一種表征聚電解質(zhì)水凝膠平板膜厚度的改進方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種表征聚電解質(zhì)水凝膠平板膜厚度的改進方法。將熒光標記的聚陽離子（或/和聚陰離子），通過靜電作用形成聚電解質(zhì)水凝膠平板膜，在確定激光共聚焦掃描顯微鏡gain值和offset值之后，借助激光共聚焦掃描顯微鏡，對平板水凝膠膜的Z軸進行層層掃描，可得到一系列的層掃照片，再對層掃照片進行熒光強度定量，會得到熒光強度與Z軸步進值的關系曲線，再對曲線進行分段擬合及分段求導，導數(shù)最大值和最小值所對應Z軸步進值的差即為凝膠膜的厚度。
【專利說明】一種表征聚電解質(zhì)水凝膠平板膜厚度的改進方法

【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及材料領域，是一種表征聚電解質(zhì)水凝膠平板膜厚度的方法。

【背景技術】
[0002]膜厚是表征膜的一個重要參數(shù)。目前有關聚電解質(zhì)水凝膠膜厚度測量方法主要有光學顯微鏡觀察法，測微器測量法和熒光標記方法。光學顯微鏡觀察法適用于比較厚的球形凝膠膜及平板凝膠膜，不適用于薄的平板凝膠膜。測微器測量法是將凝膠膜干燥后，測量凝膠膜厚度的方法；由于凝膠含水量很高，干燥后測得的凝膠膜厚度與真實凝膠膜厚度相差很大，因此這個方法使用受到限制。熒光標記方法是利用熒光探針標記的聚陽離子(或聚陰離子)，利用激光共聚焦掃描顯微鏡對Z軸進行層層掃描、三維重建，通過在三維重建形成的左視圖或主視圖劃線，與標尺比對，確定凝膠膜厚度。由于激光共聚焦掃描顯微鏡的gain和offset值對凝膠膜厚度影響很大(見圖1)，因此需要“參比”確定激光共聚焦掃描顯微鏡的gain和offset值。目前采用激光共聚焦測凝膠膜厚度方法存在以下問題:無法對激光共聚焦掃描顯微鏡gain和offset值進行確定且邊界不易確定，人為因素影響大。
[0003]針對上述問題，本專利建立了激光共聚焦掃描顯微鏡gain和offset值確定方法及凝膠膜邊界的確定方法，可對聚電解質(zhì)水凝膠膜厚進行準確定量。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種可精確測量聚電解質(zhì)絡合水凝膠平板膜厚度的方法。
[0005]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術方案為:
[0006]一種表征聚電解質(zhì)絡合水凝膠平板膜厚度的改進方法，借助于激光共聚焦掃描顯微鏡進行操作，利用熒光標記的方法測平板凝膠膜的厚度。首先熒光探針標記聚陽離子，以熒光標記的聚陽離子與聚陰離子形成的凝膠微球膜為陽性對照，確定激光共聚焦掃描顯微鏡gain值和offset值；
[0007]采用熒光標記的聚陽離子聚合物溶液與聚陰離子聚合物形成的平板水凝膠反應，形成聚電解質(zhì)絡合水凝膠平板膜；采用已確定的激光共聚焦掃描顯微鏡gain值和offset值，利用激光共聚焦掃描顯微鏡對平板水凝膠膜的Z軸(Z軸方向:垂直于平板凝膠膜表面的方向)進行層層掃描，層掃厚度為0.5-10 μ m/層，可得到一系列層掃照片；
[0008]為表征水凝膠膜的厚度，需確定凝膠膜上層及下層邊界:利用Image J軟件確定層掃照片的熒光強度，會得到熒光強度與Z軸步進值(步進值:層掃厚度與每層層掃照片對應的層數(shù)之積)的關系曲線；再利用Origin軟件對曲線進行分段(可分為3段:熒光強度增加階段、熒光強度平衡階段和熒光強度降低階段)擬合及分段求導，導數(shù)最大值和最小值所對應Z軸步進值定義為凝膠膜上層及下層邊界；導數(shù)最大值和最小值所對應Z軸步進值的差即為凝膠膜的厚度。
[0009]A、熒光探針標記聚陽離子聚合物，并配制標記的聚陽離子聚合物溶液。
[0010]B、將聚陰離子溶液置于載玻片上，通過化學或物理等交聯(lián)劑形成聚陰離子水凝膠。
[0011]C、將粘附在載玻片上的聚陰離子水凝膠浸于熒光標記的聚陽離子聚合物溶液中，使其充分反應后，即形成聚電解質(zhì)水凝膠平板膜，生理鹽水清洗。
[0012]D、以步驟A獲得的熒光標記陽離子聚合物制備的水凝膠微球膜為陽性對照，確定激光共聚焦掃描顯微鏡的gain值和offset值，采用激光共聚焦掃描顯微鏡對凝膠平板膜在Z軸上進行層層掃描。
[0013]E、對層掃照片進行熒光強度定量，得到熒光強度與Z軸步進值的關系曲線，再對曲線進行分段擬合及分段求導，導數(shù)最大值和最小值所對應Z軸步進值的差即為凝膠膜的厚度。
[0014]所述聚電解質(zhì)水凝膠平板膜中的聚陽離子為殼聚糖及其衍生物，α或ε聚賴氨酸，聚鳥氨酸、聚精氨酸，聚胺及其衍生物、聚酰胺及其衍生物、聚酰亞胺及其衍生物，及上述聚陽離子的共聚物中的一種或二種以上，分子量在lkDa-500kDa。
[0015]所述聚電解質(zhì)水凝膠平板膜中的聚陰離子為海藻酸鹽、透明質(zhì)酸鹽及纖維素硫酸鹽，及上述聚陰離子的共聚物中的一種或二種以上，分子量在lkDa-2000kDa。
[0016]所述熒光標記的聚陽離子為熒光標記反應后通過反復清洗抽濾、透析或者凝膠柱分離等方法純化后的聚合物。
[0017]本發(fā)明具有以下優(yōu)點:
[0018]1、對激光共聚焦測凝膠膜厚度條件進行了確定，為真實表征凝膠膜厚度提供了條件。
[0019]2、采用曲線擬合及邊界求導方法，可準確確定凝膠膜厚度邊界。
[0020]3、激光共聚焦掃描顯微鏡測凝膠厚度的分別率高，可檢測凝膠膜厚度的下限為3 μ m。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0021]圖1激光共聚焦掃描顯微鏡的gain和offset值對凝膠膜厚度的影響，光鏡下觀察微囊膜厚為?ο μ m，此數(shù)值為真實膜厚，綠色為微囊膜:(a)光鏡下AC微囊；(b)Gain:335V，off set:-20%，激光共聚焦顯微鏡下綠色熒光對應膜厚為10 μ m，與真實值相同；(c)Gain: 430V，off set:-20%，激光共聚焦顯微鏡下綠色熒光對應的膜厚為48 μ m，遠大于真實值；(d) Gain:480V，off set:-20%，激光共聚焦顯微鏡下綠色熒光對應膜厚為99 μ m，遠遠大于真實值，嚴重失真。
[0022]圖2以FITC標記的殼聚糖溶液與海藻酸鈣膠珠形成的AC微囊膜為參比，確定激光共聚焦掃描顯微鏡的gain值和offset值，綠色為AC微囊膜(放大倍數(shù):1000倍)。
[0023]圖3采用激光共聚焦掃描顯微鏡對AC平板膜的Z軸進行層層掃描，得到一系列圖片。
[0024]圖4對每層層掃照片進行熒光強度定量，會得到熒光強度與Z軸步進值的關系曲線。
[0025]圖5對圖4曲線進行擬合，并分別求導，導數(shù)最大值和最小值對應Z軸步進值(Zi和Z2)的差即為凝膠膜的厚度。

【具體實施方式】
[0026]比較實施例:
[0027]將lg殼聚糖溶于醋酸/醋酸鈉緩沖體系，用4M NaOH溶液調(diào)殼聚糖溶液pH至中性。將lmg/ml FITC溶液(溶劑為甲醇)緩慢滴加到殼聚糖溶液中反應12h。采用4M NaOH溶液沉淀殼聚糖，50%乙醇洗至中性，100%乙醇洗至490nm處無吸收后，真空干燥過夜。配制0.5% (m/v, g/ml)FITC標記的殼聚糖溶液。采用微囊制備儀制備海藻酸鈣微球。將海藻酸鈉溶液置于載玻片上，浸于1.l%CaCl2溶液中，鈣化30min形成海藻酸鈣凝膠。將粘附在載玻片上的海藻酸鈣凝膠及海藻酸鈣微球浸于FITC標記的殼聚糖溶液中，使其充分反應，分別形成熒光標記的AC微囊膜和平板AC凝膠膜。
[0028]以FITC標記的殼聚糖溶液與海藻酸鈣膠珠形成的AC微囊膜為參比，確定激光共聚焦掃描顯微鏡的gain值和offset值，見圖1。(a)光鏡下AC微囊；(b)Gain:335V，off set:-20%，激光共聚焦顯微鏡下綠色熒光對應膜厚為10 μ m，與真實值相同；(c)Gain: 430V，off set:-20%，激光共聚焦顯微鏡下綠色熒光對應的膜厚為48 μ m，遠大于真實值；(d) Gain:480V，off set:-20%，激光共聚焦顯微鏡下綠色熒光對應膜厚為99 μ m，遠遠大于真實值，嚴重失真。由此可見，如果不通過AC微囊膜為參比，確定激光共聚焦掃描顯微鏡的gain值和offset值，直接對平板膜進行掃描會對實驗結(jié)果帶來很大的人為誤差。
[0029]實施例:一種表征海藻酸鈉-殼聚糖水凝膠平板膜厚度的方法
[0030]將lg殼聚糖溶于醋酸/醋酸鈉緩沖體系，用4M NaOH溶液調(diào)殼聚糖溶液pH至中性。將lmg/ml FITC溶液(溶劑為甲醇)緩慢滴加到殼聚糖溶液中反應12h。采用4M NaOH溶液沉淀殼聚糖，50%乙醇洗至中性，100%乙醇洗至490nm處無吸收后，真空干燥過夜。配制濃度為0.5% (w/v，g/ml)FITC標記殼聚糖溶液。將海藻酸鈉溶液置于載玻片上，浸于1.l%CaCl2溶液中，鈣化30min形成海藻酸鈣凝膠。將粘附在載玻片上的海藻酸鈣凝膠浸于FITC標記的殼聚糖溶液中，使其充分反應。
[0031]以FITC標記的殼聚糖溶液與海藻酸鈣膠珠形成的AC微囊膜為參比，當光鏡下微囊膜與熒光標記的膜(綠色代表膜)完全重疊時，確定激光共聚焦掃描顯微鏡的gain值和offset值(Gain:335V, offset:-20%),見圖2。采用確定的gain及offset值對凝膠進行層層掃描，會得到一系列的圖片，見圖3。采用Image J軟件中R0I manager功能，分析每張圖片的突光強度(Fluorescence intensity),可得到這一系列圖片對應的突光強度。以Z軸步進值(即層掃厚度與對應照片層數(shù)之乘積)為橫坐標，以熒光強度為縱坐標，可得到熒光強度與Z軸步進值之間的關系曲線，見圖4。可將曲線分為3段，“增加階段”、“平衡階段”及“降低階段”，再利用Origin軟件中非線性擬合中Bolzman方程對增加階段和降低階段進行分段擬合，可得到導數(shù)最大值和導數(shù)最小值對應的Z軸步進值Z1和Z2，凝膠膜厚度為“Z2-Z1”，見圖5。結(jié)果表明，凝膠膜厚度為20.74 μ m。
【權利要求】
1.一種表征聚電解質(zhì)絡合水凝膠平板膜厚度的改進方法，其特征在于: 借助于激光共聚焦掃描顯微鏡進行操作，利用熒光標記的方法測平板凝膠膜的厚度。首先熒光探針標記聚陽離子，以熒光標記的聚陽離子與聚陰離子形成的凝膠微球膜為陽性對照，確定激光共聚焦掃描顯微鏡gain值和offset值； 采用熒光標記的聚陽離子聚合物溶液與聚陰離子聚合物形成的平板水凝膠反應，形成聚電解質(zhì)絡合水凝膠平板膜；采用已確定的激光共聚焦掃描顯微鏡gain值和offset值，利用激光共聚焦掃描顯微鏡對平板水凝膠膜的Z軸(Z軸方向:垂直于平板凝膠膜表面的方向)進行層層掃描，層掃厚度為0.5-10 μ m/層，可得到一系列層掃照片； 為表征水凝膠膜的厚度，需確定凝膠膜上層及下層邊界:利用Image J軟件確定層掃照片的熒光強度，會得到熒光強度與Z軸步進值(步進值:層掃厚度與每層層掃照片對應的層數(shù)之積)的關系曲線；再利用Origin軟件對曲線進行分段(可分為3段:熒光強度增加階段、熒光強度平衡階段和熒光強度降低階段)擬合及分段求導，導數(shù)最大值和最小值所對應Z軸步進值定義為凝膠膜上層及下層邊界；導數(shù)最大值和最小值所對應Z軸步進值的差即為凝膠膜的厚度。
2.按照權利要求1所述的方法，其特征在于:所述表征膜厚的具體步驟如下: A、熒光探針標記聚陽離子聚合物，并配制標記的聚陽離子聚合物溶液； B、將聚陰離子溶液置于載玻片上，通過化學或物理等交聯(lián)劑形成聚陰離子水凝膠； C、將粘附在載玻片上的聚陰離子水凝膠浸于熒光標記的聚陽離子聚合物溶液中，使其充分反應后，即形成聚電解質(zhì)水凝膠平板膜，生理鹽水清洗； D、以步驟A獲得的熒光標記陽離子聚合物制備的水凝膠微球膜為陽性對照，確定激光共聚焦掃描顯微鏡的gain值和offset值，采用激光共聚焦掃描顯微鏡對平板凝膠膜的Z軸方向進行層層掃描； E、對層掃照片進行熒光強度定量，得到熒光強度與Z軸步進值的關系曲線，再對曲線進行分段擬合及分段求導，導數(shù)最大值和最小值所對應Z軸步進值的差即為凝膠膜的厚度。
3.按照權利要求1所述的方法，其特征在于:所述聚電解質(zhì)水凝膠平板膜中的聚陽離子為殼聚糖及其衍生物，α或ε聚賴氨酸，聚鳥氨酸、聚精氨酸，聚胺及其衍生物、聚酰胺及其衍生物、聚酰亞胺及其衍生物，及上述聚陽離子的共聚物中的一種或二種以上，分子量在 lkDa_500kDa。
4.按照權利要求1所述的方法，其特征在于:所述聚電解質(zhì)水凝膠平板膜中的聚陰離子為海藻酸鹽、透明質(zhì)酸鹽及纖維素硫酸鹽，及上述聚陰離子的共聚物中的一種或二種以上，分子量在lkDa-2000kDa。
5.按照權利要求1所述的方法，其特征在于:所述熒光標記的聚陽離子為熒光標記反應后通過反復清洗抽濾、透析或者凝膠柱分離等方法純化后的聚合物。
【文檔編號】G01B11/06GK104422394SQ201310375432
【公開日】2015年3月18日 申請日期:2013年8月22日 優(yōu)先權日:2013年8月22日
【發(fā)明者】馬小軍, 宋益哲, 于煒婷, 王秀麗, 徐小溪, 鄭國爽, 李楠 申請人:中國科學院大連化學物理研究所