)楦患?料，進(jìn)行固相萃?。⊿PE )，于肽樣品中富集分離出糖肽。
[0008] 富集材料的粒徑是2-50m，孔徑為50 1000 A。
[0009] 硅球上修飾的苯硼酸層數(shù)是單層或多層；所述單層為一分子苯硼酸通過連接基團(tuán) 結(jié)合到硅球上的一分子硅羥基上；所述多層為多分子苯硼酸通過聚合首尾相連結(jié)合到硅球 上的一分子娃輕基上。
[0010] 所述富集分離的色譜模式為親水作用色譜和親和作用色譜原理；以苯硼酸修飾的 硅球作為富集材料，使用固相萃?。⊿PE)技術(shù)，
[0011] 首先使富集材料與肽樣品接觸，然后沖洗富集材料去除其上的非糖肽，最后將富 集材料上的糖肽洗脫下來；
[0012] 沖洗非糖肽的流動(dòng)相組成包括水、有機(jī)溶劑和緩沖鹽混合液，或水和有機(jī)溶劑混 合液；
[0013] 洗脫糖肽的洗脫溶劑組成包括水或水和有機(jī)溶劑混合液。
[0014] 具體操作采用柱固相萃取模式或分散固相萃取模式；
[0015] 在柱固相萃取（SPE)模式下采用富集材料富集糖肽時(shí)，將肽樣品上到填裝有富集 材料的SPE柱上，采用沖洗非糖肽的流動(dòng)相沖洗富集材料去除其上的非糖肽，再采用洗脫 溶劑沖洗，富集出糖肽；
[0016] 或在分散固相萃取模式下采用富集材料順序富集磷酸肽時(shí)，將肽樣品直接與富集 材料混合，離心，采用沖洗非糖肽的流動(dòng)相去除富集材料上的非糖肽；離心，采用洗脫溶劑 沖洗富集材料上的，富集出糖肽。
[0017] 分散固相萃取模式下，肽樣品與富集材料接觸后需要孵化，孵化時(shí)間0. 5-120分 鐘；
[0018] 沖洗非糖肽的流動(dòng)相組成如下a-f任一之一所示：
[0019] a. A相為水，B相為乙腈，體積比A/B: 10/90-40/60。
[0020] b. A相為水，B相為甲醇，體積比A/B: 10/90-40/60。
[0021] c. A相為碳酸氫銨水溶液，B相為乙腈，體積比A/B :5/95-40/60。
[0022] d. A相為碳酸氫銨水溶液，B相為甲醇，體積比A/B: 5/95-40/60。
[0023] e. A相為磷酸氫二鉀水溶液，B相為乙腈，體積比A/B :5/95-40/60。
[0024] f. A相為磷酸氫二鉀水溶液，B相為甲醇，體積比A/B: 5/95-40/60。
[0025] 其中碳酸氫銨水溶液，濃度5-200mM，pH 7. 9 ;
[0026] 磷酸氫二鉀水溶液，濃度5_200mM，pH 7。
[0027] 洗脫糖肽的洗脫溶劑組成如下任一之一所示：
[0028] a. A相為水，B相為乙腈,體積比A/B :50/50-99/1。
[0029] b. A相為水，B相為甲醇，體積比A/B:50/50-99/1。
[0030] c. A相為甲酸水溶液，B相為乙腈，體積比A/B :50/50-99/1。
[0031] d. A相為甲酸水溶液，B相為甲醇，體積比A/B: 50/50-99/1。
[0032] e. A相為乙酸水溶液，B相為乙腈，體積比A/B :50/50-99/1。
[0033] f. A相為水溶液，B相為甲醇，體積比A/B:50/50-99/1。
[0034] 其中甲酸水溶液，含量0. 1-10%，pH 1-4 ;
[0035] 其中乙酸水溶液，含量0. 1-10%，pH 1-4 ;
[0036] 肽樣品的樣品濃度為0? Ing/mL-lmg/mL ;
[0037] 富集溫度為15_60°C。
[0038] 所述肽樣品為蛋白酶解液；
[0039] 所述蛋白為組織、細(xì)胞、血清、尿液等生物樣品中的蛋白或者是糖蛋白標(biāo)準(zhǔn)品(轉(zhuǎn) 鐵蛋白、胎球蛋白、辣根過氧化酶、核糖核酸酶B等）中的一種或二種以上混合；
[0040] 所述酶為胰蛋白酶、內(nèi)肽酶、胃蛋白酶、糜蛋白酶中的一種或二種以上混合。
[0041] 具體的制備步驟如下：
[0042] 具體操作時(shí)采用萃取模式模式，過程如下：
[0043] 1]將苯硼酸修飾硅膠裝入萃取柱中，采用沖洗液平衡柱子，將肽樣品旋干，溶解于 1-200L含有90-10%乙腈/5-200mM碳酸氫銨緩沖鹽到萃取柱上；
[0044] 2]采用2-50倍苯硼酸修飾硅膠材料柱體積的的90-10%乙腈/5-200碳酸氫銨緩 沖鹽淋洗溶液沖洗，去除非糖肽；重復(fù)此步驟1-10次；
[0045] 3]米用2_50倍9的0-50%乙臆[pH2_6)洗脫溶液洗脫糖膚。重復(fù)此步驟1_10 次。
[0046] 具體操作時(shí)采用分散固相萃取模式，過程如下；
[0047] 1]將糖肽樣品旋干，溶解于1-200L含有90-10%乙腈/5-200mM碳酸氫銨緩沖鹽 后，直接與苯硼酸修飾硅膠材料混合，孵化0. 5-120分鐘，離心，棄上層溶液，收集沉淀；
[0048] 2]離心后的苯硼酸修飾硅膠材料與2?50倍材料柱體積的含有90-10%乙腈 /5-200mM碳酸氫銨緩沖鹽混合孵化，孵化0. 5-120分鐘，離心，棄上層溶液，收集沉淀；重復(fù) 此步驟1-10次；
[0049] 3]離心后的苯硼酸修飾硅膠材料與2?50倍材料柱體積的0-50%乙腈[pH2_6) 洗脫溶液洗脫混合，孵化0. 5-120分鐘，離心，收集上清液，得到糖肽。重復(fù)此步驟1-10次。
[0050] 該方法具有選擇性高、吸附量大、操作簡便可控等特點(diǎn)，適用于生物樣品中糖肽的 選擇性富集。
[0051] 本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：
[0052] 1.本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于苯硼酸修飾硅膠材料富集糖肽時(shí)表現(xiàn)出了高選擇性、高糖基 化覆蓋率、通用性廣等特點(diǎn)，可以實(shí)現(xiàn)糖肽的有效富集；
[0053] 2.本發(fā)明涉及的苯硼酸修飾硅膠材料既可以方便的裝填成不同長度，不同內(nèi)徑的 柱子，又可以直接添加與離心管，操作簡單，易于重復(fù)。特別適合微量生物樣品中糖肽段的 富集；
[0054] 3.本發(fā)明富集得到的糖肽可直接用于電噴霧-質(zhì)譜分析（ESI-MS)或者基質(zhì)輔助 激光解吸電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALD-TOF MS)，提高了質(zhì)譜的檢測(cè)限和靈敏度。
[0055] 本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：
[0056] 1.高選擇性。針對(duì)當(dāng)前糖肽富集遇到的問題，本發(fā)明提出使用親水作用色譜和親 和色譜聯(lián)用方法富集糖肽。此方法對(duì)糖肽的富集選擇性高，有效解決了非糖肽因氫鍵作用 與糖肽共流出的問題。
[0057] 2.通量高。通過固相萃取模式和分散固相萃取模式，可以在同一材料上實(shí)現(xiàn)不同 操作模式下糖肽的高通量選擇性富集，。
[0058] 3.高重復(fù)性。實(shí)驗(yàn)操作簡單可控，易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，過程穩(wěn)定，重復(fù)性好。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0059] 圖1多層苯硼酸修飾硅球?qū)?biāo)準(zhǔn)糖蛋白辣根過氧化酶酶解產(chǎn)物中糖肽富集前后 的電噴霧質(zhì)譜圖。（a)經(jīng)多層苯硼酸修飾硅球富集后的質(zhì)譜圖；（b)未經(jīng)富集的質(zhì)譜圖。糖 肽標(biāo)示為星號(hào)。
[0060] 圖2單層苯硼酸修飾硅球?qū)?biāo)準(zhǔn)糖蛋白辣根過氧化酶酶解產(chǎn)物中糖肽富集前后 的電噴霧質(zhì)譜圖。（a)經(jīng)單層苯硼酸修飾硅球富集后的質(zhì)譜圖；（b)未經(jīng)富集的質(zhì)譜圖。糖 肽標(biāo)示為星號(hào)。

【具體實(shí)施方式】
[0061] 現(xiàn)結(jié)合實(shí)例，對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明。實(shí)例僅限于說明本發(fā)明，而非對(duì)本發(fā)明的限 定。
[0062] 單層苯硼酸修飾娃球的制備過程為L型天冬氨酸（4g, 30mmol), K2C03(18g, 1 30mmol), CuS04 ? 5H20 (0? 075g, 0? 3mmol), 2-唑-1-磺?；B氮化物（8. 5g, 40. 6mmol)、 CH30H(100mL)和粒徑為5 ii m的球形硅膠（20g)加入到250mL圓底燒瓶中，此混合物在室 溫下攪拌9h后，離心濃縮干燥，得到a-疊氮L-天冬氨酸。然后，a-疊氮L-天冬氨酸中 加入乙酸銅（0. 4g, 2mmol)和抗壞血酸鈉（0. 8g, 4mmol)水溶液（IOOmL)，室溫下攪拌114h。 所得產(chǎn)物依次用甲醇，水，質(zhì)量濃度10%的EDTA水溶液，水，甲醇各洗滌兩次，每次IOOml，室 溫下真空干燥12小時(shí)即得單層苯硼酸修飾硅球。
[0063] 多層苯硼酸修飾硅球的制備過程如下：粒徑為5 的球形硅膠（Ig)被分散到含 有三甲氧基巰丙基硅烷(重量比5%)的無水甲醇中室溫下反應(yīng)24h。所得產(chǎn)物經(jīng)依次用甲醇 和二氧六環(huán)洗滌兩次后，加入含有偶氮二異丁腈（IOmg)的苯硼酸PBA(0.2g)二氧六環(huán)溶液 (IOOmL)，80°C下反應(yīng)lh。所得產(chǎn)物經(jīng)丙酮洗滌兩次后，60°C烘干5天。
[0064] 單層苯硼酸修飾硅球是指一分子苯硼酸通過連接基團(tuán)結(jié)合到硅球上的一分子硅 輕基上；
[0065] 多層苯硼酸修飾硅球?yàn)槎喾肿颖脚鹚嵬ㄟ^聚合首尾相連結(jié)合到硅球上的一分子 硅羥基上。
[0066] 實(shí)施例1
[0067] 將Img苯硼酸修飾娃球裝入萃取柱中，采用30L含有體積濃度80%乙腈的50mM碳 酸氫銨溶液平衡柱子；將IOL lOOg/mL的標(biāo)準(zhǔn)糖蛋白辣根過氧化酶的胰蛋白酶的酶解液旋 干，溶解于30L含有體積濃度80%乙腈的50mM碳酸氫銨溶液后，上樣到萃取柱上；
[0068] 用30L含有體積濃度80%乙腈的50mM碳酸氫銨溶液沖洗，去處非糖肽；重復(fù)沖洗 過程2次；
[0069] 然后,采用20L體積濃度50%乙腈（pH3)水溶液洗脫糖肽，重復(fù)此洗脫過程2次； 合并富集后的糖肽餾分用質(zhì)譜進(jìn)行分析。
[0070] 由圖1可見，多層苯硼酸修飾硅球?qū)?biāo)準(zhǔn)糖蛋白辣根過氧化酶酶解產(chǎn)物中糖肽富 集后的特異性。
[0071] 實(shí)施例2
[0072] 將Img苯硼酸修飾硅球用100L含有體積濃度80%乙腈的50mM碳酸氫銨溶液分散， 離心后，棄上層溶液，收集沉淀；將IOL lOOg/mL的標(biāo)準(zhǔn)糖蛋白辣根過氧化酶的胰蛋白酶的 酶解液旋干后，用100L含有體積濃度80%乙腈的50mM碳酸氫銨溶液溶解，與苯硼酸修飾硅 膠材料混合，孵化o. 5-120分鐘（具體可30分鐘)，離心，棄上層溶液，收集沉淀；離心后的 苯硼酸修飾硅膠材料與100L含有體積濃度80%乙腈的50mM碳酸氫銨溶液混合孵化，孵化 0. 5-120分鐘，離心，棄上層溶液，收集沉淀；重復(fù)此步驟2次；
[0073] 離心后的苯硼酸修飾硅球與100L體積濃度50%乙腈（pH3)水溶液洗脫混合，孵化 0. 5-120分鐘（具體可30分鐘)，離心，收集上清液，得到糖肽；重復(fù)此步驟1次。合并富集 后的糖肽餾分用質(zhì)譜進(jìn)行分析。
[0074] 由圖2可見，單層苯硼酸修飾硅球?qū)?biāo)準(zhǔn)糖蛋白辣根過氧化酶酶解產(chǎn)物中糖肽富 集后的特異性。
[0075] 實(shí)施例3
[0076] 將Img苯硼酸修飾娃球裝入萃取柱中，采用30L含有體積濃度80%乙腈的50mM碳 酸氫銨溶液平衡柱子，將IOL lOOg/mL的標(biāo)準(zhǔn)糖蛋白辣根過氧化酶的胰蛋白酶的酶解液旋 干，溶解于30L含有體積濃度75%甲醇的50mM碳酸氫銨溶液后，上樣到萃取柱上；用30L含 有體積濃度75%甲醇的50mM碳酸氫銨溶液沖洗，去處非糖肽；重復(fù)2次；
[0077] 采用20L體積濃度50%乙腈（pH3)洗脫溶液洗脫糖肽。重復(fù)此步驟2次，合并富 集后的糖肽用質(zhì)譜進(jìn)行分析。
[0078] 實(shí)施例4
[0079] 將Img苯硼酸修飾硅球用100L含有體積濃度75%甲醇的50mM碳酸氫銨溶液平衡 柱子沖洗，離心后，棄上層溶液，收集沉淀；將IOL lOOg/mL的標(biāo)準(zhǔn)糖蛋白辣根過氧化酶的 胰蛋白酶的酶解液旋干后，用100L含有體積濃度75%甲醇的50mM碳酸氫銨溶液溶解，與苯 硼酸修飾硅膠材料混合，孵化60分鐘，離心，棄上層溶液，收集沉淀；
[0080] 離心后的苯硼酸修飾硅膠材料與100L含有體積濃度75%甲醇的50mM碳酸氫銨溶 液混合孵化，孵化120分鐘，離心，棄上層溶液，收集沉淀；重復(fù)此步驟2次；
[0081] 離心后的苯硼酸修飾硅膠材料與100L 50%甲醇（PH3)洗脫溶液洗脫混合，孵化90 分鐘，離心，收集上清液，得到糖肽。重復(fù)此步驟1次。
[0082] 實(shí)施例5-8
[0083] 分別調(diào)整沖洗液為含有體積濃度85%乙腈的50mM碳酸氫銨溶液、含有體積濃度 70%乙腈的50mM碳酸氫銨溶液、含有體積濃度65%乙腈的50mM碳酸氫銨溶液和含有體積 濃度50%乙腈的50mM碳酸氫銨溶液，其他條件同實(shí)施例1，富集后得到的糖肽進(jìn)行質(zhì)譜分 析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在萃取模式操作模式下含有體積濃度85%乙腈的50mM碳酸氫銨溶液可以 有效地保留和富集糖蛋白標(biāo)準(zhǔn)品酶解液中的糖肽。
[0084] 實(shí)施例 9-12
[0085] 調(diào)整IOL蛋白酶解液的上樣濃度為2ng/mL、20ng/mL、lOOng/mL和200ng/mL,其他 條件同實(shí)施例1，富集后得到的糖肽進(jìn)行質(zhì)譜分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在萃取模式操作模式下 20ng/mL上樣濃度可以有效地保留和富集的蛋白中的糖肽。
[0086] 實(shí)施例 13-16
[0087] 調(diào)整洗脫溶液的乙腈濃度為10%、20%、30%和50%，其他條件同實(shí)施例1，進(jìn)行選擇 性富集和質(zhì)譜分析。
[0088] 實(shí)施例 17-20
[0089] 調(diào)整洗脫溶液的體積為50 ii L、100 ii L、150 ii L和200 ii L，其他條件同實(shí)施例1，進(jìn) 行選擇性富集和質(zhì)譜分析。
[0090] 實(shí)施例21-24調(diào)整洗脫溶液的乙腈濃度為10%、20%、30%和50%其他條件同實(shí)施例 2,富集后得到的糖肽進(jìn)行質(zhì)譜分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在離心操作模式下Img的材料可以有效 地保留和富集蛋白中的糖肽。
[0091] 實(shí)施例 25-28
[0092] 調(diào)整IOL蛋白酶解液的上樣濃度為2ng/mL、20ng/mL、lOOng/mL和200ng/mL,其他 條件同實(shí)施例2,富集后得到的糖肽進(jìn)行質(zhì)譜分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在離心操作模式下Img的 材料可以有效地保留和富集蛋白中的糖肽。
[0093] 實(shí)施例 29-32
[0094] 調(diào)整洗脫溶液的體積為50 ii L、100 ii L、150 ii L和200 ii L，，其他條件同實(shí)施例2， 進(jìn)行選擇性富集和質(zhì)譜分析。
[0095] 實(shí)施例 33-36
[0096] 調(diào)整洗脫溶液的乙腈濃度為10%、20%、30%和50%，其他條件同實(shí)施例2,進(jìn)行選擇 性富集和質(zhì)譜分析。
【權(quán)利要求】
1. 一種苯硼酸材料富集糖肽富集方法，其特征在于：以苯硼酸修飾的硅球?yàn)楦患?料，進(jìn)行固相萃?。⊿PE )，于肽樣品中富集分離出糖肽。
2. 按照權(quán)利要求1所述方法，其特征在于：富集材料的粒徑是2-50m，孔徑為 50 I(K)O A。
3. 按照權(quán)利要求1所述方法，其特征在于： 硅球上修飾的苯硼酸層數(shù)是單層或多層；所述單層為一分子苯硼酸通過連接基團(tuán)結(jié)合 到硅球上的一分子硅羥基上；所述多層為多分子苯硼酸通過聚合首尾相連結(jié)合到硅球上的 一分子硅羥基上。
4. 按照權(quán)利要求1所述方法，其特征在于： 所述富集分離的色譜模式為親水作用色譜和親和作用色譜原理；以苯硼酸修飾的硅球 作為富集材料，使用固相萃?。⊿PE)技術(shù)， 首先使富集材料與肽樣品接觸，然后沖洗富集材料去除其上的非糖肽，最后將富集材 料上的糖肽洗脫下來； 沖洗非糖肽的流動(dòng)相組成包括水、有機(jī)溶劑和緩沖鹽混合液，或水和有機(jī)溶劑混合 液； 洗脫糖肽的洗脫溶劑組成包括水或水和有機(jī)溶劑混合液。
5. 按照權(quán)利要求4所述方法，其特征在于： 具體操作采用柱固相萃取模式或分散固相萃取模式； 在柱固相萃?。⊿PE)模式下采用富集材料富集糖肽時(shí)，將肽樣品上到填裝有富集材料 的SPE柱上，采用沖洗非糖肽的流動(dòng)相沖洗富集材料去除其上的非糖肽，再采用洗脫溶劑 沖洗，富集出糖肽； 或在分散固相萃取模式下采用富集材料順序富集磷酸肽時(shí)，將肽樣品直接與富集材料 混合，離心，采用沖洗非糖肽的流動(dòng)相去除富集材料上的非糖肽；離心，采用洗脫溶劑沖洗 富集材料上的，富集出糖肽。
6. 按照權(quán)利要求5所述方法，其特征在于：分散固相萃取模式下，肽樣品與富集材料接 觸后需要孵化，孵化時(shí)間0. 5-120分鐘。
7. 按照權(quán)利要求4或5所述方法，其特征在于： 沖洗非糖肽的流動(dòng)相組成如下a-f任一之一所示： a. A相為水，B相為乙腈，體積比A/B: 10/90-40/60 ; b. A相為水，B相為甲醇，體積比A/B: 10/90-40/60 ; c. A相為碳酸氫銨水溶液，B相為乙腈，體積比A/B: 5/95-40/60 ; d. A相為碳酸氫銨水溶液，B相為甲醇，體積比A/B: 5/95-40/60 ; e. A相為磷酸氫二鉀水溶液，B相為乙腈，體積比A/B: 5/95-40/60 ; f. A相為磷酸氫二鉀水溶液，B相為甲醇，體積比A/B: 5/95-40/60。 其中碳酸氫銨水溶液，濃度5-200mM，pH 7. 9 ; 磷酸氫二鉀水溶液，濃度5-200mM，pH 7。
8. 按照權(quán)利要求4或5所述方法，其特征在于： 洗脫糖肽的洗脫溶劑組成如下任一之一所示： a. A相為水，B相為乙腈，體積比A/B :50/50-99/1 ; b. A相為水，B相為甲醇，體積比A/B: 50/50-99/1 ; c. A相為甲酸水溶液，B相為乙腈，體積比A/B: 50/50-99/1 ; d. A相為甲酸水溶液，B相為甲醇，體積比A/B: 50/50-99/1 ; e. A相為乙酸水溶液，B相為乙腈，體積比A/B: 50/50-99/1 ; f. A相為水溶液，B相為甲醇，體積比A/B: 50/50-99/1 ; 其中甲酸水溶液，體積含量〇. 1-10%，PH 1-4 ; 其中乙酸水溶液，體積含量0. 1-10%，pH 1-4。
9. 按照權(quán)利要求1、4或5所述方法，其特征在于： 肽樣品的樣品濃度為〇· Ing/mL-lmg/mL ;富集溫度為15-60°C。
10. 按照權(quán)利要求1、4或5所述方法，其特征在于： 所述肽樣品為蛋白酶解液； 所述蛋白為組織、細(xì)胞、血清或尿液等生物樣品中的蛋白或者是糖蛋白標(biāo)準(zhǔn)品(轉(zhuǎn)鐵蛋 白、胎球蛋白、辣根過氧化酶、核糖核酸酶B等）中的一種或二種以上混合； 所述酶為胰蛋白酶、內(nèi)肽酶、胃蛋白酶、糜蛋白酶中的一種或二種以上混合。
【文檔編號(hào)】G01N30/08GK104374848SQ201310357237
【公開日】2015年2月25日 申請(qǐng)日期:2013年8月14日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月14日
【發(fā)明者】梁鑫淼, 李秀玲 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所