一種基于電位控制固定抗體的免疫傳感器制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種基于電位控制固定抗體的免疫傳感器制備方法，其特征在于：所述的方法按照以下步驟進(jìn)行：基礎(chǔ)電極的清潔處理：對電極進(jìn)行拋光、浸泡和清洗處理，去除其表面雜質(zhì)后，獲得表面新鮮潔凈的電極；在基礎(chǔ)電極上形成帶有氨基的有機(jī)膜；將帶有氨基有機(jī)膜的基礎(chǔ)電極與參比電極、輔助電極構(gòu)成三電極系統(tǒng)，將基礎(chǔ)電極放置在pH2.0至10.0、濃度為0.1至10mg/mL的緩沖溶液中，在-800至+400mV的電位條件下處理1至60min，最終實現(xiàn)抗體膜在有機(jī)膜上的固定。這是一種在抗體固化的過程中無需使用交聯(lián)劑或偶聯(lián)劑，無需酶標(biāo)記或熒光標(biāo)記，成本低廉，簡單易行的免疫傳感器制備方法。
【專利說明】一種基于電位控制固定抗體的免疫傳感器制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種免疫分析領(lǐng)域中傳感器的制備方法，特別是一種基于電位控制固定抗體的免疫傳感器制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]免疫分析的提出及發(fā)展是生物分析化學(xué)最偉大的成就之一。免疫分析技術(shù)結(jié)合了抗原、抗體分子間的特異性識別和電化學(xué)、光譜學(xué)、聲學(xué)等技術(shù)的靈敏、方便等特點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于臨床診斷、生物化學(xué)、環(huán)境分析、食品安全及軍事醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域。免疫傳感器作為一種新興免疫分析手段，具有檢測速度快，操作簡便，成本較低等特點(diǎn)，受到人們愈來愈廣泛的關(guān)注。
[0003]抗體的固定化是免疫傳感器制備的關(guān)鍵技術(shù)之一。常用的有包埋法、交聯(lián)法、共價鍵法及靜電吸附法等，這些固定方法通常具有以下缺點(diǎn):1.固定抗體時需占用一個免疫活性位點(diǎn)，造成抗體的活性損失或抗體膜不穩(wěn)定，致使免疫傳感器性能減弱，如檢測靈敏度低、檢測范圍窄。2.使用的交聯(lián)或偶聯(lián)試劑昂貴，部分固定方法步驟繁瑣，不易大規(guī)模操作、實施。因此現(xiàn)在需要一種能夠解決上述問題的新的抗體固定方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明是為了解決現(xiàn)有技術(shù)所存在的上述不足，提出一種在抗體固化的過程中無需使用交聯(lián)劑或偶聯(lián)劑，無需酶標(biāo)記或熒光標(biāo)記，成本低廉，簡單易行的免疫傳感器制備方法。
[0005]本發(fā)明的技術(shù)解決方案是:一種基于電位控制固定抗體的免疫傳感器制備方法，其特征在于:所述的方法按照以下步驟進(jìn)行:
基礎(chǔ)電極的清潔處理:對電極進(jìn)行拋光、浸泡和清洗處理，去除其表面雜質(zhì)后，獲得表面新鮮潔凈的電極，
在基礎(chǔ)電極上形成帶有氨基的有機(jī)膜，
將帶有氨基有機(jī)膜的基礎(chǔ)電極與參比電極、輔助電極構(gòu)成三電極系統(tǒng)，將基礎(chǔ)電極放置在pH2.0至10.0、濃度為0.1至10mg/mL的IgG型抗體溶液中，在-800至+400mV的電位條件下處理I至60min,最終實現(xiàn)抗體膜在有機(jī)膜上的固定。
[0006]所述的基礎(chǔ)電極選用鉬、金、銀、銅、石墨、炭糊或玻炭中的一種。
[0007]所述的帶有氨基的有機(jī)膜通過自組裝法或電聚合方法附著在以鉬、金、銀或銅為材質(zhì)的基礎(chǔ)電極上，通過電聚合方法附著在以石墨、炭糊或玻炭為材質(zhì)的基礎(chǔ)電極上。
[0008]所述的帶有氨基的有機(jī)膜為氨基硫酚及其衍生物、硫脲類化合物、胱氨及其衍生物、硫堇及其衍生物、苯胺及其衍生物中的一種或多種。
[0009]所述的抗體膜為IgG型單克隆抗體或IgG型多克隆抗體。
[0010]所述的拋光步驟為:首先將基礎(chǔ)電極的表面用金相砂紙打磨，然后依次用
1.0 μ m、0.3 μ m、0.05 μ m的Y至氧化招衆(zhòng)在麂皮上拋光,之后依次用丙酮、純水淋洗干凈； 所述的浸泡步驟為:將經(jīng)拋光處理后的基礎(chǔ)電極浸入piranha溶液中在50°C的條件下浸泡20min，然后用蒸餾水沖洗基礎(chǔ)電極5次，上述的浸泡和沖洗步驟需進(jìn)行2次操作。
[0011]所述的清洗步驟為:將基礎(chǔ)電極取出后用純水淋洗5次，并將其浸入純水中進(jìn)行超聲清洗3次，每次清洗時間為5min，最后取出基礎(chǔ)電極并用N2吹干。
[0012]所述的自組裝方法為:將經(jīng)過清潔處理后的基礎(chǔ)電極浸入0.1?25mmol/L氨基有機(jī)物的溶液中浸泡24h，以在基礎(chǔ)電極上形成末端為氨基的單層分子膜或多層分子膜，其中氨基有機(jī)物為氨基硫酚及其衍生物、硫脲類化合物、胱氨及其衍生物中的一種或多種。
[0013]所述的電聚合方法為:在0.01?0.05mol/L氨基有機(jī)物溶液中，將經(jīng)過清潔處理后的基礎(chǔ)電極作為三電極系統(tǒng)的工作電極，以50mV/s的掃速在至500至+500mV的電位范圍內(nèi)循環(huán)掃描10至50圈后，用純水淋洗基礎(chǔ)電極5次，以在基礎(chǔ)電極表面上形成帶有自由氨基或亞氨基的聚合物薄膜，其中氨基有機(jī)物為硫堇及其衍生物、苯胺及其衍生物中的一種或多種。
[0014]本發(fā)明同現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點(diǎn):
利用本發(fā)明所公開的方法制備的免疫傳感器，與現(xiàn)有的免疫傳感器相比，具有以下優(yōu)點(diǎn):這種免疫傳感器的構(gòu)造簡單，在抗體固化的過程中無需使用交聯(lián)劑或偶聯(lián)劑，無需酶標(biāo)記或熒光標(biāo)記，成本低廉，簡單易行；并且該傳感器的檢測下限低、檢測范圍寬，操作簡單，能夠廣泛應(yīng)用于臨床檢驗、生物醫(yī)學(xué)、環(huán)境監(jiān)測、食品安全、醫(yī)藥工業(yè)及軍事、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域。因此可以說這種制備方法具備了多種優(yōu)點(diǎn)，具備廣泛的市場前景和科研前景。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1是利用本發(fā)明所述方法制備出的免疫傳感器的制備過程示意圖。
[0016]圖2是免疫傳感器制備過程及對抗原檢測后的循環(huán)伏安圖。
[0017]圖3是免疫傳感器制備過程及對抗原檢測后的交流阻抗譜。
[0018]圖4是免疫傳感器對抗原檢測的工作曲線圖。
【具體實施方式】
[0019]下面將結(jié)合【專利附圖】

【附圖說明】本發(fā)明的【具體實施方式】。
[0020]圖2中的a為基礎(chǔ)電極，b為氨基有機(jī)膜修飾電極，c為免疫傳感器，d為傳感器對抗原檢測后的傳感器。
[0021]圖3中的a為基礎(chǔ)電極，b為氨基有機(jī)膜修飾電極，c為免疫傳感器，d為傳感器對抗原檢測后的傳感器，內(nèi)嵌圖為曲線a和b的放大圖。
[0022]實施例一
選擇金電極作為基礎(chǔ)電極，硫脲為氨基化合物，以羊抗至小鼠IgG抗體制備免疫傳感器。
[0023]首先將金電極用金相砂紙打磨，依次用1.0、0.3、0.05μπι的Y至氧化鋁漿在麂皮上拋光，接著依次用丙酮、純水淋洗干凈。將拋光后的電極浸入新配制的Piranha溶液中(3 O % H202:濃H2S04=1:3，體積比)，50°C下浸泡20min，2次。取出電極用純水淋洗5次,純水中反復(fù)超聲清洗3次，每次5min，用N2吹干。最后，將電極浸入25mmol/L硫脲溶液中，浸泡24h，電極表面上形成硫脲自組裝單分子膜。取出電極(硫脲修飾電極)，作為工作電極浸入pH 3.0Umg/mL的抗體溶液中，以Ag/AgCl電極為參比電極，鉬電極為對電極，在至400mV電位下，組裝抗體lOmin，制得免疫傳感器。利用制得的免疫傳感器對抗原(小鼠IgG)進(jìn)行檢測，檢測下限可達(dá)l(T2ng/mL,檢測范圍為l(T2-103ng/mL。
實施例二
選擇鉬電極作為基礎(chǔ)電極，對氨基苯硫酹與半胱氨酸混合物為氨基化合物，以山羊抗至兔IgG抗體制備免疫傳感器。
[0024]首先將鉬電極用金相砂紙打磨，依次用1.0,0.3,0.05 μ m的Y至氧化鋁漿在麂皮上拋光，接著依次用丙酮、純水淋洗干凈。將拋光后的電極浸入新配制的Piranha溶液中(3 O % H202:濃H2S04=1:3，體積比)，50°C下浸泡20min，2次。取出電極用純水淋洗5次，純水中反復(fù)超聲清洗3次,每次5min,用N2吹干。最后，將電極浸入0.lmmol/L對氨基苯硫酚與半胱氨酸混合溶液中，浸泡24h，電極表面上形成氨基有機(jī)膜。取出氨基有機(jī)膜修飾電極，作為工作電極浸入pH 2.0、10mg/mL抗體溶液中，以Ag/AgCl電極為參比電極，鉬電極為對電極，在+400mV電位下，組裝抗體60min，制得免疫傳感器。利用制得的免疫傳感器對抗原(兔IgG)進(jìn)行檢測，檢測下限可達(dá)10_2ng/mL，檢測范圍為10_2_103ng/mL。
[0025]實施例三
選擇玻碳電極作為基礎(chǔ)電極，鄰苯二胺為氨基化合物，以兔抗至人IgG抗體制備免疫傳感器。
[0026]首先將玻碳電極用金相砂紙打磨，依次用1.0,0.3,0.05μπι的Y至氧化鋁漿在麂皮上拋光，接著依次用丙酮、純水淋洗干凈。接著將電極浸入新配制的Piranha溶液中(3 O %H202:濃H2S04=1:3，體積比)，50°C下浸泡20min，2次。取出電極用純水淋洗5次，純水中反復(fù)超聲清洗3次，每次5min，用N2吹干后，在0.05mol/L鄰苯二胺溶液中，以清潔處理好的電極為工作電極。以50mV/s的掃速在至500?500mV的電位范圍內(nèi)循環(huán)掃描50圈后，用純水淋洗5次，得到修飾了氨基的電極表面。將該電極作為工作電極浸入pH 10.0、
0.lmg/mL抗體溶液中，以Ag/AgCl電極為參比電極，鉬電極為對電極，在_800mV電位下，組裝抗體lmin，制得免疫傳感器。利用制得的免疫傳感器對抗原(人IgG)進(jìn)行檢測，檢測下限可達(dá) l(T2ng/mL,檢測范圍為 l(T2_103ng/mL。
【權(quán)利要求】
1.一種基于電位控制固定抗體的免疫傳感器制備方法，其特征在于:所述的方法按照以下步驟進(jìn)行: 基礎(chǔ)電極的清潔處理:對電極進(jìn)行拋光、浸泡和清洗處理，去除其表面雜質(zhì)后，獲得表面新鮮潔凈的電極， 在基礎(chǔ)電極上形成帶有氨基的有機(jī)膜， 將帶有氨基有機(jī)膜的基礎(chǔ)電極與參比電極、輔助電極構(gòu)成三電極系統(tǒng)，將基礎(chǔ)電極放置在pH2.0至10.0、濃度為0.1至10mg/mL的IgG型抗體溶液中，在-800至+400mV的電位條件下處理I至60min,最終實現(xiàn)抗體膜在有機(jī)膜上的固定。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于電位控制固定抗體的免疫傳感器制備方法，其特征在于:所述的基礎(chǔ)電極選用鉬、金、銀、銅、石墨、炭糊或玻炭中的一種。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基于電位控制固定抗體的免疫傳感器制備方法，其特征在于:所述的帶有氨基的有機(jī)膜通過自組裝法或電聚合方法附著在以鉬、金、銀或銅為材質(zhì)的基礎(chǔ)電極上，通過電聚合方法附著在以石墨、炭糊或玻炭為材質(zhì)的基礎(chǔ)電極上。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于電位控制固定抗體的免疫傳感器制備方法，其特征在于:所述的帶有氨基的有機(jī)膜為氨基硫酚及其衍生物、硫脲類化合物、胱氨及其衍生物、硫堇及其衍生物、苯胺及其衍生物中的一種或多種。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于電位控制固定抗體的免疫傳感器制備方法，其特征在于:所述的抗體膜為IgG型單克隆抗體或IgG型多克隆抗體。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于電位控制固定抗體的免疫傳感器制備方法，其特征在于:所述的拋光步驟為:首先將基礎(chǔ)電極的表面用金相砂紙打磨，然后依次用Ι.Ομπκ0.3 μ m、0.05 μ m的Y至氧化鋁漿在麂皮上拋光，之后依次用丙酮、純水淋洗干凈； 所述的浸泡步驟為:將經(jīng)拋光處理后的基礎(chǔ)電極浸入piranha溶液中在50°C的條件下浸泡20min，然后用蒸餾水沖洗基礎(chǔ)電極5次，上述的浸泡和沖洗步驟需進(jìn)行2次操作； 所述的清洗步驟為:將基礎(chǔ)電極取出后用純水淋洗5次，并將其浸入純水中進(jìn)行超聲清洗3次，每次清洗時間為5min，最后取出基礎(chǔ)電極并用N2吹干。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基于電位控制固定抗體的免疫傳感器制備方法，其特征在于:所述的自組裝方法為:將經(jīng)過清潔處理后的基礎(chǔ)電極浸入0.1?25mmol/L氨基有機(jī)物的溶液中浸泡24h，以在基礎(chǔ)電極上形成末端為氨基的單層分子膜或多層分子膜，其中氨基有機(jī)物為氨基硫酚及其衍生物、硫脲類化合物、胱氨及其衍生物中的一種或多種。
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基于電位控制固定抗體的免疫傳感器制備方法，其特征在于:所述的電聚合方法為:在0.01?0.05mol/L氨基有機(jī)物溶液中，將經(jīng)過清潔處理后的基礎(chǔ)電極作為三電極系統(tǒng)的工作電極，以50mV/s的掃速在至500至+500mV的電位范圍內(nèi)循環(huán)掃描10至50圈后，用純水淋洗基礎(chǔ)電極5次，以在基礎(chǔ)電極表面上形成帶有自由氨基或亞氨基的聚合物薄膜，其中氨基有機(jī)物為硫堇及其衍生物、苯胺及其衍生物中的一種或多種。
【文檔編號】G01N33/553GK103513028SQ201310411853
【公開日】2014年1月15日 申請日期:2013年9月11日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月11日
【發(fā)明者】馮春梁, 孫越, 李楊 申請人:遼寧師范大學(xué)