一種人α-乳清白蛋白夾心ELISA檢測(cè)試劑盒及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種人α-乳清白蛋白的夾心ELISA檢測(cè)試劑盒，包括包被抗體和酶標(biāo)抗體，其中所述包被抗體為人α-乳清白蛋白多克隆抗體，所述酶標(biāo)抗體為人α-乳清白蛋白單克隆抗體。本發(fā)明可用于轉(zhuǎn)基因成分定量檢測(cè)。該方法采用夾心ELISA法，敏感、特異、操作方便。CGMCC No745920130426
【專利說(shuō)明】-種人a -乳清白蛋白夾心ELISA檢測(cè)試劑盒及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物檢測(cè)領(lǐng)域，具體來(lái)說(shuō)涉及人a -乳清白蛋白夾也化ISA檢測(cè)試劑 盒及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 在轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項(xiàng)和國(guó)家其他經(jīng)費(fèi)的資助下，我國(guó)轉(zhuǎn)基因豬、牛 和羊新品種研發(fā)獲得了蓬勃發(fā)展，多個(gè)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物品種展示了良好的產(chǎn)業(yè)化前景，其中發(fā) 展最為迅速的是乳腺生物反應(yīng)器的利用，目前轉(zhuǎn)人a-乳清白蛋白基因奶牛已經(jīng)通過(guò)了農(nóng) 業(yè)部規(guī)定的中間試驗(yàn)、環(huán)境釋放及生產(chǎn)性試驗(yàn)。
[0003] 由于轉(zhuǎn)基因生物及其產(chǎn)品存在風(fēng)險(xiǎn)，轉(zhuǎn)基因生物及產(chǎn)品的管理一直受到各國(guó)政府 的高度重視。牛奶和奶制品是人們餐桌上最常見(jiàn)的一類食物，食品安全直接關(guān)系民生，在 沒(méi)有足夠的數(shù)據(jù)證明其安全之前，質(zhì)檢機(jī)構(gòu)均有責(zé)任和義務(wù)去檢測(cè)和監(jiān)測(cè)該些已上市或即 將上市的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品。開(kāi)發(fā)一種實(shí)用、靈敏、特異的人a-乳清白蛋白成分檢測(cè)試劑十分必 要。
[0004] 目前用于檢測(cè)a -乳清白蛋白的方法主要有高效液相色譜法、毛細(xì)管電泳法、放 射性免疫法和酶聯(lián)免疫吸附法等，但是檢測(cè)人a-乳清白蛋白的報(bào)道卻并不多。雙抗體夾 也化ISA又稱抗原捕捉化ISA，該方法已被大量用于動(dòng)物疫病的臨床診斷，該方法最關(guān)鍵的 條件是制備高純度的包被抗體，純度越高，則特異性越好，但尚無(wú)人a-乳清白蛋白轉(zhuǎn)基因 成分雙抗體夾也化ISA檢測(cè)方法的報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題，本發(fā)明目的是提供一種人a-乳清白蛋白夾也 ELISA檢測(cè)試劑盒。
[0006] 本發(fā)明另一目的是提供人a-乳清白蛋白夾也ELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)人a-乳清 白蛋白的方法。
[0007] 本發(fā)明再一目的是提供人a -乳清白蛋白夾也化ISA檢測(cè)試劑盒在檢測(cè)轉(zhuǎn)基因牛 奶及奶制品中人a-乳清白蛋白含量中的應(yīng)用。
[0008] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明首先提供了 一種人a -乳清白蛋白的夾也ELISA 檢測(cè)試劑盒，包括包被抗體和酶標(biāo)抗體，其中所述包被抗體為人a-乳清白蛋白多克隆抗 體，所述酶標(biāo)抗體為人a-乳清白蛋白單克隆抗體。
[0009] 其中，所述人a -乳清白蛋白單克隆抗體由保藏號(hào)為CGMCC N0:7459的雜交瘤細(xì) 胞株分泌獲得。
[0010] 雜交瘤細(xì)胞ZZY hLY7El，保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中也 (簡(jiǎn)稱CGMCC，地址；北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵政編 碼；100101)，保藏日期為2013年4月26日，保藏編號(hào)為CGMCC No. 7459。
[0011] 用原核表達(dá)重組蛋白hLA免疫雌性BALB/c小鼠，取脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞 融合，經(jīng)化ISA法進(jìn)行陽(yáng)性克隆篩選、通過(guò)有限稀釋法進(jìn)行亞克隆，獲得穩(wěn)定分泌抗hLA的 1株細(xì)胞7E1。取雜交瘤細(xì)胞注射至小鼠腹腔，收集腹水，親和柱純化得單克隆抗體。
[0012] 細(xì)胞7E1能與免疫原h(huán)LA反應(yīng)，不與篩選原牛a-乳清白蛋白（bLA)反應(yīng)。Western Blot檢測(cè)顯示抗體7E1只與轉(zhuǎn)基因牛奶及奶粉反應(yīng)，不與非轉(zhuǎn)基因牛奶及奶粉反應(yīng)。
[0013] 其中，所述酶標(biāo)抗體的標(biāo)記酶為辣根過(guò)氧化物酶。
[0014] 其中，所述人a-乳清白蛋白多克隆抗體是W人a-乳清白蛋白作為免疫抗原，分 批次免疫正常家兔，加強(qiáng)免疫后7天收集血清，分離純化得到。
[0015] 純化抗體通過(guò)考馬斯亮藍(lán)驗(yàn)證，多克隆抗體能滿足要求，濃度約為Img/mL。采用間 接化ISA法對(duì)抗體IgG進(jìn)行鑒定，抗體效價(jià)達(dá)到1 : 200, 000。
[0016] 其中，檢測(cè)樣本中免疫抗原檢測(cè)限為250ng/mL。
[0017] 進(jìn)一步地，所述人a -乳清白蛋白的夾也化ISA檢測(cè)試劑盒還包括W下試劑中的 一種或幾種：
[001引 1)洗徐液;
[001引 2)底物顯色液；
[0020] 3)反應(yīng)終止液；
[0021] 4)人a-乳清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品。
[0022] 更進(jìn)一步地，所述洗涂液為PBST，所述底物顯色液為TMB，所述反應(yīng)終止液為 2mol/L H2SO4。
[0023] 本發(fā)明還提供了前述試劑盒檢測(cè)人a -乳清白蛋白的方法，包括如下步驟：
[0024] 1)向包被人a -乳清白蛋白多克隆抗體的酶聯(lián)板中加入人a -乳清白蛋白抗原標(biāo) 準(zhǔn)品和待檢測(cè)樣品，洗涂液洗板；
[002引 2)加入酶標(biāo)人a -乳清白蛋白單克隆抗體，洗涂液洗板；
[0026] 3)加入底物顯色液顯色，加入反應(yīng)終止液終止反應(yīng)，測(cè)定0D450值；
[0027] 4) W人a-乳清白蛋白抗原標(biāo)準(zhǔn)品的劑量-效應(yīng)曲線為標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品人 a-乳清白蛋白的含量。
[0028] 本發(fā)明還提供了前述試劑盒在檢測(cè)轉(zhuǎn)基因牛奶及奶制品中人a -乳清白蛋白含 量中的應(yīng)用。
[0029] 具體包括W下步驟：
[0030] I I gG標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立：
[0031] 將人a-乳清白蛋白多克隆抗體包被于酶聯(lián)板上，洗板；封閉經(jīng)包被的酶聯(lián)板，洗 板；加入不同濃度的人a-乳清白蛋白抗原標(biāo)準(zhǔn)品溶液，洗板；加入酶標(biāo)人a-乳清白蛋白 單克隆抗體，洗板；加底物顯色；終止反應(yīng)；測(cè)定0D450值，W與陰性對(duì)照孔0D值的比值大 于2. 1為限，作為判斷為陽(yáng)性或確定效價(jià)的臨界點(diǎn)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0032] II檢測(cè)樣品中人a-乳清白蛋白的含量：
[0033] 將人a-乳清白蛋白多克隆抗體包被于酶聯(lián)板上，洗板；封閉經(jīng)包被的酶聯(lián)板，洗 板；加入待檢測(cè)樣品，洗板；加入酶標(biāo)人a-乳清白蛋白單克隆抗體，洗板；加底物顯色；終 止反應(yīng)；測(cè)定0D450值，通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)曲線比對(duì)，定量檢測(cè)人a -乳清白蛋白。
[0034] 優(yōu)選地，人a -乳清白蛋白多克隆抗體濃度為20y g/mU包被液為抑9. 6磯酸緩沖 液，酶標(biāo)人a-乳清白蛋白單克隆抗體稀釋倍數(shù)為1:500。
[0035] 具體實(shí)施步驟如下：
[0036] 1、IgG標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立：
[0037] (1)包被；濃度為20 y g/mL兔多克隆抗體，100 y L/孔，4°C過(guò)夜，洗液洗涂3次； [003引（2)封閉；加150 uL/孔封閉液，37C 2小時(shí)后，洗涂3次，拍干，置4C冰箱保存?zhèn)?用；
[0039] (3)加標(biāo)準(zhǔn)樣品：
[0040] 混合轉(zhuǎn)基因樣品和非轉(zhuǎn)基因樣品制備人a -乳清白蛋白抗原標(biāo)準(zhǔn)品，標(biāo)準(zhǔn)品原始 濃度為2mg/mL，分別按照1:2、1: 4、1:8、1:16、1:32、1:64稀釋，PBS作為陰性對(duì)照；加入不同 濃度的人a-乳清白蛋白抗原標(biāo)準(zhǔn)品溶液100 UL/孔，37C賠育30min，洗板4次，拍干；
[0041] (4)加二抗：小鼠單克隆抗體-HRP抗體，按1:500的稀釋比例加入，37C賠育 20min，洗板4次，拍干；
[0042] (5)顯色；TMB 按 lOOy L/孔加入，37°C顯色 15-30min ;
[004引 （6)終止；加入終止液2M恥0450 y L/孔；
[0044] (7)讀數(shù)；W 450皿單波長(zhǎng)測(cè)定各孔0D值，W與陰性對(duì)照孔0D值的比值大于2. 1 為限，作為判斷為陽(yáng)性或確定效價(jià)的臨界點(diǎn)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0045] 2、檢測(cè)樣品中人a-乳清白蛋白的含量：
[0046] (1)包被；濃度為20 y g/mL兔多克隆抗體，100 y L/孔，4°C過(guò)夜，洗液洗涂3次；
[0047] (2)封閉；加150 uL/孔封閉液，37C 2小時(shí)后，洗涂3次，拍干，置4C冰箱保存?zhèn)?用；
[0048] (3)加待測(cè)樣品：
[0049] 加入待測(cè)樣品，lOOy L/孔，37C賠育30min，洗板4次，拍干；
[0050] (4)加二抗：小鼠單克隆抗體-HRP抗體，按1:500的稀釋比例加入，37C賠育 20min，洗板4次，拍干；
[0051] (5)顯色；TMB 按 lOOy L/孔加入，37°C顯色 15-30min ;
[0052] (6)終止；加入終止液2M H2SO45O y L/孔；
[005引 （7)讀數(shù)：W 450nm單波長(zhǎng)測(cè)定各孔0D值，通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)曲線比對(duì)，定量檢測(cè)人 a-乳清白蛋白。
[0054] 本發(fā)明的有益效果；本發(fā)明的人a-乳清白蛋白單克隆抗體純度高，效價(jià)高，靈敏 度高，無(wú)交叉反應(yīng)，專一性強(qiáng)，可特異性識(shí)別轉(zhuǎn)基因樣品，可直接對(duì)外源表達(dá)蛋白進(jìn)行檢測(cè)， 同時(shí)避免了核酸檢測(cè)方法中，基因提取費(fèi)時(shí)費(fèi)力且容易污染的問(wèn)題。本發(fā)明可用于轉(zhuǎn)基因 牛奶及奶制品中人a-乳清白蛋白的定量檢測(cè)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線在250?2000ng/mL范圍內(nèi) 線性良好，可實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品的高特異性和高靈敏度檢測(cè)，檢測(cè)成本低廉，結(jié)果迅速，靈敏可靠， 而且可W穩(wěn)定、方便地提供準(zhǔn)化的試劑，便于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[00巧]圖1為免疫抗原（6his-MBP-CCG343)及檢測(cè)抗原（PGEX-6P-1-CCG343)的表達(dá)純 化；
[0056]其中，la ;化is-MBP-CCG343 樣品；化：化is-MBP-CCG343 穿柱液；Ic ; 化is-MBP-CCG343 洗脫 1 ;ld ;化is-MBP-CCG343 洗脫 2 ;2a ;PGEX-6P-1-CCG343 樣品；2b ; PGEX-6P-1-CCG343 穿柱；2c ;PGEX-6P-1-CCG343 洗脫 1 ;2d ;PGEX-6P-1-CCG343 洗脫 2 ;
[0057] 圖2為實(shí)施例2Western-blot檢測(cè)結(jié)果圖；
[0058] 其中，1 為 PGEX-6P-1-CCG343 ;2 為化is-MBP-CCG343 ;
[0059] 圖3為雜交瘤細(xì)胞上清與樣品Wester-blot試驗(yàn)結(jié)果；
[0060] 其中，3;轉(zhuǎn)人乳鐵蛋白基因奶牛牛奶樣品；5;牛乳清白蛋白；4;轉(zhuǎn)人a-乳清白 蛋白基因奶粉樣品；
[0061] 圖4為轉(zhuǎn)基因牛奶及奶粉樣品Western Blot檢測(cè)；
[0062] 其中，1;轉(zhuǎn)人a-乳清白蛋白基因牛奶樣品；2;轉(zhuǎn)人a-乳清白蛋白基因奶粉樣 品；3合元極致牛奶樣品；4 ;人a -乳清白蛋白；5 ;牛a -乳清白蛋白；6合元極致牛奶樣 品；
[0063] 圖5為轉(zhuǎn)基因牛奶樣品的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線。

【具體實(shí)施方式】
[0064] W下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。
[0065] 轉(zhuǎn)人a-乳清白蛋白基因奶牛樣品來(lái)自中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí) 驗(yàn)室；單克隆抗體和多克隆抗體由中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院動(dòng)檢實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建；日本大耳白 兔購(gòu)自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中也；人a -乳清白蛋白購(gòu)自Sigma公司。
[0066] 酶標(biāo)板購(gòu)自宏捷成生物公司；HRP標(biāo)記試劑盒（CatNo31488)購(gòu)自Pierce公司；山 羊抗小鼠IgG-HRP、山羊抗兔IgG-HRP購(gòu)自中杉金橋生物公司；TMB (可溶型）購(gòu)自天根生 物公司；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、96孔酶標(biāo)板購(gòu)自北京宏捷成生物科技有限公司； IgG純化試劑盒購(gòu)自嘉興行建生物科技有限公司，石蠟油購(gòu)自BBI公司。
[0067] 層析柱購(gòu)自化amacia公司；潤(rùn)旋儀購(gòu)自江蘇?？谑衅淞重悹柟?；高速微量離也 機(jī)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；ElixRMilliQRBiocelTM純水系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Millipore公司；舒適 性恒溫儀購(gòu)自eppendcxrf公司；臺(tái)式冷凍離也機(jī)、真空濃縮儀購(gòu)自eppendcxrf公司；電熱恒 溫水浴鍋購(gòu)自PolyScience公司；Nano化oplOOO紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì)購(gòu)自Nano化op公 司；恒溫鼓風(fēng)干燥箱、搖床購(gòu)自中國(guó)智成公司；紫外凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自UVP公司；PYY-6C型 穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀、DYCP-31C微型水平電泳槽購(gòu)自北京六一廠；高壓滅菌鍋、-8(TC冰箱購(gòu)自 日本H洋公司；混合型球磨儀購(gòu)自Retsch公司；酶標(biāo)儀，BI0-RAD。
[0068] 轉(zhuǎn)基因牛奶、奶粉樣品來(lái)自中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，非轉(zhuǎn)基 因牛奶及脫脂奶粉購(gòu)自超市。
[0069] 實(shí)施例1原核表達(dá)人a -乳清白蛋白
[0070] 1、委巧寶生物工程(大連）有限公司合成429bp的人a-乳清白蛋白基因連接到 pMBP和PGEX-6P-1載體，分別命名為化is-MBP-CCG343和PGEX-6P-1-CCG343,表達(dá)并純化 兩種蛋白，其中化is-MBP-CCG343為制備單克隆抗體的免疫抗原，PGEX-6P-1-CCG343為制 備單克隆抗體的檢測(cè)抗原，蛋白純化見(jiàn)圖1。其中洗脫1+洗脫2作為免疫抗原，共lOmL (0. 8mg/ml)，洗脫1+洗脫3作為檢測(cè)抗原共4mL (0. 7mg/ml)
[0071] 實(shí)施例2制備人乳清白蛋白多克隆抗體，并對(duì)原核表達(dá)的兩種蛋白進(jìn)行驗(yàn)證
[0072] 1、兔免疫血清的制備
[0073] 選擇同一批次健康的雌性日本大耳白兔4只，隨機(jī)分為2組，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，實(shí) 驗(yàn)組3只免疫h(yuǎn)LA (sigma),對(duì)照組1只用PBS緩沖液代替hLA免疫，每只兔子皮下注射總 量為2mL用佐劑乳化好的抗原，每只兔子5mg，在第3次加強(qiáng)免疫，每只兔子5mg，后7天，耳 靜脈采血，檢測(cè)血清中抗體滴度（間接化ISA法)，如滴度未達(dá)到1:10 4, 0D1.0 W上，則再加 強(qiáng)免疫。在抗體滴度已達(dá)到1: 1〇4后的第10天，也臟采集兔血，分離血清，-2(TC保存?zhèn)溆谩?[0074] 2、多克隆抗體的提取
[00巧]采用IgG的純化提取試劑盒，按說(shuō)明書(shū)提取血清中的IgG，具體操作如下：
[007引 （1) 10血平衡緩沖液平衡柱子，流速為1血/min ;
[0077] (2) 1血注射器將抗體推入純化柱中上樣；
[0078] (3) lOmL的結(jié)合緩沖液沖洗柱子，流出的液體收集在EP管中；
[0079] (4) 4mL洗脫液進(jìn)行洗脫，每血洗脫蛋白加0. 1血中和緩沖液。
[0080] (5)收集的液體用考馬斯亮藍(lán)測(cè)定濃度，-2(TC儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?br> [0081] 純化結(jié)果通過(guò)考馬斯亮藍(lán)驗(yàn)證，洗脫管2和洗脫管3能滿足要求，濃度約為2mg/ mL。
[0082] 3、多克隆抗體與原核表達(dá)載體Western-blot試驗(yàn)
[0083] 選擇1號(hào)管和2號(hào)管的兔血清分別與PGEX-6P-1-CCG343和化is-MBP-CCG343進(jìn) 行Western-blot試驗(yàn)，結(jié)果在相應(yīng)位置均有目的條帶，見(jiàn)圖2。
[0084] 由于多克隆抗體的免疫抗原與原核表達(dá)的抗原來(lái)源不同，前者來(lái)源于人奶(產(chǎn)品 編號(hào)L7269 I CAS號(hào)9051-29-0 I Sigma)此結(jié)果證實(shí)表達(dá)的抗原具有結(jié)合相應(yīng)抗體的能力，可 用于制備單克隆抗體，前期工作中也嘗試使用編號(hào)為L(zhǎng)7269的抗原制備單克隆抗體，但結(jié) 果未篩選到特異性的單克隆抗體，所W后期使用原核表達(dá)的抗原制備單克隆抗體。
[0085] 實(shí)施例3單克隆抗體抗體的制備 [008引1、小鼠抗體的制備
[0087] 選擇6周齡同一批次健康的雌性Ba化/c小鼠10只作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，隨機(jī)分為2組， 實(shí)驗(yàn)組5只（1#、2#、3#、4#、5#小鼠)，對(duì)照組2只。實(shí)驗(yàn)組用化13-18?-〇：6343作為免疫 原進(jìn)行免疫，用PBS緩沖液代替hLA進(jìn)行免疫作為陰性對(duì)照。每只小鼠皮下注射總量為 100 y L用佐劑乳化好的抗原（250 y LPBS溶解Img抗原后與250 y L弗氏不完全佐劑混合， 共500 y L，每只小鼠注射100 y L)。第一次基礎(chǔ)免疫劑量為每只小鼠200 y g，加強(qiáng)免疫免 疫劑量為每只小鼠200 y g，基礎(chǔ)免疫時(shí)使用弗氏完全佐劑乳化，加強(qiáng)免疫時(shí)用弗氏不完全 佐劑乳化?；A(chǔ)免疫后間隔10天進(jìn)行加強(qiáng)免疫。共免疫3次，小鼠在第3次加強(qiáng)免疫后7 天，尾靜脈采血，檢血清中抗體滴度（間接ELISA法)，如滴度未達(dá)到1:10 4，0D1. 0 W上，則 再加強(qiáng)免疫。在抗體滴度達(dá)到1: 1〇4后的第10天眼眶采血，分離血清，-2(TC保存?zhèn)溆谩?[008引 2、間接ELISA法檢測(cè)免疫小鼠的抗體水平
[0089] W PGEX-6P-1-CCG343作為包被抗原，包被濃度；10 y g/mU利用間接化ISA法檢測(cè) 血清抗體水平。實(shí)驗(yàn)組血清稀釋倍數(shù)依次為；1:1000、1:3000、1:9000、1:27000、1:81000、 1:240000、1:720000 ;對(duì)照組血清 1:3000 稀釋。
[0090] hLA間接ELISA法測(cè)定的基本操作步驟如下：
[0091] (1)包被；將PGEX-6P-1-CCG343用包被液(磯酸緩沖液抑9. 6)稀釋至10 y g/mL， 用微量加樣器吸取稀釋后的抗原加入96孔酶標(biāo)板，100 y L/孔，置4°C冰箱過(guò)夜；
[0092] (2)洗涂；取出ELISA板，棄去孔內(nèi)液體，在紙巾上輕輕叩打W除去殘留液體，加入 PBST洗涂液，300 y L/孔，靜置Imin，重復(fù)操作3?5次；
[009引 （3)封閉；用微量加樣器按200 y L/孔加1%BSA，放入37C溫箱化；
[0094] (4)洗涂；同步驟2);
[009引（5)加待檢樣本；用PBS緩沖液將血清稀釋，血清稀釋倍數(shù)依次為；1:400、1:800、 1:1600、1:3200、1:6400、1:12800、1:25600 ;放入 37C溫箱比；
[009引 （6)洗涂；同步驟2);
[0097] (7)加酶標(biāo)抗體；用PBST洗涂液將HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗稀釋到工作濃度 1:5000,每孔加 100 y L，37°C溫箱賠育 45min ;
[009引 （8)洗涂；同步驟2);
[0099] (9)加底物溶液；避光按100 y L/孔加入TMB底物溶液，室溫賠育15min ;
[0100] (10)終止反應(yīng)：室溫下加終止液50 y L/孔，終止反應(yīng)；
[0101] (11)測(cè)0D450值；檢測(cè)450皿波長(zhǎng)下的0D值，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。
[0102] 表1.經(jīng)H次免疫后小鼠血清效價(jià)的測(cè)定結(jié)果
[0103]

【權(quán)利要求】
1. 一種人a-乳清白蛋白的夾心ELISA檢測(cè)試劑盒，包括包被抗體和酶標(biāo)抗體，其中， 所述包被抗體為人a-乳清白蛋白多克隆抗體，所述酶標(biāo)抗體為人a-乳清白蛋白單克隆 抗體。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述人a _乳清白蛋白單克隆抗體由保 藏號(hào)為CGMCC NO:7459的雜交瘤細(xì)胞株分泌獲得。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述酶標(biāo)抗體的標(biāo)記酶為辣根過(guò)氧化 物酶。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的試劑盒，其特征在于，還包括以下試劑中的一種或 幾種： 1) 洗滌液； 2) 底物顯色液； 3) 反應(yīng)終止液； 4) 人a-乳清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述洗滌液為PBST，所述底物顯色液為 TMB，所述反應(yīng)終止液為2mol/L H2S04。
6. 利用權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的試劑盒檢測(cè)人a-乳清白蛋白的方法，包括如下步 驟： 1) 向包被人a-乳清白蛋白多克隆抗體的酶聯(lián)板中加入人a-乳清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品和待 檢測(cè)樣品，洗滌液洗板； 2) 加入酶標(biāo)人a -乳清白蛋白單克隆抗體，洗滌液洗板； 3) 加入底物顯色液顯色，加入反應(yīng)終止液終止反應(yīng)，測(cè)定0D450值； 4) 以人a-乳清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的劑量-效應(yīng)曲線為標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品人a-乳清白 蛋白的含量。
7. 權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的試劑盒在檢測(cè)轉(zhuǎn)基因牛奶及奶制品中人a-乳清白蛋白 含量中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】G01N33/68GK104422776SQ201310395795
【公開(kāi)日】2015年3月18日 申請(qǐng)日期:2013年9月3日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月3日
【發(fā)明者】林祥梅, 朱振營(yíng), 王勤, 劉建, 付偉, 孫敏, 王燕 申請(qǐng)人:中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院