一種利用表面增強拉曼光譜判別癌細胞的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種利用表面增強拉曼光譜判別癌細胞的方法。該方法，采用超聲波快速預處理冰浴條件下孵育的SERS活性納米材料和多種不同類型細胞后，利用電穿孔方法分別將SERS活性納米材料快速導入不同類型細胞內(nèi)部，利用拉曼光譜儀檢測獲取癌細胞的表面增強拉曼光譜，建立多種不同類型細胞表面增強拉曼光譜數(shù)據(jù)庫，經(jīng)多變量統(tǒng)計分析進行聚類分析，獲得正常細胞與癌細胞的表面增強拉曼光譜對應的判別散點分布圖，據(jù)此實現(xiàn)癌細胞的判別。本發(fā)明方法具有快速、易于操作、通用性好及成本低廉、無閃爍的細胞SERS光譜等特點，可實現(xiàn)大規(guī)模的癌細胞檢測，適于在藥物篩選、疾病診斷等【技術領域】廣泛應用。
【專利說明】—種利用表面增強拉曼光譜判別癌細胞的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種癌細胞表面增強拉曼光譜判別方法，具體說是將癌細胞與具有SERS活性的納米材料用脈沖電場進行預處理，檢測癌細胞的表面增強拉曼光譜信號，最后利用多變量分析技術進行統(tǒng)計分析和判別的方法。屬于生物醫(yī)學領域。
【背景技術】
[0002]拉曼光譜(Raman spectroscopy)是一種基于拉曼散射效應而發(fā)展起來的分子光譜技術，采用拉曼光譜技術可以從分子水平上探測組織細胞內(nèi)的蛋白、核酸、脂類以及糖類等生物分子的精細結(jié)構(gòu)和信息。在腫瘤生長和發(fā)展過程中，上述分子的物質(zhì)結(jié)構(gòu)、構(gòu)象和數(shù)量會發(fā)生明顯變化，通過對比研究癌變和正常生物樣本(組織、細胞或相關生物分子)的拉曼光譜，從二者的差異可發(fā)現(xiàn)能反映癌變信息的特征光譜，從而可應用于癌癥診斷研究。與常規(guī)檢測技術相比，拉曼光譜技術具有樣本預處理簡單、無損、快速等優(yōu)點，然而，拉曼光譜信號非常微弱(約為熒光的萬分之一)，一些與癌癥相關的指紋信號易被熒光等背景噪聲所掩蓋。因此，如能對拉曼信號進行增強，同時抑制熒光等背景信號，將顯著提高癌癥檢測的靈敏度。1974年,Fleishmann等人發(fā)現(xiàn),當卩比唳分子吸附在粗糙銀表面上，其拉曼散射信號比溶液中吡啶分子的拉曼散射信號增強約6個數(shù)量級，這種增強效應被稱為表面增強拉曼光譜(surface enhanced Raman scattering, SERS)效應，因此表面增強拉曼光譜可簡稱為SERS。最近發(fā)現(xiàn)具有SERS活性的銀納米粒子還能有效地猝滅熒光，進一步提高了 SERS檢測的靈敏度，目前SERS增強效應最高可達到IO14-1O15數(shù)量級，實現(xiàn)了某種意義上可稱之為最高靈敏度的單分子檢測。SERS技術保留了拉曼光譜的原有優(yōu)點，檢測靈敏度通過SERS和熒光猝滅效應得到顯著提高。當前將SERS技術應用于癌細胞檢測已成為國際上拉曼光譜領域的一個研究熱點。如能利用SERS技術實現(xiàn)癌細胞的判別，對癌癥的臨床診斷具有重要的意義。為了實現(xiàn)這一研究目標，首先要解決以下兩個技術難點。
[0003]第一，需發(fā)展一種快速的細胞SERS檢測方法，這是實現(xiàn)癌細胞大規(guī)模篩選的一個必要前提。第二，獲得的細胞SERS光譜要穩(wěn)定不能出現(xiàn)“閃爍”等現(xiàn)象，這是實現(xiàn)癌細胞判別的一個基本保障。然而，現(xiàn)有的癌細胞SERS檢測方法除有“閃爍”現(xiàn)象外，還存在耗時較長或操作繁復等問題，如直接孵育方法是一種利用細胞內(nèi)吞生理功能，即“被動吸收”入具SERS活性的納米材料后實現(xiàn)細胞SERS檢測的方法，該方法耗時較長(>20小時)。免疫結(jié)合方法需要制備特異性的免疫SERS探針，即檢測不同種類癌細胞需要合成不同種類的免疫SERS探針，探針不具備通用性且成本較高。微注射方法操作繁復，難以實現(xiàn)批量癌細胞的SERS檢測。2009年， 申請人:首次提出一種電穿孔細胞SERS檢測方法，利用該方法能夠在30分鐘內(nèi)獲得癌細胞的SERS光譜，實現(xiàn)了癌細胞的快速SERS檢測。初步解決了第一個技術難點。
[0004]然而，和其他細胞SERS檢測方法一樣，利用電穿孔細胞SERS檢測方法獲得的細胞SERS光譜也同樣存在“閃爍”現(xiàn)象，即在一定的時間段內(nèi)，連續(xù)對同一細胞進行多次SERS檢測，獲得的多個SERS光譜譜型在峰位、峰強及峰數(shù)上均出現(xiàn)較大的波動。因此，第二個技術難點還有待解決。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明目的在于提出一種利用電穿孔方法將具有SERS活性的納米材料快速導入癌細胞，結(jié)合超聲波等方法獲得穩(wěn)定、無閃爍的細胞SERS光譜，并采用多變量統(tǒng)計分析實現(xiàn)了癌細胞判別的方法。該方法具有快速、易于操作、通用性好及成本低廉等特點，可實現(xiàn)大規(guī)模的癌細胞檢測，從而克服了現(xiàn)有技術中的不足。
[0006]為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術方案如下:
一種利用表面增強拉曼光譜判別癌細胞的方法，其特征在于，采用超聲波快速預處理冰浴條件下孵育的SERS活性納米材料和多種不同類型細胞后，利用電穿孔方法分別將SERS活性納米材料快速導入不同類型細胞內(nèi)部，利用拉曼光譜儀檢測獲取癌細胞的表面增強拉曼光譜，建立多種不同類型細胞表面增強拉曼光譜數(shù)據(jù)庫，經(jīng)多變量統(tǒng)計分析進行聚類分析，獲得正常細胞與癌細胞的表面增強拉曼光譜對應的判別散點分布圖，據(jù)此實現(xiàn)癌細胞的判別。
[0007]所述的細胞是指市售的標準癌細胞和正常細胞。
[0008]所述的癌細胞為經(jīng)過體外培養(yǎng)并處于貼壁或懸浮狀的癌細胞。
[0009]所述的SERS活性納米材料是指銀溶膠或金溶膠。
[0010]該方法包括如下步驟: (I)細胞標準樣品制備
用市售的RPMI 1640細胞培養(yǎng)液分別將細胞制成細胞懸液，然后通過血球記數(shù)板計算細胞的含量，調(diào)整細胞密度至IO4個/ml。
[0011]所述細胞包括市售的標準癌細胞和正常細胞。
[0012](2)拉曼光譜檢測
將銀溶膠或金溶膠與細胞懸液混合，利用200μ I的移液器通過反復抽吸的方式混勻，混合均勻后轉(zhuǎn)入電擊杯中，先冰浴5~10分鐘后，再超聲波預處理30-60秒，立即將電擊杯置電脈沖發(fā)生器的電擊基架上進行電脈沖處理，取出電擊杯立即冰浴5~10分鐘，然后轉(zhuǎn)移到預熱后的培養(yǎng)箱中，37°C培養(yǎng)10分鐘，最后利用共焦拉曼光譜儀檢測樣品以獲得樣品細胞的表面增強拉曼光譜。
[0013]所述的銀溶膠或金溶膠使用的摩爾量與細胞的細胞數(shù)量比為50毫摩爾:100~20000細胞數(shù)量比。
[0014]所述的電擊杯電極間隙范圍為I~4mm，電壓在350V~1000V之間，持續(xù)電擊時間100 μ s~50ms。
[0015]所述銀溶膠的制備方法為:
取9~12 mg的固體硝酸銀溶于50 ml去離子水中，加熱至100°C，然后將I ml含有1%~3%的檸橄酸三鈉的水溶液逐滴加入，在加入過程中快速攪拌硝酸銀溶液，滴加完后繼續(xù)保持沸騰2小時~6小時，得到銀溶膠的粗制品，待銀溶膠自然冷卻后，用離心機離心分層，將上清液丟棄，取下層濃縮的銀溶膠在室溫下避光密封備用。
[0016]所述金溶膠的制備方法為:
取10 mg的氯金酸溶于100ml去離子水中加熱至100°C使之沸騰，然后將2 ml濃度為1%的檸橄酸三鈉逐滴加入，并快速攪拌，滴加完后繼續(xù)保持沸騰15分鐘得到金溶膠。待此金溶膠自然冷卻后，用離心機離心分層，將上層清液丟棄，取下層濃縮的金溶膠在室溫下避光密封存放備用。
[0017](3)細胞標準樣品表面增強拉曼光譜數(shù)據(jù)庫的建立
參照步驟(2)的操作，檢測獲得400~4000CHT1波數(shù)范圍內(nèi)不同種已知細胞種類的表面增強拉曼光譜，利用origin軟件(8.0以上版本)對不同種細胞表面增強拉曼光譜統(tǒng)一進行歸一化處理，以去除儀器系統(tǒng)誤差和環(huán)境變化造成的影響。最后對歸一化處理后的細胞表面增強拉曼光譜進行聚類分析，建立用于判別和區(qū)分細胞標準樣品表面增強拉曼光譜數(shù)據(jù)庫。
[0018](4)癌細胞判別
取一種未知的癌細胞，采用步驟(1)和(2)的操作，得到細胞標準樣品表面增強拉曼光譜數(shù)據(jù)；將該數(shù)據(jù)與步驟(3)建立的細胞標準樣品表面增強拉曼光譜數(shù)據(jù)庫相對比，判別出未知癌細胞的種類。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1是本發(fā)明對正常鼻咽NP69細胞和鼻咽癌C666細胞表面增強拉曼光譜檢測譜線圖。
[0020]圖2是本發(fā)明對正常鼻咽NP69細胞和鼻咽癌C666細胞的表面增強拉曼光譜PCA分析散點圖。
[0021]圖3是本發(fā)明對正常肝HL7702細胞和肝癌HepG2細胞表面增強拉曼光譜檢測譜線圖。`
[0022]圖4是本發(fā)明對正常肝HL7702細胞和肝癌!fepG2細胞的表面增強拉曼光譜PCA分析散點圖。
[0023]圖1和圖3中縱坐標為譜線的強度，單位為任意單位(a.u)橫坐標為各特征譜線的峰位置，以波數(shù)(cnT1)表示。
【具體實施方式】
[0024]本發(fā)明的具體實施細節(jié)闡述如下:
(I)細胞標準樣品制備
取液氮凍存的細胞通過水浴搖床復蘇，然后接種于細胞培養(yǎng)板，3天后胰蛋白酶消化細胞，離心收集細胞，PBS緩沖液洗細胞三次，最后用市售的RPMI 1640細胞培養(yǎng)液制成細胞標準樣品。
[0025]前述步驟可優(yōu)化為:
細胞接種密度為I X 1Vcm2，血清含量為10%~20%，細胞接種24小時后大部分貼壁，3天后細胞生長狀態(tài)最佳時，用PH7.2的PBS緩沖液將細胞洗3次，再加入0.25%胰酶，覆蓋細胞約30s后吸去胰酶，37°C放置2~3 min，即可完全消化好細胞。
[0026](2)拉曼光譜檢測
將電脈沖處理后的細胞標準樣品滴加在氟化鎂晶片上，待細胞自然沉積在晶片表面后，利用拉曼光譜儀檢測細胞標準樣品，拉曼光譜儀測量參數(shù)設定為:激光波長785nm，采樣時間10s，激發(fā)光功率約3.5mw。
[0027](3)數(shù)據(jù)分析處理
將細胞表面增強拉曼光譜數(shù)據(jù)應用SPSS軟件分析工具欄中的PCA方法進行計算，具體步驟如下:①計算歸一化后各波數(shù)的協(xié)方差矩陣；②計算矩陣的本征值和本征向量；③利用T檢驗獲得最有顯著性差異的PCA得分。最后根據(jù)選出的主成份建立相應的分析散點圖，從而獲得表面增強拉曼光譜分析模型。
[0028]實施例1
利用表面增強拉曼光譜檢測判別正常鼻咽NP69細胞和鼻咽癌C666細胞取銀溶膠與正常鼻咽NP69細胞或鼻咽癌C666細胞100 μ I和400 μ 1，室溫下混合后轉(zhuǎn)入一電擊杯中，電擊杯電極間隙為1mm，其中細胞數(shù)量約為4000個。將電擊杯冰浴5分鐘，超聲波預處理30秒，然后置于電穿孔儀內(nèi)，選擇手動控制，加電壓350V，持續(xù)時間100ms，電穿孔后，立即使用400 μ I RPMI 1640細胞培養(yǎng)基將細胞沖洗出樣品池，置冰浴中5min后，轉(zhuǎn)移到預熱后的培養(yǎng)箱中，37°C培養(yǎng)10分鐘，然后利用共焦拉曼光譜儀進行單細胞表面增強拉曼光譜檢測。檢測樣品時采用的激光波長為785nm，功率為3.75mW，收集波長范圍450 cm—1~1800cm-1，正常鼻咽NP69細胞和鼻咽癌C666細胞表面增強拉曼光譜如圖1所示。將獲得正常鼻咽NP69細胞和鼻咽癌C666細胞表面增強拉曼光譜對應的數(shù)據(jù)列表輸入SPSS軟件，數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)置建立樣本矩陣，應用SPSS軟件分析工具欄中的PCA方法進行計算，建立相應的分析散點圖如圖2所示，從而實現(xiàn)鼻咽癌C666細胞的判別。
[0029]實施例2 利用表面增強拉曼光譜檢測判別正常肝HL7702細胞和肝癌HepG2細胞取金溶膠與正常肝HL7702細胞和肝癌H印G2細胞250 μ I和650 μ 1，室溫下混合后轉(zhuǎn)入一電擊杯中，電擊杯電極間隙為4mm，其中細胞數(shù)量約為6000個。將電擊杯冰浴8分鐘，超聲波預處理60秒，然后置于電穿孔儀內(nèi)，選擇手動控制，加電壓880V，持續(xù)時間50 ms,電穿孔后，立即使用800μ1 RPMI 1640細胞培養(yǎng)基將細胞沖洗出樣品池，置冰浴中8min后，轉(zhuǎn)移到預熱后的培養(yǎng)箱中，37°C培養(yǎng)15分鐘，然后利用共焦拉曼光譜儀進行單細胞表面增強拉曼光譜檢測。檢測樣品時采用的激光波長為785nm，功率為0.1mff,取譜范圍為400 cm—1~1750 cnT1，正常肝HL7702細胞和肝癌!fepG2細胞表面增強拉曼光譜如圖3所示。PCA分析同實施例1。建立的分析散點圖如圖4所示，從而實現(xiàn)肝癌HepG2細胞的判別。
【權(quán)利要求】
1.一種利用表面增強拉曼光譜判別癌細胞的方法，其特征在于:采用超聲波快速預處理冰浴條件下孵育的SERS活性納米材料和多種不同類型細胞后，利用電穿孔方法分別將SERS活性納米材料快速導入不同類型細胞內(nèi)部，利用拉曼光譜儀檢測獲取細胞的表面增強拉曼光譜，建立多種不同類型細胞表面增強拉曼光譜數(shù)據(jù)庫，經(jīng)多變量統(tǒng)計分析進行聚類分析，獲得正常細胞與癌細胞的表面增強拉曼光譜對應的判別散點分布圖，據(jù)此實現(xiàn)癌細胞的判別。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的所述的一種利用表面增強拉曼光譜判別癌細胞的方法，其特征在于該方法包括如下步驟: (1)細胞標準樣品制備 用市售的RPMI 1640細胞培養(yǎng)液分別將細胞制成細胞懸液，然后通過血球記數(shù)板計算細胞的含量，調(diào)整細胞密度至I X IO4個/ml ； (2)拉曼光譜檢測 將預制好的銀溶膠或金溶膠分別與不同類型細胞懸液混合，混合均勻后轉(zhuǎn)入電擊杯中；先后經(jīng)冰浴5~10分鐘、超聲波預處理后，立即將電擊杯置電脈沖發(fā)生器的電擊基架上進行電脈沖處理，取出電擊杯立即冰浴5~10分鐘，然后轉(zhuǎn)移到預熱后的培養(yǎng)箱中，37°C培養(yǎng)10分鐘，最后利用共焦拉曼光譜儀檢測樣品以獲得不同類型樣品細胞的表面增強拉曼光譜； (3)細胞標準樣品表面增強拉曼光譜數(shù)據(jù)庫的建立 參照步驟(2)的操作，檢測獲得400~4000CHT1波數(shù)范圍內(nèi)不同種已知細胞種類的表面增強拉曼光譜，利 用8.0以上版本的origin軟件對不同種細胞表面增強拉曼光譜進行聚類分析和數(shù)據(jù)分析處理，建立用于判別和區(qū)分細胞標準樣品表面增強拉曼光譜數(shù)據(jù)庫； (4)癌細胞判別 取一種未知的癌細胞，采用步驟(1)和(2)的操作，得到細胞標準樣品表面增強拉曼光譜數(shù)據(jù)；將該數(shù)據(jù)與步驟(3)建立的細胞標準樣品表面增強拉曼光譜數(shù)據(jù)庫相對比，判別出未知癌細胞的種類。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的所述的一種利用表面增強拉曼光譜判別癌細胞的方法，其特征在于所述細胞包括市售的標準癌細胞和正常細胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的所述的一種利用表面增強拉曼光譜判別癌細胞的方法，其特征在于所述的銀溶膠或金溶膠使用的摩爾量與細胞的細胞數(shù)量比為50毫摩爾:100~20000細胞數(shù)量比。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的所述的一種利用表面增強拉曼光譜判別癌細胞的方法，其特征在于所述的電擊杯電極間隙范圍為I~4mm，電壓在350V~1000V之間，持續(xù)電擊時間100 μ s ~50ms。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的所述的一種利用表面增強拉曼光譜判別癌細胞的方法，其特征在于所述的細胞標準樣品制備，其過程是細胞接種24小時~72小時后，用pH值為7.2的PBS緩沖液將細胞洗3次，再加入0.25%胰酶，覆蓋細胞約30s后吸去胰酶，37°C放置2~3 min即可。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的所述的一種利用表面增強拉曼光譜判別癌細胞的方法，其特征在于所述的拉曼光譜儀測量，參數(shù)設定為:激光波長785nm，采樣時間10s，激發(fā)光功率約.3.5~3.75麗，收集波長范圍450 cm 1~1800cm 1O
8.根據(jù)權(quán)利要求1的所述的一種利用表面增強拉曼光譜判別癌細胞的方法，其特征在于所述的超聲波預處理，處理時間30~60秒。
9.根據(jù)權(quán)利要求1的所述的一種利用表面增強拉曼光譜判別癌細胞的方法，其特征在于所述的數(shù)據(jù)分析處理，是指將細胞表面增強拉曼光譜數(shù)據(jù)應用SPSS軟件分析工具欄中的PCA方法進行計算，具體步驟如下:①計算歸一化后各波數(shù)的協(xié)方差矩陣；②計算矩陣的本征值和本征向量；③利用T檢驗獲得最有顯著性差異的PCA得分；最后根據(jù)選出的主成份建立相應的分析散點圖，從而獲得表面增強拉曼光譜分析模型。
【文檔編號】G01N21/65GK103487425SQ201310413243
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2013年9月12日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月12日
【發(fā)明者】林居強, 陳榮, 馮尚源, 陳冠楠, 黃祖芳, 俞允, 陸鵬 申請人:福建師范大學