一種電化學(xué)發(fā)光測定皮層肌動蛋白的方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于分析化學(xué)和電化學(xué)發(fā)光檢測【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明涉及一種皮層肌動蛋白的電化學(xué)發(fā)光傳感器及皮層肌動蛋白的測定方法，利用電化學(xué)還原制備納米金和石墨烯修飾金電極，并將帶有活性基團(tuán)聯(lián)吡啶釕連接的肽自組裝在修飾電極上，構(gòu)成電化學(xué)發(fā)光傳感器。在目標(biāo)物皮層肌動蛋白存在時，皮層肌動蛋白與肽結(jié)合，阻止了嗜熱菌蛋白酶對肽的切割，產(chǎn)生強(qiáng)的電化學(xué)發(fā)光信號；反之，無皮層肌動蛋白存在時，嗜熱菌蛋白酶切割肽，電化學(xué)發(fā)光信號減弱。以此現(xiàn)象實現(xiàn)對皮層肌動蛋白的測定。本方法的特點是方法簡單、靈敏度高、儀器設(shè)備簡單、費(fèi)用低。
【專利說明】—種電化學(xué)發(fā)光測定皮層肌動蛋白的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分析化學(xué)和電化學(xué)發(fā)光檢測【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種以末端標(biāo)記了電化學(xué)發(fā)光信號探針的肽為識別元件測定皮層肌動蛋白的方法。
技術(shù)背景
[0002]在當(dāng)前的生物醫(yī)學(xué)研究和臨床實踐中，建立新的簡單、快速、有效的方法對蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測是一個永恒不變的要求?，F(xiàn)階段最常用的分析測定方法是基于抗體識別和信號放大器結(jié)合而建立的方法。雖然這種方法是行之有效的，但由于抗體和信號放大器制備復(fù)雜，需要建立新的方法來替代這些需要復(fù)雜步驟的傳統(tǒng)方法。
[0003]在本發(fā)明中，利用肽代替抗體作為識別單元來簡化測定步驟。肽不僅有一個簡單而確定的結(jié)構(gòu)，而且對于許多分子，如蛋白質(zhì)和小分子，具有強(qiáng)的專一性、親和力。現(xiàn)在許多蛋白質(zhì)結(jié)合肽已經(jīng)由多肽識別元件(Peptide recognition module, PRM)篩選獲得。[A.H.Y.Tong, B.Drees, G.NardelIi, G.D.Bader, B.Brannetti, L.Castagnolij M.Evangelista, S.Ferracutij B.Nelson, S.Paoluzij M.Quondam,A.Zucconij C.W.V.Hogue, S.Fields, C.Boone and G.Cesaren1.A combinedexperimental and computational strategy to define protein interaction networksfor peptide recognition modules, Science, 2002，295，321; H.Huang and S.S.Sidhuj Studying binding specificities of peptide recognition modules byhigh-throughput phage display selections, Methods Mol.Biol., 2011，781，87.]
目前皮層肌動蛋白(Cot)測定方法主要有光度法(C.Luoj H.Pan, M.Mines,K.Watson, J.J.Zhang and G.H.Fan.CXCL12 induces tyrosine phosphorylationof cortactin, which plays a role in CXC chemokine receptor 4-mediatedextracellular signal-regulated kinase activation and chemotaxis.J.Biol.Chem.，2006，281，30081)、電化學(xué)(H.Li, Η.N.Xiej N.N.Yang, Y.Huang, LZ.Sun and G.X.L1.Design of a b1-functional peptide for protein assays:observation of cortactin expression in human placenta.Chem.Commun.，2013，49，5387)等方法。這些方法各有其優(yōu)點，能不同程度的滿足對皮層肌動蛋白的檢測要求，但方法的操作復(fù)雜、設(shè)備昂貴。所以必須發(fā)展一種簡單的新型檢測方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]針對現(xiàn)有技術(shù)的不足以及本領(lǐng)域研究和應(yīng)用的需求，本發(fā)明的目的是提供一種簡單而靈敏的電化學(xué)發(fā)光檢測皮層肌動蛋白的方法。
[0005]本發(fā)明可以選擇性的對目標(biāo)物進(jìn)行測定，所建立的方法可以應(yīng)用于實際樣品的測定。
[0006]本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的:一種電化學(xué)發(fā)光測定皮層肌動蛋白的方法，
其特征在于具體包括如下步驟: (1)利用現(xiàn)有技術(shù)，制備金電極；
(2)以氧化石墨烯為原料，利用電化學(xué)還原，制備石墨烯修飾電極(GR/GE)；
(3)以氯金酸為原料，利用電化學(xué)還原，在石墨烯修飾電極上電沉積納米金，制備納米金和石墨烯修飾電極(Au/GR/GE)；
(4)利用現(xiàn)有技術(shù)，將羧基化的電化學(xué)發(fā)光試劑與肽交聯(lián)，制備電化學(xué)發(fā)光試劑標(biāo)記的肽，即電化學(xué)發(fā)光探針(Ru-peptide)；
(5)通過自組裝Au-S鍵，將電化學(xué)發(fā)光探針組裝在納米金和石墨烯修飾電極表面，得電化學(xué)發(fā)光傳感器；
(6)利用嗜熱菌蛋白酶對肽探針的切割作用，對皮層肌動蛋白進(jìn)行檢測；
上述(6 )所述的皮層肌動蛋白進(jìn)行檢測，優(yōu)選的，將電化學(xué)發(fā)光傳感器浸泡在皮層肌動蛋白樣品溶液中反應(yīng)一段時間，取出洗滌；再將其浸泡在嗜熱菌蛋白酶溶液中反應(yīng)一段時間，取出后洗滌，測定電化學(xué)發(fā)光信號，根據(jù)電化學(xué)發(fā)光信號強(qiáng)弱對皮層肌動蛋白進(jìn)行定量檢測。
[0007]電化學(xué)發(fā)光信號的測定。
[0008]優(yōu)選的，具體為，以修飾電極為工作電極，Ag/AgCl (飽和KCl)電極為參比電極，鉬絲電極為對電極。
[0009]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點和有益效果:
(I)本方法通過測得的電化學(xué)發(fā)光信號的變化來判斷皮層肌動蛋白與肽的結(jié)合情況和嗜熱菌蛋白酶切割肽的情況，可進(jìn)而推斷出目標(biāo)物的定量信息。而電化學(xué)發(fā)光分析本質(zhì)上具有內(nèi)在的優(yōu)勢，即靈敏度高的特點，所建立的方法具有高的靈敏度。
[0010](2)本方法中無需復(fù)雜昂貴的儀器設(shè)備，成本低。
[0011](3)只需一條標(biāo)記肽鏈就可以實現(xiàn)對目標(biāo)物的測定；不使用顯色劑，材料成本低，無健康危害風(fēng)險。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0012]圖1為基于嗜熱菌蛋白酶切割肽納米金和石墨烯修飾金電極電化學(xué)發(fā)光測定皮層肌動蛋白的原理示意圖。
[0013]圖2為皮層肌動蛋白與肽結(jié)合時間對電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的影響。
[0014]圖3為皮層肌動蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
【具體實施方式】
[0015]以下是本發(fā)明涉及的具體實施例，對本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步作描述，但是本發(fā)明的保護(hù)范圍并不限于這些實施例。凡是不背離本發(fā)明構(gòu)思的改變或等同替代均包括在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0016]本發(fā)明涉及的一種皮層肌動蛋白的電化學(xué)發(fā)光傳感器，利用電化學(xué)還原制備了納米金和石墨烯修飾金電極，并將帶有活性基團(tuán)聯(lián)吡啶釕連接的肽自組裝在修飾電極上，構(gòu)成電化學(xué)發(fā)光傳感器。在目標(biāo)物皮層肌動蛋白存在時，皮層肌動蛋白與肽結(jié)合，阻止了嗜熱菌蛋白酶對肽的切割，產(chǎn)生強(qiáng)的電化學(xué)發(fā)光信號；反之，無皮層肌動蛋白存在時，嗜熱菌蛋白酶切割肽，電化學(xué)發(fā)光信號減弱。以此現(xiàn)象實現(xiàn)對皮層肌動蛋白的測定。[0017]本發(fā)明是通過以下措施來實現(xiàn)的:一種電化學(xué)發(fā)光測定皮層肌動蛋白的方法，包括以下步驟:
電化學(xué)還原納米金和石墨烯修飾電極的制備，其特征是包括以下步驟:
(1)工作電極表面經(jīng)Iμπι、0.3 μ--,Ο.05 μπι的C1-Al2O3拋光粉拋光后，用二次蒸餾水沖洗干凈，并在超聲波水浴中超聲5分鐘(min)，用二次水徹底沖洗后，吹干；
(2)優(yōu)選的，將預(yù)處理后的金電極浸泡在0.2.0 mg/mL氧化石墨烯溶液中，通氮除氧。在-1.3 V (vs.SCE)電還原600秒(S)，取出電極后用二次蒸餾水沖洗后用氮?dú)獯蹈?，即得石墨烯修飾電極。
[0018](3)優(yōu)選的，將新制備的石墨烯修飾電極在5.0 mmol/L HAuCl4和0.5 mo I/L KNO3混合溶液中于-0.4 V (vs.SCE)電位范圍內(nèi)使用恒電位法電沉積300 s,即得到納米金和石墨烯修飾電極。取出該電極后用二次水去離子水沖洗，用氮?dú)獯蹈珊髠溆谩?br> [0019]電化學(xué)發(fā)光探針的制備，其特征是包括以下步驟:
優(yōu)選的，將2.0 mg肽溶解在10 ml無水乙醇中，然后向其中加入含5 mg的Ru-NHS (Ru (bpy) 2 (dcbpy) NHS )溶液，在4攝氏度下攪拌孵育過夜，得電化學(xué)發(fā)光探針(Ru-peptide)。
[0020]電化學(xué)發(fā)光探針傳感器的制備，其特征是包括以下步驟:
優(yōu)選的，將納米金和石墨烯修飾電極浸泡在50 μ L的電化學(xué)發(fā)光探針溶液(磷酸緩沖溶液pH 7.4 + 5 mM TCEP (磷酸三氯乙酯))中，在4攝氏度下攪拌孵育過夜，洗滌。然后浸泡于100 μ L 1.0X 10_3 M MCH反應(yīng)半小時后，再用pH 7.4磷酸緩沖溶液沖洗電極三次，吹干電極表面，即得。在4攝氏度下儲存?zhèn)溆谩?br> [0021]電化學(xué)發(fā)光法檢測皮層肌動蛋白，其特征是包括以下步驟:
(I)優(yōu)選的，將固定有電化學(xué)發(fā)光探針的納米金和石墨烯修飾電極浸入100 μ L含有中皮層肌動蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣品溶液中，在室溫下反應(yīng)I小時，取出電極，用PH 7.4磷酸緩沖溶液沖洗電極三次。然后再將電極浸泡在含5%的Tween-20溶液中孵育30分鐘，然后取出電極，用PH 7.4磷酸緩沖溶液沖洗電極三次。
[0022](2)優(yōu)選的，將上述電極浸泡在50 μ L含有嗜熱菌蛋白酶溶液(5 nU/ml,50 mMTris-HCl,0.5 mM CaCl2 和 0.1 mM ZnCl2, pH 8.0)中反應(yīng) 10-200 分鐘(50 攝氏度)，取出電極，用PH 7.4磷酸緩沖溶液沖洗電極三次。然后再將電極浸泡在含5%的Tween-20溶液中孵育30分鐘，然后取出電極，用pH 7.4磷酸緩沖溶液沖洗電極三次，以此電極為工作電極，進(jìn)行電化學(xué)發(fā)光測定，根據(jù)電化學(xué)發(fā)光信號對皮層肌動蛋白進(jìn)行定量測定。
`[0023](3)電化學(xué)發(fā)光測定，優(yōu)選的，取I mL 0.1 M TPACpH 7.4 0.10 M磷酸緩沖溶液、
0.10 M NaCl)到檢測池中，電化學(xué)發(fā)光信號為分析信號，進(jìn)行皮層肌動蛋白的測定，參數(shù)設(shè)置為:高壓800 V，放大級數(shù)為3。`
[0024]本發(fā)明的基本原理如圖1所示。
[0025]本發(fā)明中的皮層肌動蛋白與電極作用時間，具體特征如下:
皮層肌動蛋白與電極作用時間(即皮層肌動蛋白與肽結(jié)合時間)。優(yōu)選的，實驗結(jié)果如圖2所示。當(dāng)作用時間大于50分鐘時，電化學(xué)發(fā)光信號變化趨勢減弱。所以，優(yōu)選的，作用時間為60分鐘。
[0026]實施例:一種電化學(xué)發(fā)光測定皮層肌動蛋白的方法1.實驗部分 1.1儀器與試劑
羧基化的吡啶釕(Ru(bpy)2 (dcbpy) NHS:二 (2, 2’ -聯(lián)吡啶)(2，2’ -吡啶-4，4’ - 二碳酸)琥珀酰胺釕，Ru-NHS)、N，N' -二環(huán)己基碳二亞胺(EDC)、嗜熱菌蛋白酶、TPA(美國Sigma公司)；皮層肌動蛋白(武漢華美生物工程有限公司)；N-羥基琥珀酰亞胺(NHS，上海延長生化公司);氯金酸(HAuCl4，中國上海試劑一廠);磷酸三氯乙酯(TCEP)、巰基己醇(MCH)(阿拉丁試劑有限公司)。
[0027]所用的肽(純度>95%，百奧泰生物科技)序列如下:
11-mercaptoundecanoic acid-GLSKKRPPPPPPGHKRT。
[0028]CHI660B型電化學(xué)工作站(上海辰華儀器公室)；MP1-E型電致化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)(西安瑞邁分析儀器有限公司)；三電極系統(tǒng):以修飾電極為工作電極，Ag/AgCl (飽和KCl)電極為參比電極，鉬絲電極為對電極。
[0029]1.2實驗步驟
1.2.1電化學(xué)還原納米金和石墨烯修飾電極的制備
將金電極表面經(jīng)I μ m、0.3 μ m、0.05 μ m的a -Al2O3拋光粉拋光后,用二次蒸懼水沖洗干凈，并在超聲波水浴中超聲5分鐘，用二次水徹底沖洗后，吹干。
[0030]將預(yù)處理后的金電極浸泡在1.0 mg/mL的氧化石墨烯溶液中，通氮除氧。在-1.3
V(vs.SCE)電還原600 S，取出電極后用二次蒸餾水沖洗后用氮?dú)獯蹈?，即可在金電極表面形成一層電化學(xué)還原GR修飾膜,此`修`飾電極表不為GR/GE。
[0031]將新制備的GR/GE在5.0 mmol/L HAuCl4 和 0.5 mol/L KNO3 混合溶液中于-0.4
V(vs.SCE)電位范圍內(nèi)使用恒電位法電沉積300 S，即可得到Au/GR/GE修飾電極。取出該電極后用二次水去離子水沖洗，用氮?dú)獯蹈珊髠溆谩?br> [0032]1.2.2電化學(xué)發(fā)光探針的制備
將2.0 mg肽溶解在10 ml無水乙醇中，然后向其中加入含5 mg Ru-NHS,2 mg EDC和4 mg NHS溶液，在4攝氏度下攪拌孵育過夜，得電化學(xué)發(fā)光探針(Ru-p印tide)。
[0033]1.2.3電化學(xué)發(fā)光探針在修飾金電極上的固定
將Au/GR/GE浸泡在50 μ L的Ru-ρ印tide溶液(磷酸緩沖溶液pH 7.4 + 5 mM TCEP)中，在4攝氏度下攪拌孵育過夜，洗滌。然后浸泡于100 UL 1.0X IO 3 M MCH反應(yīng)半小時后，再用pH 7.4磷酸緩沖溶液沖洗電極三次，吹干電極表面，在4攝氏度下儲存?zhèn)溆谩?br> [0034]1.2.4電化學(xué)發(fā)光法檢測皮層肌動蛋白
將固定有電化學(xué)發(fā)光探針的Au/GR/GE浸入100 μ L含有中皮層肌動蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣品溶液中，在室溫下反應(yīng)I小時，取出電極，用PH 7.4磷酸緩沖溶液沖洗電極三次。然后再將電極浸泡在含5%的Tween-20溶液中孵育30分鐘，然后取出電極，用pH 7.4磷酸緩沖溶液沖洗電極三次。
[0035]將上述電極浸泡在50 UL含有嗜熱菌蛋白酶溶液((50 μ 1,5 nU/ml,50 mMTris-HCl,0.5 mM CaCl2,0.1mM ZnCl2, pH 8.0))中反應(yīng) 100 分鐘(50 攝氏度)，取出電極，用pH 7.4磷酸緩沖溶液沖洗電極三次。然后再將電極浸泡在含5%的Tween-20溶液中孵育30分鐘，然后取出電極，用pH 7.4磷酸緩沖溶液沖洗電極三次。取I mL 0.1 M TPACpH7.4 0.10 M磷酸緩沖溶液、0.10 M NaCl)到檢測池中，以此電極為工作電極，進(jìn)行電化學(xué)發(fā)光測定。電化學(xué)發(fā)光選定參數(shù)設(shè)置為:高壓800 V，放大級數(shù)為3。[0036]1.3結(jié)果與討論 皮層肌動蛋白結(jié)合時間的優(yōu)化
皮層肌動蛋白與其特異性識別的肽結(jié)合，阻礙了嗜熱菌蛋白酶的切割作用，皮層肌動蛋白量越大，切割的肽越少，在電極表面的電化學(xué)發(fā)光信號探針越多最終產(chǎn)生的電化學(xué)發(fā)光信號越強(qiáng)。不同的結(jié)合時間能引起電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的不同，為了選擇合適的皮層肌動蛋白結(jié)合時間，考察了皮層肌動蛋白和肽結(jié)合時間對電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的影響，實驗結(jié)果如圖2所示。從圖2可以看出，電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度在10-40分鐘內(nèi)隨著結(jié)合時間增長而增加，在50分鐘趨于最大值，而在50-80分鐘內(nèi)隨著結(jié)合時間增加，發(fā)光強(qiáng)度增加趨勢變?nèi)??？紤]到肽與低濃度皮層肌動蛋白結(jié)合需要最佳時間，選取結(jié)合時間為60分鐘。
[0037]方法的線性范圍及檢出限
在最佳條件下，研究了不同濃度皮層肌動蛋白與電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度之間的關(guān)系，得到了檢測皮層肌動蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性范圍及線性方程。當(dāng)皮層肌動蛋白的濃度在1.0X10_n-3.0X10_8 g/mL之間時，體系的電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度隨著皮層肌動蛋白濃度的增大而增大。得到皮層肌動蛋白的非線性方程為ΙΕα = -196.08*exp (-χ/0.52)-5981.74*exp (-χ/11.87) + 6201.42 (ΙΕα為體系的電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度；x為皮層肌動蛋白的濃度，ng/mL ；n = 7，R2 = 0.9990)。皮層肌動蛋白的濃度在 1.0X IO-11 -1.0X IO-9 g/mL之間時，電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度隨著皮層肌動蛋白濃度的增大而增大，線性方程為IEa = 690.49χ+ 33.807 (R2 = 0.9995)(圖 3)。該方法檢測限為 3 pg/mL (3 σ )。對濃度 2.0 ng/mL 的皮層肌動蛋白進(jìn)行7次平行重復(fù)測定的RSD為3.7%，表明本法有較好的重現(xiàn)性。
【權(quán)利要求】
1.一種電化學(xué)發(fā)光測定皮層肌動蛋白的方法，其特征在于通過測定電極表面標(biāo)記肽的電化學(xué)發(fā)光信號的變化數(shù)據(jù)來獲得皮層肌動蛋白的定量信息的方法； 所述的分析方法包括以下步驟: (1)電化學(xué)發(fā)光探針傳感器的構(gòu)建: a電化學(xué)還原納米金和石墨烯修飾電極的制備:將金電極浸泡在0.f 2.0 mg/mL氧化石墨烯溶液中，在-1.3 V電還原600 S，得石墨烯修飾電極；將所得的石墨烯修飾電極在5.0 mmol/L HAuCl4 和 0.5 mol/L KNO3 混合溶液中于-0.4 V 電沉積 300 s ； b電化學(xué)發(fā)光探針的制備:將2.0 mg肽溶解在10 mL無水乙醇中，然后向其中加入含5 mg的Ru-NHS (羧基化的吡啶釕)溶液，在4攝氏度下攪拌孵育過夜； c電化學(xué)發(fā)光探針傳感器的構(gòu)建:將納米金和石墨烯修飾電極浸泡在50 μ L的電化學(xué)發(fā)光探針溶液中，在4攝氏度下攪拌孵育過夜，洗滌后浸泡于100 uL 1.0Χ10_3Μ巰基己醇反應(yīng)半小時后，再用pH 7.4 磷酸緩沖溶液沖洗電極三次，得電化學(xué)發(fā)光探針傳感器； (2)電化學(xué)發(fā)光法檢測皮層肌動蛋白: a電化學(xué)發(fā)光探針傳感器浸入100 μ L含有中皮層肌動蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣品溶液中，在室溫下反應(yīng)，取出電極，用PH 7.4磷酸緩沖溶液沖洗電極三次，然后再將電極浸泡在含5%的Tween-20溶液中孵育30分鐘，然后取出電極，用pH 7.4磷酸緩沖溶液沖 洗電極三次；b將電極浸泡在50 μ L含有嗜熱菌蛋白酶溶液中反應(yīng)1(-200分鐘，取出電極，用pH7.4磷酸緩沖溶液沖洗電極三次，然后再將電極浸泡在含5%的Tween-20溶液中孵育30分鐘，然后取出電極，用PH 7.4磷 酸緩沖溶液沖洗電極三次，以此電極為工作電極，進(jìn)行電化學(xué)發(fā)光測定，根據(jù)電化學(xué)發(fā)光 信號對皮層肌動蛋白進(jìn)行定量測定。
2.權(quán)利要求1進(jìn)行電化學(xué)發(fā)光測定，其特征在于:準(zhǔn)確移取ImL 0.1 M TPA (用pH為7.4的磷酸緩沖溶液配制)到檢測池中，以具備電化學(xué)發(fā)光探針傳感器功能的金電極作為工作電極，進(jìn)行電化學(xué)發(fā)光測定，電化學(xué)發(fā)光選定參數(shù)設(shè)置為:高壓800 V，放大級數(shù)為3。
【文檔編號】G01N27/30GK103439321SQ201310400147
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2013年9月5日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月5日
【發(fā)明者】混旭, 徐亞瓊 申請人:青島科技大學(xué)