兩種scFv抗體、其編碼基因及其在制備治療或預(yù)防雞傳染性法氏囊病制劑中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公布了兩種scFv抗體、其編碼基因及其在制備治療或預(yù)防雞傳染性法氏囊病制劑中的應(yīng)用。發(fā)明提供了兩種單鏈抗體（即scFv抗體），scFv抗體具有與IBDV結(jié)構(gòu)蛋白2（VP2）蛋白及多種IBDV毒株特異性結(jié)合的能力，可阻斷IBDV對(duì)雞胚成纖維細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞病變（CPE），可保護(hù)IBDV感染的青年雞。免疫血清和卵黃抗體在使用過程中存在制備繁瑣、生產(chǎn)成本高、效果不穩(wěn)定以，工業(yè)化生產(chǎn)質(zhì)量難以控制及引發(fā)水平傳播疾病等弊端。本發(fā)明提供的scFv抗體可以克服上述弊端，具有特異性強(qiáng)、治療效果好，工業(yè)化生產(chǎn)質(zhì)量可控，避免了卵黃抗體引起的水平傳播疾病等優(yōu)點(diǎn)，將在IBDV的防制史上，乃至整個(gè)動(dòng)物病毒病的防治史上開辟了一個(gè)新的局面。
【專利說明】兩種scFv抗體、其編碼基因及其在制備治療或預(yù)防雞傳染性法氏囊病制劑中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及兩種SCFv抗體、其編碼基因及其在制備治療或預(yù)防雞傳染性法氏囊病制劑中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]雞傳染性法氏囊?。↖nfectious Bursal Disease, IBD)是由雞傳染性法氏囊病病毒（Infectious Bursal Disease Virus, IBDV)引起的一種急性、高度接觸性雞傳染病,具有傳播速度快、傳染性強(qiáng)、感染率及死亡率均高的特點(diǎn)。該病給養(yǎng)禽業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失。
[0003]IBDV可在雛雞法氏囊中的淋巴細(xì)胞，尤其是B淋巴細(xì)胞中迅速繁殖，促使B淋巴細(xì)胞凋亡，法氏囊極度萎縮，最終導(dǎo)致免疫缺陷和免疫抑制。因此極易造成細(xì)菌(大腸桿菌和沙門氏菌）的繼發(fā)感染，同時(shí)可還造成其他疫苗的免疫失敗。多克隆抗體(高免血清和卵黃抗體）是目前有效的治療手段，在發(fā)病早期治療效果良好，但是由于工業(yè)化生產(chǎn)可控性差和存在水平傳播疾病(雞白痢、霉形體、減蛋綜合癥和禽白血?。┮约坝梢恍┓翘禺愋钥贵w引起的過敏性反應(yīng)等原因而受到限制。
[0004]基因工程抗體即將抗體的基因按不同需要進(jìn)行加工、改造和重新裝配，然后導(dǎo)入適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)的抗體分子。在原核細(xì)胞中表達(dá)基因工程抗體目前技術(shù)已經(jīng)相對(duì)成熟，可實(shí)現(xiàn)工業(yè)化的生產(chǎn)，產(chǎn)品質(zhì)量可控均一。同時(shí)原核表達(dá)系統(tǒng)不存在水平傳播傳染性疾病的危險(xiǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供兩種單鏈抗體（scFv抗體)、其編碼基因及其在制備治療或預(yù)防雞傳染性法氏囊病制劑中的應(yīng)用。
[0006]本發(fā)明提供了兩種單鏈抗體，命名為IBDV-VP2 scFv29抗體和IBDV-VP2 scFv30抗體，包括由重鏈可變區(qū)、輕鏈可變區(qū)以及它們之間的連接區(qū)組成；
所述IBDV-VP2 scFv29抗體的重鏈可變區(qū)為如下（a)或（b): (a)由序列表中序列I自N末端第1-129位氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)；（b)將（a)經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同活性的由其衍生的蛋白質(zhì)；
所述IBDV-VP2 scFv29抗體輕鏈可變區(qū)為如下（c)或（d) :(c)由序列表中序列I自N末端第145-250位氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)；（d)將（c)經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同活性的由其衍生的蛋白質(zhì)。
[0007]所述單鏈抗體IBDV-VP2 scFv29具體可為如下（e)或（f) : (e)由序列表中序列I所示的蛋白質(zhì)；（f)將（e)經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同活性的由其衍生的蛋白質(zhì)。
[0008]編碼所述單鏈抗體IBDV-VP2 scFv29的基因也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0009]所述單鏈抗體IBDV-VP2 scFv29基因中，編碼所述重鏈可變區(qū)的DNA分子為如下(I)或（2)或（3) :(1)序列表的序列2自5’末端第1-387位核苷酸所示的DNA分子；（2)在嚴(yán)格條件下與（I)限定的DNA序列雜交且編碼具有相同活性的蛋白的DNA分子；（3)與(O限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且編碼具有相同活性的蛋白的DNA分子。
[0010]所述單鏈抗體IBDV-VP2 scFv29基因中，編碼所述輕鏈可變區(qū)的DNA分子為如下
(4)或（5)或（6): (4)序列表的序列2自5’末端第433-753位核苷酸所示的DNA分子；（5)在嚴(yán)格條件下與（4)限定的DNA序列雜交且編碼具有相同活性的蛋白的DNA分子；（6)與
(4)限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且編碼具有相同活性的蛋白的DNA分子。
[0011]所述單鏈抗體IBDV-VP2 scFv29基因具體可為如下（7)或（8)或（9)或（10): (7)序列表的序列2自5’末端第1-753位核苷酸所示的DNA分子；（8)序列表的序列2所示的DNA分子；（9)在嚴(yán)格條件下與（7)或（8)限定的DNA序列雜交且編碼具有相同活性的蛋白的DNA分子；（10)與（7)或（8)限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且編碼具有相同活性的蛋白的DNA分子。
[0012]所述IBDV-VP2 scFv30抗體的重鏈可變區(qū)為如下（a’）或（b’）：（a’）由序列表中序列3自N末端第1-135位氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)；（b’）將（a’）經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同活性的由其衍生的蛋白質(zhì)；
所述IBDV-VP2 scFv30抗體輕鏈可變區(qū)為如下（c’）或（d’）：（c’）由序列表中序列3自N末端第151-255位氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)；（d’）將（c’）經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同活性的由其衍生的蛋白質(zhì)。
[0013]所述單鏈抗體IBDV-VP2 scFv30具體可為如下（e’）或（f ’）：（e’）由序列表中序列3所示的蛋白質(zhì)；（f ’）將（e’）經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同活性的由其衍生的蛋白質(zhì)。
[0014]編碼所述單鏈抗體IBDV-VP2 scFv30的基因也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0015]所述單鏈抗體IBDV-VP2 scFv30基因中，編碼所述重鏈可變區(qū)的DNA分子為如下(I’）或（2’）或（3’）：（ I’）序列表的序列4自5’末端第1-405位核苷酸所示的DNA分子；(2’）在嚴(yán)格條件下與（1' )限定的DNA序列雜交且編碼具有相同活性的蛋白的DNA分子；(3’）與（1')限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且編碼具有相同活性的蛋白的DNA分子。
[0016]所述單鏈抗體IBDV-VP2 scFv30基因中，編碼所述輕鏈可變區(qū)的DNA分子為如下(4’ )或（5’ )或（6’ ) ： (4’ )序列表的序列4自5’末端第451-768位核苷酸所不的DNA分子；（5’）在嚴(yán)格條件下與（4’ )限定的DNA序列雜交且編碼具有相同活性的蛋白的DNA分子；（6’）與（4’）限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且編碼具有相同活性的蛋白的DNA分子。
[0017]所述單鏈抗體IBDV-VP2 scFv30基因具體可為如下（7，）或（8，）或（9，）或（10’）：(7’）序列表的序列4自5’末端第1-768位核苷酸所示的DNA分子；（8’）序列表的序列2所示的DNA分子；（9’）在嚴(yán)格條件下與（7’）或（8’）限定的DNA序列雜交且編碼具有相同活性的蛋白的DNA分子；（10’）與（7’）或（8’）限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且編碼具有相同活性的蛋白的DNA分子。
[0018]上述嚴(yán)格條件可為在6 X SSC，O. 5% SDS的溶液中，在65°C下雜交，然后用2 X SSC、
O.1% SDS 和 I X SSC,O. 1% SDS 各洗膜一次。[0019]含有以上任一所述基因的表達(dá)盒、重組載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0020]基于所述兩種單鏈抗體的其它形式的抗體也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述其它形式的抗體可為Fab形式的抗體、IgG形式的抗體等。
[0021]本發(fā)明還保護(hù)所述單鏈抗體或所述其它形式的抗體在制備產(chǎn)品中的應(yīng)用；所述產(chǎn)品的功能為如下（I )、（II)或(III)或(IV) :( I )檢測雞傳染性法氏囊病病毒；（II)輔助鑒定雞傳染性法氏囊病病毒；（III)預(yù)防和/或治療雞傳染性法氏囊病；（IV)預(yù)防和/或治療由雞傳染性法氏囊病病毒誘發(fā)的其它疾病。
[0022]含有所述單鏈抗體或所述其它形式的抗體的產(chǎn)品也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍；所述產(chǎn)品的功能為如下（I )、（II)或(III)或(IV) :( I )檢測傳染性法氏囊病病毒；（II)輔助鑒定傳染性法氏囊病病毒；（III)預(yù)防和/或治療傳染性法氏囊病病毒引起的疾病；（IV)預(yù)防和/或治療傳染性法氏囊病。
[0023]本發(fā)明還保護(hù)所述單鏈抗體或所述其它形式的抗體在輔助鑒定傳染性法氏囊病病毒中的應(yīng)用。所述應(yīng)用為非疾病診斷方法。
[0024]本發(fā)明提供了兩種單鏈抗體（即scFv抗體)，scFv抗體具有與IBDV結(jié)構(gòu)蛋白2(VP2)蛋白及多種IBDV毒株特異性結(jié)合的能力，可阻斷IBDV對(duì)雞胚成纖維細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞病變（CPE)，可保護(hù)IBDV感染的青年雞。免疫血清和卵黃抗體在使用過程中存在制備繁瑣、生產(chǎn)成本高、效果不穩(wěn)定以，工業(yè)化生產(chǎn)質(zhì)量難以控制及引發(fā)水平傳播疾病等弊端。本發(fā)明提供的scFv抗體可以克服上述弊端，具有特異性強(qiáng)、治療效果好，工業(yè)化生產(chǎn)質(zhì)量可控，避免了卵黃抗體引起的水平傳播疾病等優(yōu)點(diǎn)，將在IBDV的防制史上，乃至整個(gè)動(dòng)物病毒病的防治史上開辟了一個(gè)新的局面。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0025]圖I 為 IBDV-VP2 scFv29 和 IBDV-VP2 scFv30 抗體溶液的 SDS-PAGE 圖譜。
[0026]圖2為兩種scFv抗體溶液的SEC-HPLC圖譜。
[0027]圖3為ELISA檢測兩種scFv抗體對(duì)VP2蛋白的特異性和親和力的結(jié)果。
[0028]圖4為ELISA檢測兩種scFv抗體對(duì)不同IBDV病毒的特異性和親和力結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0029]以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。
[0030]pET_27b (+)載體：購自 Novagen 公司，Cat. No. 69337-3。大腸桿菌 Rosetta :購自Novagen公司，Cat. No. 71403-4。DFl細(xì)胞(雞成纖維細(xì)胞）：購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心，Cat. No. 3131C0001000400030。SPF雛雞：購自哈爾濱獸醫(yī)研究所。雞新城疫滅活疫苗（La Sota株)，購買自哈獸研維科生物公司，編號(hào)080012008。
[0031]雞傳染性法氏囊病活疫苗（Gt株):哈獸研維科生物公司，編號(hào)080012122。雞傳染性法氏囊病中等毒力活疫苗（NF8株）：揚(yáng)州威克生物工程有限公司，編號(hào)101042056。雞傳染性法氏囊病活疫苗（1-65株):Shafit InterGumboro，編號(hào)S20651010A。雞傳染性法氏囊病活疫苗（BJ836株）：上海海利生物藥品有限公司，編號(hào)090202026。雞傳染性法氏囊病活疫苗（MB株）：ABIC，編號(hào)20621150B。雞傳染性法氏囊病活疫苗（B87株）：湖南省中岸生物藥業(yè)有限公司，編號(hào)180022026。
[0032]質(zhì)粒pHisSUMO:參考文獻(xiàn)：姜媛媛，尹成凱，李晉南，任桂萍，張薇，李德山.利用SUMO融合系統(tǒng)高效表達(dá)可溶性重組蛋白的研究.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，39(10) : 57-62;李璐，尹成凱，李德山.高效表達(dá)可溶性重組蛋白表達(dá)載體——pHisSUMO.生物技術(shù)，2009，19(3) : 11-14·。
[0033]包被液（pH9.6) -M Na2CO3 O. 15g、NaHCO3 O. 293g，溶于水并用水定容至 100mL。
[0034]PBS 緩沖液：取 NaCl 8g、KCl 0. 2g、Na2HPO4. 12H20 3. 58g、KH2PO4 0. 24g，溶于 IL水。
[0035]實(shí)施例I :SCFv抗體(單鏈抗體）及其編碼基因的發(fā)現(xiàn)
1、抗體庫的構(gòu)建
取IBDV免疫后的雞脾臟，提取RNA后反轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)GenBank上的抗體序列，設(shè)計(jì)出克隆抗體可變區(qū)的基因引物，以cDNA為模板，使用PCR的方法克隆抗體可變區(qū)。將VH與VL片段分別插入到pTlinker載體的Linker的上游和下游,構(gòu)建出scFv抗體庫。將scFv抗體庫進(jìn)行酶切并與細(xì)菌展示載體PBSD進(jìn)行連接，構(gòu)建抗IBDV抗體的細(xì)菌表面展示文庫。VH 約 380bp、VL 約 320bp, VH-Tlinker-VL 約 740bp ；
2、抗體庫的篩選
收集轉(zhuǎn)化后全部克隆，經(jīng)IPTG (0. 25mmol/ml)誘導(dǎo)4h，經(jīng)EDTA-MgCl2處理，與FITC標(biāo)記的VP2蛋白孵育lh，PBS洗滌后利用流式細(xì)胞儀對(duì)其進(jìn)行篩選；
經(jīng)三輪篩選后，得到兩個(gè)與FITC標(biāo)記的VP2蛋白具有結(jié)合能力的單鏈抗體，將其命名為 IBDV-VP2 scFv29 抗體和 IBDV-VP2 scFv30 抗體；
IBDV-VP2 scFv29抗體（為單鏈抗體，又稱scFv蛋白）如序列表的序列I所示，其編碼基因如序列表的序列2所不；
IBDV-VP2 scFv30抗體(為單鏈抗體，又稱scFv蛋白）如序列表的序列3所示，其編碼基因如序列表的序列4所不。
[0036]實(shí)施例2、scFv抗體的制備
1、合成序列表的序列2所示的雙鏈DNA分子；
2、以步驟I合成的雙鏈DNA分子為模板，用Fl和Rl組成的引物以流式篩選陽性菌所提取質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；
Fl :5’ - CATGCCATGGGCCGTGACGTTGGACGAG-3’ ；
Rl : 5，- CCCAAGCTTTTAACCTAGGACGGTCAGGG-3 ；
3、用限制性內(nèi)切酶AfcoI和Λ?/^ΙΙΙ雙酶切步驟2的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物；
4、用限制性內(nèi)切酶AfcoI和歷/^111雙酶切pET-27b(+)載體，回收約5367bp的載體骨
架；
5、將步驟3的酶切產(chǎn)物和步驟4的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒。根據(jù)測序結(jié)果，對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下：在pET-27b(+)載體的AfcoI和Λ?/^ΙΙΙ酶切位點(diǎn)之間插入了序列表的序列2所不的雙鏈DNA分子；6、將步驟5得到的重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌Rosetta，得到重組菌；
7、將步驟6得到的重組菌接種至含50μ g/ml卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基，37°C、IOOr/min振蕩培養(yǎng)至OD6tltlnm=O. 35 ;加入IPTG并使其濃度為O. 25mmol/L, 37°C U00r/min振蕩培養(yǎng)4h ；
8、取25L完成步驟7的培養(yǎng)體系，4°C、4000r/min離心30min并收集菌體沉淀；
9、取步驟8得到的菌體沉淀，用PBS緩沖液重懸，加入溶菌酶溶液(購自Amresco)并使溶菌酶的濃度為lmg/ml，4°C放置lh，然后進(jìn)行超聲破碎（25瓦的功率，3min)，4°C、1000Og離心30min,收集沉淀；
10、使用AKTAPurifier 100蛋白層析系統(tǒng)（購自GE公司）純化目的蛋白
取步驟9得到的沉淀，用100毫升溶解緩沖液（8mol/L尿素水溶液，pH8. O)充分溶解，然后上樣于HiLoad 16/60 Superdex75 pg柱子（購自GE公司），然后用500毫升復(fù)性緩沖液（2mol/L尿素水溶液，pH8. O)洗脫并收集過柱后的洗脫液，然后在PBS緩沖液中透析過夜，得到溶液即為scFv抗體溶液。所有步驟均在4°C環(huán)境下。scFv抗體溶液的SDS-PAGE圖譜見圖1，顯示約為28KD的條帶，與預(yù)期相符；
11、取步驟10得到的scFv抗體溶液，進(jìn)行SEC-HPLC分析
硅膠填充物，型號(hào)為G-3000sWXl ;將scFv抗體溶液上樣后，用流速為O. 5ml/min的洗脫液（PH8. 0，溶劑為水，含50mM Na3POjP 150mM NaCl)進(jìn)行洗脫。SEC-HPLC圖譜見圖2，目的蛋白的純度可達(dá)90%。
[0037]實(shí)施例3、VP2蛋白的制備 一、重組質(zhì)粒的構(gòu)建`
1、合成序列表的序列6所示的IBDVvp2雙鏈DNA分子；
2、以步驟合成的雙鏈DNA分子為模板，用F2和R2組成的引物對(duì)vp2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；
F2 :5， -GAAGACTTAGGT ACAAACCTGCAAGATCAA-3，；
R2 :5’ -GGATCCTTATGCTCCTGCAATCTTCAG-3，；
3、用限制性內(nèi)切酶助I取BamHl雙酶切步驟3的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物；
4、用限制性內(nèi)切酶助SI取BamHl雙酶切質(zhì)粒pHisSUMO，回收約5700bp的載體骨架；
5、將步驟3的酶切產(chǎn)物和步驟4的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒。重組質(zhì)粒中，VP2蛋白的編碼基因和載體骨架上的分子伴侶SUMO的編碼序列、以及載體骨架上的His標(biāo)簽的編碼序列(位于SUMO的編碼序列的上游，由6個(gè)組氨酸殘基組成)融合，形成融合基因，表達(dá)融合蛋白（融合蛋白自N端至C端依次為His標(biāo)簽、分子伴侶SUMO和VP2蛋白）。
[0038]二、VP2蛋白的制備和純化
1、將步驟一得到的重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌Rosetta，得到重組菌；
2、將步驟I得到的重組菌接種至含100μg/ml氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基，37°C、100r/min 振蕩培養(yǎng)至 OD6citlnm=O. 35 ;加入 IPTG 并使其濃度為 0. 4mmol/L, 25°C、65r/min 振蕩培養(yǎng)IOh ；
3、取完成步驟2的培養(yǎng)體系，4°C、4000r/min離心30min，并收集菌體沉淀；
4、取步驟3得到的菌體沉淀,用Bindingbuffer重懸,加入溶菌酶溶液(購自Amresco)并使溶菌酶的濃度為lmg/ml，4°C放置lh，然后進(jìn)行超聲破碎（25瓦的功率，3min)，4°C、1000Og離心30min,收集上清液；
5、取步驟4得到的上清液,進(jìn)行HisTrapTMFF crude colum親和層析；
柱子型號(hào)為：柱長O. 7cm,柱高2. 5cm ；
上樣量為IOml ；
洗脫過程：先用5倍柱體積的雜蛋白洗脫液(溶劑為水，含有如下濃度的各個(gè)溶質(zhì)：40mmol/L 咪唑、500mmol/L NaCl 和 SOmmoI/T, Na3PO4 ；pH7. 4)洗脫以去除雜蛋白，流速為lml/min ;然后用3倍柱體積的目的蛋白洗脫液(溶劑為水,含有如下濃度的各個(gè)溶質(zhì)：500mmol/L 咪唑、500mmol/L NaCl 和 SOmmoI /T, Na3PO4 ；pH7. 4)洗脫,流速為 lml/min, 280nm波長監(jiān)測，收集目標(biāo)峰(即峰值高于SOmAU的峰)，即為融合蛋白溶液；
6、采用HiPr印TM26/10 Desalting將步驟5得到的融合蛋白溶液進(jìn)行脫鹽；
7、取步驟6得到的溶液，用SUMO蛋白酶I(SUMO蛋白酶I與融合蛋白的摩爾比為1:50 )和終濃度為2mmol/L的DTT 4°C切割過夜；
8、取步驟7得到的溶液,進(jìn)行HisTrapTMFF crude colum親和層析。
[0039]柱子型號(hào)為：柱長O. 7cm,柱高2. 5cm ；
上樣量為15ml，280nm波長監(jiān)測，收集目標(biāo)峰（即峰值高于30mAU的峰)，即為VP2蛋白溶液。將VP2蛋白溶液進(jìn)行聚丙烯凝膠電泳，顯示分子量約為42KDa的單一蛋白條帶，回收蛋白條帶并測序，N端前15個(gè)氨基酸殘基如序列表的序列5自N末端第I至15位氨基酸殘基所示。
[0040]實(shí)施例4、ELISA檢測scFv抗體的親和力和特異性
一、ELISA檢測IBDV-VP2 scFv29和IBDV-VP2 scFv30抗體對(duì)VP2蛋白的特異性和親和力；
1、分別用蛋白濃度為300μg/ml>60 μ g/ml>12 μ g/ml、2. 4 μ g/ml的scFv抗體溶液(即實(shí)施例2制備的scFv抗體溶液，用包被液調(diào)整蛋白濃度)包被酶標(biāo)板，4°C過夜，然后用PBST緩沖液洗滌3次，每次2min ；
2、每孔加入100μ I蛋白濃度為40 μ g/ml的VP2蛋白溶液（即實(shí)施例3制備的VP2蛋白溶液，用PBS緩沖液調(diào)整蛋白濃度)，37°C孵育lh，然后用PBST緩沖液洗滌3次，每次2min ；
3、加入卵黃抗體（B87株免疫蛋雞得到的，工作濃度為1:200倍稀釋)，371：孵育lh，然后用PBST緩沖液洗滌3次，每次2min ；
4、加入HRP標(biāo)記的兔抗雞抗體（Cat.No. 11-7018購自eBioscience公司，工作濃度為1:7500倍稀釋)，37°C孵育lh，然后用PBST緩沖液洗滌3次，每次2min ；
5、加入TMB底物顯色液，37°C避光顯色5min；
6、每孔加入50μ 12mol/L的H2SO4水溶液，用酶標(biāo)儀于波長450nm下檢測OD值；
設(shè)置用等體積的PBS緩沖液代替步驟I中的scFv抗體溶液、步驟2中的VP2蛋白溶液和步驟3中的卵黃抗體的PBS組。步驟I中用蛋白濃度為300 μ g/ml的scFv抗體溶液包被酶標(biāo)板時(shí)：設(shè)置步驟2中不加入VP2蛋白溶液的對(duì)照組1，步驟3中不加入卵黃抗體的對(duì)照組2，步驟2中不加入VP2蛋白溶液且步驟3中不加入卵黃抗體的對(duì)照組3，用等體積且等蛋白濃度的BSA溶液代替VP2蛋白溶液的對(duì)照組4 ；
每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)復(fù)孔；
結(jié)果見圖3。ELISA結(jié)果表明，IBDV-VP2 scFv29和IBDV-VP2 scFv30抗體可以與VP2蛋白特異性結(jié)合。
[0041]二、ELISA 檢測 sIBDV-VP2 scFv29 和 IBDV-VP2 scFv30 抗體對(duì)不同 IBDV 病毒的特異性和親和力
，1、用蛋白濃度為300μ g/ml的scFv抗體溶液(即實(shí)施例2制備的scFv抗體溶液，用包被液調(diào)整蛋白濃度）包被酶標(biāo)板，4°C過夜，然后用PBST緩沖液洗滌3次，每次2min ；
，2、每孔加入100 μ I IBDV 病毒液(病毒滴度為 IOOTCId50, TCID50=IO^ 8/0. lml)，37。。孵育lh，然后用PBST緩沖液洗滌3次，每次2min ；
，3、加入卵黃抗體（B87株免疫蛋雞得到的，工作濃度為1:200倍稀釋)，371：孵育lh，然后用PBST緩沖液洗滌3次，每次2min ；
4、加入HRP標(biāo)記的兔抗雞抗體（Cat.No. 11-7018購自eBioscience公司，工作濃度為1:7500倍稀釋)，37°C孵育lh，然后用PBST緩沖液洗滌3次，每次2min ；
5、加入TMB底物顯色液，37°C避光顯色5min；
6、每孔加入50μ I 2mol/L的H2SO4水溶液，用酶標(biāo)儀于波長450nm下檢測OD值； 分別采用如下IBDV的毒株進(jìn)行上述實(shí)驗(yàn)：Gt株、NF8株、1_65株、BJ836株、MB株、B87
株;
設(shè)置用等體積的PBS緩沖液代替步驟I中的scFv抗體溶液、步驟2中的IBDV病毒液和步驟3中的卵黃抗體的PBS組。設(shè)置步驟2中不加入IBDV病毒液的對(duì)照組1，步驟3中不加入卵黃抗體的對(duì)照組2，步驟2中 不加入IBDV病毒液且步驟3中不加入卵黃抗體的對(duì)照組3，用等體積等滴度的新城疫病毒液代替IBDV病毒液的對(duì)照組4 ;
每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)復(fù)孔；
結(jié)果見圖4。ELISA結(jié)果表明，IBDV-VP2 scFv29和IBDV-VP2 scFv30抗體可以與不同IBDV毒株特異性結(jié)合，對(duì)不同的IBDV毒株具有不同的親和力。
[0042]實(shí)施例5、IBDV-VP2 scFv29 和 IBDV-VP2 scFv30 抗體的中和活性 一、IBDV滴度的測定
將處于對(duì)數(shù)生長期的DFl細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，將用DMEM培養(yǎng)基IO1至IO11梯度稀釋的IBDV病毒液（B87株）接種到單層細(xì)胞中（每孔100 μ I)，每一稀釋度接種8個(gè)細(xì)胞孔；設(shè)置不加入IBDV病毒液的對(duì)照組。將細(xì)胞培養(yǎng)板放到細(xì)胞培養(yǎng)箱中，37°C、5% CO2培養(yǎng)，連續(xù)觀察7天，每天記錄細(xì)胞生長狀態(tài)。計(jì)算病毒滴度，第7天結(jié)果見表1。
[0043]表1 IBDV滴度的測定的結(jié)果
【權(quán)利要求】
1.兩種單鏈抗體，包括由重鏈可變區(qū)、輕鏈可變區(qū)以及它們之間的連接區(qū)組成； 所述IBDV-VP2 scFv29抗體重鏈可變區(qū)為如下（a)或（b) ： Ca)由序列表中序列I自N末端第1-129位氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)；（b)將（a)經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同活性的由其衍生的蛋白質(zhì)； 所述IBDV-VP2 scFv29抗體輕鏈可變區(qū)為如下（c)或（d) :(c)由序列表中序列I自N末端第145-250位氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)；（d)將（c)經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同活性的由其衍生的蛋白質(zhì)； 所述IBDV-VP2 scFv30抗體重鏈可變區(qū)為如下（a’）或（b’）：（a’）由序列表中序列I自N末端第1-135位氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)；（b’）將（a’）經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同活性的由其衍生的蛋白質(zhì)； 所述IBDV-VP2 scFv30抗體輕鏈可變區(qū)為如下（c’）或（d’）：（c’）由序列表中序列I自N末端第151-255位氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)；（d’）將（c’）經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同活性的由其衍生的蛋白質(zhì)。
2.如權(quán)利要求1所述的兩種單鏈抗體，其特征在于： 所述IBDV-VP2 scFv29單鏈抗體為如下（e)或（f ): (e)由序列表中序列I所示的蛋白質(zhì)；（f)將（e)經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同活性的由其衍生的蛋白質(zhì)； 所述IBDV-VP2 scFv30單鏈抗體為如下（e’）或（f’）：（e’ )由序列表中序列3所示的蛋白質(zhì)；（f ’）將（e’）經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同活性的由其衍生的蛋白質(zhì)。
3.編碼權(quán)利要求1或2所述單鏈抗體的基因。
4.如權(quán)利要求3所述的基因，其特征在于： 所述IBDV-VP2 scFv29單鏈抗體基因中，編碼所述重鏈可變區(qū)的DNA分子為如下（I)或(2)或（3) : (I)序列表的序列2自5’末端第1-387位核苷酸所示的DNA分子；（2)在嚴(yán)格條件下與（I)限定的DNA序列雜交且編碼具有相同活性的蛋白的DNA分子；（3)與（I)限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且編碼具有相同活性的蛋白的DNA分子； 所述IBDV-VP2 scFv29單鏈抗體基因中，編碼所述輕鏈可變區(qū)的DNA分子為如下（4)或（5)或（6): (4)序列表的序列2自5’末端第433-753位核苷酸所示的DNA分子；（5)在嚴(yán)格條件下與（4)限定的DNA序列雜交且編碼具有相同活性的蛋白的DNA分子；（6)與（4)限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且編碼具有相同活性的蛋白的DNA分子； 所述IBDV-VP2 scFv30單鏈抗體基因中，編碼所述重鏈可變區(qū)的DNA分子為如下（I’）或（2’）或（3’）：（ I’）序列表的序列4自5’末端第1-405位核苷酸所示的DNA分子；（2’）在嚴(yán)格條件下與（I’）限定的DNA序列雜交且編碼具有相同活性的蛋白的DNA分子；（3’）與0-)限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且編碼具有相同活性的蛋白的DNA分子；所述IBDV-VP2 scFv30單鏈抗體基因中，編碼所述輕鏈可變區(qū)的DNA分子為如下（4)或（5)或（6): (4)序列表的序列2自5’末端第451-768位核苷酸所不的DNA分子；（5)在嚴(yán)格條件下與（4)限定的DNA序列雜交且編碼具有相同活性的蛋白的DNA分子；（6)與（4)限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且編碼具有相同活性的蛋白的DNA分子。
5.如權(quán)利要求4所述的基因，其特征在于：所述IBDV-VP2 scFv29單鏈抗體基因?yàn)槿缦拢?)或（8)或（9)或（10): (7)序列表的序列2自5’末端第1-753位核苷酸所示的DNA分子；（8)序列表的序列2所示的DNA分子；(9)在嚴(yán)格條件下與（7)或（8)限定的DNA序列雜交且編碼具有相同活性的蛋白的DNA分子；（10)與（7)或（8)限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且編碼具有相同活性的蛋白的DNA分子； 所述IBDV-VP2 scFv30單鏈抗體基因?yàn)槿缦拢?’）或（8’）或（9’）或（10’）：（7’）序列表的序列4自5’末端第1-768位核苷酸所不的DNA分子；（8’）序列表的序列2所不的DNA分子；（9’）在嚴(yán)格條件下與（7’）或（8’）限定的DNA序列雜交且編碼具有相同活性的蛋白的DNA分子；（10’）與（7)或（8’）限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且編碼具有相同活性的蛋白的DNA分子。
6.含有權(quán)利要求3至5中任一所述基因的表達(dá)盒、重組載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。
7.基于權(quán)利要求1或2所述單鏈抗體的其它形式的抗體。
8.權(quán)利要求1所述單鏈抗體、權(quán)利要求2所述單鏈抗體或權(quán)利要求7所述抗體在制備產(chǎn)品中的應(yīng)用；所述產(chǎn)品的功能為如下（I )、（11)或(ΠΙ)或(IV):( I )檢測傳染性法氏囊病病毒；（II)輔助鑒定傳染性法氏囊病病毒；（III)預(yù)防和/或治療傳染性法氏囊病病毒引起的疾??；（IV)預(yù)防和/或治療傳染性法氏囊病。
9.含有權(quán)利要求1所述單鏈抗體、權(quán)利要求2所述單鏈抗體或權(quán)利要求7所述抗體的產(chǎn)品；所述產(chǎn)品的功能為如下（I )、（II)或(III)或(IV) : (I )檢測傳染性法氏囊病病毒；(II)輔助鑒定傳染性法氏囊病病毒；(III)預(yù)防和/或治療傳染性法氏囊病病毒引起的疾病；(IV)預(yù)防和/或治療傳染性法氏 囊病。
10.權(quán)利要求1所述單鏈抗體、權(quán)利要求2所述單鏈抗體或權(quán)利要求7所述抗體在輔助鑒定傳染性法氏囊病病毒中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】G01N33/569GK103483449SQ201310362878
【公開日】2014年1月1日 申請(qǐng)日期:2013年8月20日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月20日
【發(fā)明者】尹杰超, 周兵, 李天鶴, 李德山, 張瑛杰, 張立夏 申請(qǐng)人:東北農(nóng)業(yè)大學(xué)