Hplc法分析蛹蟲草子實(shí)體和殘基中有效物含量的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種HPLC法分析蛹蟲草子實(shí)體和其固體培養(yǎng)殘基中腺苷和蟲草素含量的方法，包括首先進(jìn)行腺苷和蟲草素標(biāo)準(zhǔn)溶液和蛹蟲草子實(shí)體和其固體培養(yǎng)殘基供試溶液的制備，然后在色譜柱為XBridgeTMC18(5μm,4.6x150mm)；流動(dòng)相：甲醇、超純水，體積比為10:90；流速：1.0ml/min；進(jìn)樣量：10μL(自動(dòng)進(jìn)樣)；柱溫：30℃；檢測波長：254nm條件下分別測定蛹蟲草子實(shí)體、固體培養(yǎng)殘基供試溶液應(yīng)呈現(xiàn)與腺苷蟲草素標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜保留時(shí)間相同的色譜峰。本發(fā)明方法簡便有效，特別適于分析人工培養(yǎng)蛹蟲草子實(shí)體及其固體培養(yǎng)殘基中的腺苷和蟲草素含量，具有很好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。
【專利說明】HPLC法分析蛹蟲草子實(shí)體和殘基中有效物含量的方法【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及到分析化學(xué)領(lǐng)域，特別涉及一種用HPLC法分析蛹蟲草子實(shí)體和其固體培養(yǎng)殘基中腺苷和蟲草素含量的方法，該方法特別適用于分析人工培養(yǎng)蛹蟲草子實(shí)體和其固體培養(yǎng)殘基。
【背景技術(shù)】
[0002]蛹蟲草(又名北蟲草、北冬蟲夏草)子實(shí)體為麥角菌科蟲草屬真菌蛹草菌[Cordyc印smilitaris^Link)的干燥子座，是我國特有的名貴藥用真菌，具有擴(kuò)張器官、鎮(zhèn)靜、抗心律失常、降血壓、抗病原微生物、抗惡性腫瘤等多種藥理活性。腺苷、蟲草素等核苷類成分被作為蟲草質(zhì)量的主要參考指標(biāo)。腺苷(CltlH13N5O4)全稱腺嘌呤核苷，是核酸的基本結(jié)構(gòu)單位，它具有參與人體代謝和生理調(diào)節(jié)的功能。蟲草素(CltlH13N5O3)又稱蟲草菌素、3 '-脫氧腺苷，具有抗菌、消炎、抗氧化、抗腫瘤、調(diào)節(jié)人體內(nèi)分泌等作用。
[0003]目前蛹蟲草的人工培植技術(shù)主要有液體發(fā)酵方式和以大米為基質(zhì)的固體培養(yǎng)方式等，目前由于固體培養(yǎng)方式所需投資較小，簡便易行，目前已在國內(nèi)許多地區(qū)應(yīng)用。對于固體培養(yǎng)過程中的附屬產(chǎn)物-富含菌絲體的固體培養(yǎng)殘基，目前還沒有對其進(jìn)行系統(tǒng)的開發(fā)利用，仍當(dāng)作廢物扔棄，造成資源的浪費(fèi)，而蛹蟲草在培植過程中固體培養(yǎng)殘基是干子實(shí)體量的3~3.5倍，在蛹蟲草子實(shí)體被采收后，仍有大量含有腺苷與蟲草素等有效成分的菌絲殘留在其中，因此對其進(jìn)行開發(fā)研究是非常有必要的。
[0004]蛹蟲草作為一種藥食兩用的真菌，因品種產(chǎn)地，培養(yǎng)條件等原因，其中所含有效成分不盡相同。而蛹蟲草的固體培養(yǎng)殘基有大量菌絲殘留且成分復(fù)雜，其有效成分也有很大差異。蛹蟲草中腺苷和蟲草素的含量測定是蟲草產(chǎn)品質(zhì)量控制及代謝途徑研究的前提。目前，蛹蟲草及其固體培養(yǎng)殘基中腺苷和蟲草素的含量測定還沒有統(tǒng)一的國標(biāo)方法，因此確立一個(gè)簡便可靠的方法一次性進(jìn)樣同時(shí)分析子實(shí)體與其固體培養(yǎng)殘基中的腺苷和蟲草素的含量具有現(xiàn)實(shí)意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明提供一種HPLC法分析蛹蟲草子實(shí)體和其固體培養(yǎng)殘基中腺苷和蟲草素含量的方法，本發(fā)明的方法具有快速、準(zhǔn)確測定蛹蟲草子實(shí)體及其固體培養(yǎng)殘基中腺苷和蟲草素含量，有效控制人工培養(yǎng)蛹蟲草產(chǎn)品質(zhì)量的特點(diǎn)。
[0006]—種HPLC法分析蛹蟲草子實(shí)體和其固體培養(yǎng)殘基中腺苷和蟲草素含量的方法，包括以下步驟:
(I)腺苷和蟲草素標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備和蛹蟲草子實(shí)體及其固體培養(yǎng)殘基供試溶液制
備;
腺苷和蟲草素標(biāo)準(zhǔn)溶液制備:稱取干燥至恒重的腺苷及蟲草素標(biāo)準(zhǔn)品置于容器中，用水溶解并定容作為標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，加超純水將所述標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液稀釋成若干不同濃度的腺苷和蟲草素標(biāo)準(zhǔn)溶液； 分別制備蛹蟲草子實(shí)體及其固體培養(yǎng)殘基供試溶液:將蛹蟲草子實(shí)體烘干，經(jīng)粉碎機(jī)粉碎后過篩，精確稱取干燥至恒重的蛹蟲草子實(shí)體粉末樣品，加入提取液進(jìn)行提取，提取結(jié)束后分離得上清液，即為蛹蟲草子實(shí)體供試溶液；將蛹蟲草固體培養(yǎng)殘基烘干，經(jīng)粉碎機(jī)粉碎后過篩，精確稱取干燥至恒重的蛹蟲草固體培養(yǎng)殘基粉末樣品，加入提取液進(jìn)行提取，提取結(jié)束后分離得上清液，即為蛹蟲草固體培養(yǎng)殘基供試溶液；
(2)分別精密吸取腺苷和蟲草素標(biāo)準(zhǔn)溶液及蛹蟲草子實(shí)體供試溶液，過濾后注入進(jìn)樣小瓶，測定蛹蟲草子實(shí)體供試溶液應(yīng)呈現(xiàn)與腺苷和蟲草素標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜保留時(shí)間相同的色譜峰；分別精密吸取腺苷和蟲草素標(biāo)準(zhǔn)溶液及蛹蟲草固體培養(yǎng)殘基供試溶液，過濾后注入進(jìn)樣小瓶，測定蛹蟲草固體培養(yǎng)殘基供試溶液應(yīng)呈現(xiàn)與腺苷蟲草素標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜保留時(shí)間相同的色譜峰；測試的色譜條件如下:色譜柱為XBridgeTM C18 (5 μ m, 4.6 x 150 mm);流動(dòng)相:甲醇、超純水，體積比為10:90 ;流速:1.0 ml/min ;進(jìn)樣量:10 μ L,自動(dòng)進(jìn)樣；柱溫:30 V ;檢測波長:254 nm。
[0007]在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中，所述腺苷和蟲草素標(biāo)準(zhǔn)溶液制備方法為:精確稱取干燥至恒重的腺苷及蟲草素標(biāo)準(zhǔn)品各4mg，準(zhǔn)確到0.0001 g，于50 ml容量瓶中用水溶解并定容作為標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，濃度記為80 μ g/ml ;然后將所述標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用超純水稀釋成2 μ g/ml>5 μ g/ml> 10 μ g/ml>20 μ g/ml>40 μ g/ml>80 μ g/ml 的腺苷和蟲草素標(biāo)準(zhǔn)溶液。
[0008]在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中，所述蛹蟲草子實(shí)體及其固體培養(yǎng)殘基供試溶液制備方法為:將蛹蟲草子實(shí)體置于40 °C烘干箱烘干，經(jīng)粉碎機(jī)粉碎后過200目篩，精確稱取干燥至恒重的蛹蟲草子實(shí)體粉末樣品0.25 g于50 ml離心管中，加入25 ml提取液進(jìn)行超聲提取，提取結(jié)束后將離心管置于20 0C >5000 r/min的離心機(jī)中離心15 min，吸取上清液I ml，經(jīng)0.45 μ m水相微孔濾膜過濾；將蛹蟲草固體培養(yǎng)殘基置于40 °C烘干箱烘干，經(jīng)粉碎機(jī)粉碎后過200目篩,精確稱取干燥至恒重的蛹蟲草固體培養(yǎng)殘基粉末樣品0.25 g于50 ml離心管中，，加入25 ml提取液進(jìn)行超聲提取，提取結(jié)束后將離心管置于20 °C,5000 r/min的離心機(jī)中離心15 min,吸取上清液I ml,經(jīng)0.45 μ m水相微孔濾膜過濾。本發(fā)明優(yōu)選，提取液為水。
[0009]本發(fā)明還提供一種可作為分析蛹蟲草子實(shí)體和其固體培養(yǎng)殘基中腺苷和蟲草素含量標(biāo)準(zhǔn)的HPLC分析方法，包括以下步驟:
(I)腺苷和蟲草素標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備和蛹蟲草子實(shí)體及其固體培養(yǎng)殘基供試溶液制備；
腺苷和蟲草素標(biāo)準(zhǔn)溶液制備:精確稱取干燥至恒重的腺苷及蟲草素標(biāo)準(zhǔn)品各4mg，準(zhǔn)確到0.0001 g，于50 ml容量瓶中用水溶解并定容作為標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，濃度記為80 μ g/ml ；然后將所述標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用超純水稀釋成2 μ g/ml>5 μ g/ml>10 μ g/ml、20 μ g/ml、40μ g/ml,80 μ g/ml的腺苷和蟲草素標(biāo)準(zhǔn)溶液；
蛹蟲草子實(shí)體及其固體培養(yǎng)殘基供試溶液制備:將蛹蟲草子實(shí)體置于40 °C烘干箱烘干，經(jīng)粉碎機(jī)粉碎后過200目篩，精確稱取干燥至恒重的蛹蟲草子實(shí)體粉末樣品0.25 g于50 ml離心管中，加入25 ml提取液進(jìn)行超聲提取，提取結(jié)束后將離心管置于20 °C,5000 r/min的離心機(jī)中離心15 min,吸取上清液I ml,經(jīng)0.45 μ m水相微孔濾膜過濾；將蛹蟲草固體培養(yǎng)殘基置于40 °C烘干箱烘干，經(jīng)粉碎機(jī)粉碎后過200目篩，精確稱取干燥至恒重的蛹蟲草固體培養(yǎng)殘基粉末樣品0.25 g于50 ml離心管中，，加入25 ml提取液進(jìn)行超聲提取，提取結(jié)束后將離心管置于20 0C >5000 r/min的離心機(jī)中離心15 min，吸取上清液I ml，經(jīng)0.45 μ m水相微孔濾膜過濾；
(2)分別精密吸取腺苷和蟲草素標(biāo)準(zhǔn)溶液及蛹蟲草子實(shí)體供試溶液，過濾后注入進(jìn)樣小瓶，測定蛹蟲草子實(shí)體供試溶液應(yīng)呈現(xiàn)與腺苷和蟲草素標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜保留時(shí)間相同的色譜峰；分別精密吸取腺苷和蟲草素標(biāo)準(zhǔn)溶液及蛹蟲草固體培養(yǎng)殘基供試溶液，過濾后注入進(jìn)樣小瓶，測定蛹蟲草固體培養(yǎng)殘基供試溶液應(yīng)呈現(xiàn)與腺苷蟲草素標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜保留時(shí)間相同的色譜峰；測試的色譜條件如下:色譜柱為XBridgeTM C18 (5 μ m, 4.6 x 150 mm);流動(dòng)相:甲醇、超純水，體積比為10:90 ;流速:1.0 ml/min ;進(jìn)樣量:10 μ L,自動(dòng)進(jìn)樣；柱溫:30 V ;檢測波長:254 nm。
[0010]以上，所提到的腺苷和蟲草素標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備、蛹蟲草子實(shí)體供試溶液、蛹蟲草固體培養(yǎng)殘基供試溶液制備不分先后。
[0011]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果如下:
本發(fā)明的HPLC法分析蛹蟲草子實(shí)體和其固體培養(yǎng)殘基中腺苷和蟲草素含量的方法簡便有效，特別適用于分析人工培養(yǎng)蛹蟲草子實(shí)體和其固體培養(yǎng)殘基中的主要有效成分，即腺苷和蟲草素，有效控制其產(chǎn)品質(zhì)量，本發(fā)明的方法為通過大量實(shí)驗(yàn)所得到的切實(shí)可行的科學(xué)方法，具有很好的重復(fù)性和穩(wěn)定性，在實(shí)際應(yīng)用中具有使用方便，快速、準(zhǔn)確的特點(diǎn)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0012]圖1為本發(fā)明實(shí)施例1的提取液中乙醇濃度對測得的腺苷和蟲草素含量的影響； 圖2為本發(fā)明實(shí)施例1中蟲草素的標(biāo)準(zhǔn)曲線；
圖3為本發(fā)明實(shí)施例1中腺苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線；
圖4和圖5為應(yīng)用本發(fā)明實(shí)施例1的方法對一個(gè)未知蛹蟲草樣品子實(shí)體和其固體培養(yǎng)殘基測定的色譜圖，其中圖4為蛹蟲草子實(shí)體樣品的色譜圖，圖5為蛹蟲草固體培養(yǎng)殘基樣品的色譜圖。
【具體實(shí)施方式】
[0013]下方結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的描述。
[0014]以下實(shí)施例中所用儀器和試劑為:
儀器:Waters e2695型高效液相色譜儀；Waters 2489紫外可見光檢測器；millinium工作站及empowerf數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)(美國Waters公司)；ΚΗ_700Ε型超聲波清洗器；Milli_Q超純水制備及分配儀；
供試品:蛹蟲草子實(shí)體及其固體培養(yǎng)殘基(上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院蟲草課題組培植)；
試劑:腺苷標(biāo)準(zhǔn)品(純度>98%，上海源葉生物科技有限公司)；蟲草素標(biāo)準(zhǔn)品(純度>98%，上海融禾醫(yī)藥科技有限公司)；無水甲醇(JTBaker化工產(chǎn)品貿(mào)易有限公司)，色譜純；無水乙醇(中九科技有限公司)，分析純；超純水(經(jīng)Mill1-Q超純水制備及分配儀制備)；其它試劑均為分析純。
[0015]實(shí)施例1
本實(shí)施例中測試所用色譜條件為:色譜柱:由waters公司提供的XBridgeTM C18(5μ m, 4.6 X 150 mm)；流動(dòng)相:甲醇:水的體積比為10:90 ；
檢測波長:254nm ；
流速:1.0ml/min ；
柱溫:30 V
進(jìn)樣量:10 uL(自動(dòng)進(jìn)樣)。
[0016]本實(shí)施例中HPLC法分析蛹蟲草子實(shí)體和固體培養(yǎng)殘基中腺苷和蟲草素含量的方法包括如下步驟:
第一步、腺苷和蟲草素標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備和蛹蟲草子實(shí)體及其固體培養(yǎng)殘基供試溶液制
備
腺苷和蟲草素標(biāo)準(zhǔn)溶液制備:精確稱取干燥至恒重的腺苷及蟲草素標(biāo)準(zhǔn)品各4mg，準(zhǔn)確到0.0OOl g，于50 ml容量瓶中用水溶解并定容作為標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，濃度記為80 μ g/ml ；然后將所述標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用超純水稀釋成2 μ g/ml>5 μ g/ml>10 μ g/ml、20 μ g/ml、40μ g/ml,80 μ g/ml的腺苷和蟲草素標(biāo)準(zhǔn)溶液；
蛹蟲草子實(shí)體及其固體培養(yǎng)殘基供試溶液制備:將蛹蟲草子實(shí)體置于40 °C烘干箱烘干，經(jīng)粉碎機(jī)粉碎后過200目篩，精確稱取干燥至恒重的蛹蟲草子實(shí)體粉末樣品0.25 g于50 ml離心管中，加入25 ml提取液進(jìn)行超聲提取，提取結(jié)束后將離心管置于20 °C,5000 r/min的離心機(jī)中離心15 min,吸取上清液I ml,經(jīng)0.45 μ m水相微孔濾膜過濾；將蛹蟲草固體培養(yǎng)殘基置于40 °C烘干箱烘干，經(jīng)粉碎機(jī)粉碎后過200目篩，精確稱取干燥至恒重的蛹蟲草固體培養(yǎng)殘基粉末樣品0.25 g于50 ml離心管中，，加入25 ml提取液進(jìn)行超聲提取，提取結(jié)束后將離心管置于20 0C >5000 r/min的離心機(jī)中離心15 min，吸取上清液I ml，經(jīng)0.45 μ m水相微孔濾膜過濾；
第二步、分別精密吸取腺苷和蟲草素標(biāo)準(zhǔn)溶液及蛹蟲草子實(shí)體供試溶液，過濾后注入進(jìn)樣小瓶，測定蛹蟲草子實(shí)體供試溶液應(yīng)呈現(xiàn)與腺苷和蟲草素標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜保留時(shí)間相同的色譜峰；分別精密吸取腺苷和蟲草素標(biāo)準(zhǔn)溶液及蛹蟲草固體培養(yǎng)殘基供試溶液，過濾后注入進(jìn)樣小瓶，測定蛹蟲草固體培養(yǎng)殘基供試溶液應(yīng)呈現(xiàn)與腺苷蟲草素標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜保留時(shí)間相同的色譜峰；測試的色譜條件如下:色譜柱為XBridgeTM C18(5 μ m, 4.6 x 150mm);流動(dòng)相:甲醇、超純水,體積比為10:90 ;流速:1.0 ml/min ;進(jìn)樣量:10 μ I,自動(dòng)進(jìn)樣；柱溫:30 V ;檢測波長:254 nm。
[0017]本實(shí)施例中首先對影響提取結(jié)果的因素進(jìn)行了優(yōu)化，確定了最優(yōu)提取和測定條件，并對本實(shí)施例的方法的精密度和靈敏度進(jìn)行了評估。
[0018]首先對蛹蟲草子實(shí)體及其固體培養(yǎng)殘基供試溶液制備過程中提取液的組成和比例進(jìn)行了優(yōu)化選取，具體為:選取乙醇和/或水作為提取液，其中乙醇濃度分別為O %、20%、40 %、60 %、80 %> 100 %，不同提取液系統(tǒng)得到的同一樣品中腺苷和蟲草素含量結(jié)果見圖1，由圖可知，所測樣 品中腺苷和蟲草素的含量均隨著提取液中乙醇濃度的增大而明顯降低，當(dāng)乙醇濃度為100 %時(shí)，腺苷和蟲草素含量極低，而當(dāng)提取液為純水時(shí)，兩者的提取含量均為最高，因此，本發(fā)明優(yōu)選水為提取液。
[0019]其次，采用上述類似的方法對蛹蟲草子實(shí)體及其固體培養(yǎng)殘基供試溶液制備過程中提取時(shí)間及溫度的優(yōu)化選擇，結(jié)果發(fā)現(xiàn):
當(dāng)提取時(shí)間少于30 min時(shí)，所測腺苷含量隨提取時(shí)間的增加有較明顯的提高，當(dāng)提取時(shí)間為40 min時(shí)，所測腺苷含量達(dá)到最大，為192.87 mg/100g ;隨提取溫度升高，所測腺苷含量有下降趨勢，這可能由于腺苷分子中羥基較多，在溫度較高的條件下，腺苷分子內(nèi)或分子間易形成氫鍵，導(dǎo)致分子結(jié)構(gòu)發(fā)生變化所致?？傮w觀察發(fā)現(xiàn)，提取時(shí)間及溫度對所測蟲草素的影響均不大，并根據(jù)以上相關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，最終確定40 min為最佳時(shí)間，25°C為最佳提取溫度。
[0020]再次，采用上述類似的方法對蛹蟲草子實(shí)體及其固體培養(yǎng)殘基供試溶液制備過程中超聲功率及提取次數(shù)進(jìn)行了優(yōu)選，結(jié)果發(fā)現(xiàn):超聲功率改變對蟲草素的含量影響較小，但隨超聲功率的提聞，腺昔含量略有提聞，因此，本實(shí)驗(yàn)優(yōu)選實(shí)驗(yàn)儀器所能達(dá)到的最大超聲功率，此處為500 W ;而提取次數(shù)對蟲草素和腺苷的影響較小，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:用水提取I次，提取40 min即可將腺苷和蟲草素提取完全，提取2次僅使腺苷和蟲草素分別增加了
0.044 %，2.32 %，因此一次提取即可滿足分析要求，優(yōu)選提取次數(shù)為一次。
[0021]此外，發(fā)明人還對本實(shí)施例方法的測試精密度進(jìn)行了評估，方法如下:
質(zhì)量濃度為20 μ g/ml的腺苷和蟲草素標(biāo)準(zhǔn)溶液，過0.45 μ m微孔濾膜后注入進(jìn)樣瓶并編號(hào)；連續(xù)進(jìn)樣6次進(jìn)行測試，計(jì)算得腺苷和蟲草素的RSD (relative standarddeviation (相對標(biāo)準(zhǔn)偏差))值分別為0.559 %、0.433 %，均小于2.0 %，證明采用本實(shí)驗(yàn)方法對腺苷和蟲草素進(jìn)行一次性定量分析時(shí)，重現(xiàn)性好，結(jié)果可靠。
[0022]發(fā)明人還做了空白回收率實(shí)驗(yàn)對本實(shí)施例方法的測試靈敏度進(jìn)行了評估，具體如下:
取質(zhì)量濃度為20 μ g/ml的腺苷和蟲草素標(biāo)準(zhǔn)溶液，過0.45 μ m微孔濾膜后注入進(jìn)樣瓶中，連續(xù)進(jìn)樣3次，以標(biāo)準(zhǔn)曲線定量。測得腺苷和蟲草素的空白回收率平均值分別為99.06 %、99.11 %，說明色譜系統(tǒng)檢測靈敏度高，穩(wěn)定性好。
[0023]發(fā)明人還做了加標(biāo)回收`率實(shí)驗(yàn)以確定本實(shí)施例方法的加標(biāo)回收效果，具體如下: 分別稱取蛹蟲草子實(shí)體、固體培養(yǎng)殘基干燥粉末0.25 g，分別放至50 mL具塞離心管
中，分別加入15 mL超純水，塞緊，分別超聲提取40 min，分別過濾至25 mL容量瓶中，分別加入2.5 mL、1.25mL 80ppm腺苷和蟲草素標(biāo)準(zhǔn)溶液,定容至25mL,分別過0.45 μ m微孔濾膜后分別注入進(jìn)樣瓶中，編號(hào)，進(jìn)樣分析，結(jié)果見下表:
子實(shí)體中腺苷回收率為91.92 %~95.82 %，平均回收率為93.67 %，RSD為2.1 % ;蟲草素回收率為88.28 %~92.43 %，平均回收率為90.57 %，RSD為2.3 %。
[0024]固體培養(yǎng)殘基中腺苷回收率89.50 %~95.75 %，平均回收率為92.18 %, RSD為3.5% ;蟲草素回收率為94.65 %~95.20 %，平均回收率為94.86 %，RSD為2.3 %。
[0025]以上結(jié)果說明該實(shí)驗(yàn)方法加標(biāo)回收效果較好，可用于蛹蟲草子實(shí)體和固體培養(yǎng)殘基中腺苷和蟲草素的含量測定。
[0026]此外，發(fā)明人還對本實(shí)施例方法的供試溶液穩(wěn)定性進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，具體為:采用上述優(yōu)化后的提取方法對某一樣品進(jìn)行前處理，將提取得到的上清液分別在室溫下放置不同時(shí)間(O h、4 h、8 h、12 h、16 h、20 h、24 h),然后分別測定不同時(shí)間放置后的樣品中腺苷和蟲草素的含量。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn):在24 h內(nèi)，采用本實(shí)驗(yàn)提取條件提取的溶液，其腺苷和蟲草素的含量保持相對穩(wěn)定，腺苷和蟲草素七次實(shí)驗(yàn)的RSD值分別為4.61 %和0.56 %。
[0027]在蛹蟲草子實(shí)體和固體培養(yǎng)殘基中腺苷和蟲草素含量在色譜柱中進(jìn)行測試時(shí)，首先做出腺苷、蟲草素含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線，方法如下:取配好的6個(gè)不同濃度的腺苷和蟲草素標(biāo)準(zhǔn)溶液(2 μ g/ml>5 μ g/ml> 10 μ g/ml>20 μ g/ml>40 μ g/ml>80 μ g/ml)潤旋振蕩充分混勻，用0.45μπι水相微孔濾膜過濾后直接注入進(jìn)樣瓶。每個(gè)進(jìn)樣重復(fù)3次，以濃度(yg/mL)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，作出測定腺苷、蟲草素含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖2和圖3。
[0028]采用本實(shí)施例優(yōu)化后的方法對兩個(gè)未知供試樣品的蟲草素和腺苷含量進(jìn)行了測定，具體如下:
采用優(yōu)化后的提取條件對某一人工培養(yǎng)的蛹蟲草樣品進(jìn)行前處理，具體處理步驟及液相條件參照前面所述優(yōu)選條件。分別測定蛹蟲草子實(shí)體和固體培養(yǎng)殘基中腺苷、蟲草素含量。測試方法為:吸取處理好的樣品供試溶液I ml，經(jīng)0.45 μ m水相微孔濾膜過濾后注入進(jìn)樣瓶中。所得子實(shí)體中腺苷和蟲草素含量和固體培養(yǎng)殘基中腺苷和蟲草素含量的液相色譜圖分別如圖4和圖5所示。其中，子實(shí)體中腺苷和蟲草素的含量分別為52.993 mg/100g,10.189 mg/100g，平行處理3次，RSD值分別為2.087 %、1.131 % ;固體培養(yǎng)殘基中腺苷和蟲草素的含量分別為7.013 mg/100g, 19.340 mg/100g，平行處理3次，RSD值分別為6.78%、5.65 %。
[0029]本發(fā)明確立了一種高效液相色譜法一次進(jìn)樣同時(shí)測定蛹蟲草子實(shí)體和其固體培養(yǎng)殘基中腺苷和蟲草素的方法，并對樣品提取條件進(jìn)行了較全面的優(yōu)化。該方法主要有以下優(yōu)點(diǎn):
1)樣品前處理簡單，經(jīng)水超聲，一次性提取即可；
2)回收率高、穩(wěn)定性好。子實(shí)體中腺苷和蟲草素的加標(biāo)回收率分別為93.67 %、90.57%，重復(fù)測定的RSD分別為2.1 %、2.3 %(n=3);固體培養(yǎng)殘基中腺苷和蟲草素的加標(biāo)回收率分別為92.18 %、91.62 %，重復(fù)測定的RSD分別為3.5 %、3.0 %(n=3)；
3)較已報(bào)道的分析方法，簡化了流動(dòng)相的組成，尤其避免了緩沖鹽的使用對儀器的損傷，以甲醇和水為流動(dòng)相等度洗脫，分析過程極其簡便。
[0030]這為今后蛹蟲草子實(shí)體中腺苷和蟲草素的分析提供了參考依據(jù)。
[0031]以上公開的本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施例只是用于幫助闡述本發(fā)明。優(yōu)選實(shí)施例并沒有詳盡敘述所有的細(xì)節(jié)，也不限制該發(fā)明僅為所述的【具體實(shí)施方式】。顯然，根據(jù)本說明書的內(nèi)容，可作很多的修改和變化。本說明書選取并具體描述這些實(shí)施例，是為了更好地解釋本發(fā)明的原理和實(shí)際應(yīng)用，從而使所屬【技術(shù)領(lǐng)域】技術(shù)人員能很好地理解和利用本發(fā)明。本發(fā)明僅受權(quán)利要求書及其全部范圍和等效物的限制。
【權(quán)利要求】
1.一種HPLC法分析蛹蟲草子實(shí)體和其固體培養(yǎng)殘基中腺苷和蟲草素含量的方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)腺苷和蟲草素標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備和蛹蟲草子實(shí)體及其固體培養(yǎng)殘基供試溶液制備； 腺苷和蟲草素標(biāo)準(zhǔn)溶液制備:稱取干燥至恒重的腺苷及蟲草素標(biāo)準(zhǔn)品置于容器中，用水溶解并定容作為標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，加超純水將所述標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液稀釋成若干不同濃度的腺苷和蟲草素標(biāo)準(zhǔn)溶液； 分別制備蛹蟲草子實(shí)體及其固體培養(yǎng)殘基供試溶液:將蛹蟲草子實(shí)體烘干，經(jīng)粉碎機(jī)粉碎后過篩，精確稱取干燥至恒重的蛹蟲草子實(shí)體粉末樣品，加入提取液進(jìn)行提取，提取結(jié)束后分離得上清液，即為蛹蟲草子實(shí)體供試溶液；將蛹蟲草固體培養(yǎng)殘基烘干，經(jīng)粉碎機(jī)粉碎后過篩，精確稱取干燥至恒重的蛹蟲草固體培養(yǎng)殘基粉末樣品，加入提取液進(jìn)行提取，提取結(jié)束后分離得上清液，即為蛹蟲草固體培養(yǎng)殘基供試溶液； (2)分別精密吸取腺苷和蟲草素標(biāo)準(zhǔn)溶液及蛹蟲草子實(shí)體供試溶液，過濾后注入進(jìn)樣小瓶，測定蛹蟲草子實(shí)體供試溶液應(yīng)呈現(xiàn)與腺苷和蟲草素標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜保留時(shí)間相同的色譜峰；分別精密吸取腺苷和蟲草素標(biāo)準(zhǔn)溶液及蛹蟲草固體培養(yǎng)殘基供試溶液，過濾后注入進(jìn)樣小瓶，測定蛹蟲草固體培養(yǎng)殘基供試溶液應(yīng)呈現(xiàn)與腺苷蟲草素標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜保留時(shí)間相同的色譜峰；測試的色譜條件如下:色譜柱為XBridgeTM C18(5 μ m, 4.6 x 150 mm);流動(dòng)相:甲醇、超純水，體積比為10:90 ;流速:1.0 ml/min ;進(jìn)樣量:10 μ L,自動(dòng)進(jìn)樣；柱溫:30 V ;檢測波長:254 nm。
2.如權(quán)利要求1所述的HPLC法分析蛹蟲草子實(shí)體和其固體培養(yǎng)殘基中腺苷和蟲草素含量的方法，其特征在于，所述腺苷和蟲草素標(biāo)準(zhǔn)溶液制備方法為:精確稱取干燥至恒重的腺苷及蟲草素標(biāo)準(zhǔn)品各4mg，準(zhǔn)確到0.0001 g，于50 ml容量瓶中用水溶解并定容作為標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，濃度記為80 μ g/ml ;然后將所述標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用超純水稀釋成2 μ g/ml、5 μ g/ml、10 μ g/ml>20 μ g/ml、40 μ g/ml、80 μ g/ml的腺苷和蟲草素標(biāo)準(zhǔn)溶液。
3.如權(quán)利要求1所述的HPLC法分析蛹蟲草子實(shí)體和其固體培養(yǎng)殘基中腺苷和蟲草素含量的方法，其特征在于，所述蛹蟲草子實(shí)體及其殘基供試溶液制備方法為:將蛹蟲草子實(shí)體置于40 °C烘干箱烘干，經(jīng)粉碎機(jī)粉碎后過200目篩，精確稱取干燥至恒重的蛹蟲草子實(shí)體粉末樣品0.25 g于50 ml離心管中，加入25 ml提取液進(jìn)行超聲提取，提取結(jié)束后將離心管置于20 0C >5000 r/min的離心機(jī)中離心15 min，吸取上清液I ml，經(jīng)0.45 μ m水相微孔濾膜過濾；將蛹蟲草固體培養(yǎng)殘基置于40 °C烘干箱烘干，經(jīng)粉碎機(jī)粉碎后過200目篩，精確稱取干燥至恒重的蛹蟲草固體培養(yǎng)殘基粉末樣品0.25 g于50 ml離心管中，加入25ml提取液進(jìn)行超聲提取，提取結(jié)束后將離心管置于20 5000 r/min的離心機(jī)中離心15min,吸取上清液I ml,經(jīng)0.45 μ m水相微孔濾膜過濾。
4.如權(quán)利要求3所述的HPLC法分析蛹蟲草子實(shí)體和其固體培養(yǎng)殘基中腺苷和蟲草素含量的方法，其特征在于，所述提取液為水。
5.如權(quán)利要求4所述的HPLC法分析蛹蟲草子實(shí)體和其固體培養(yǎng)殘基中腺苷和蟲草素含量的方法，其特征在于，所述超聲提取在25°C條件下提取40分鐘，提取一次。
6.—種HPLC法分析蛹蟲草子實(shí)體和其固體培養(yǎng)殘基中腺苷和蟲草素含量的方法,其特征在于，包括以下步驟: (I)腺苷和蟲草素標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備和蛹蟲草子實(shí)體及其固體培養(yǎng)殘基供試溶液制備；腺苷和蟲草素標(biāo)準(zhǔn)溶液制備:精確稱取干燥至恒重的腺苷及蟲草素標(biāo)準(zhǔn)品各4mg，準(zhǔn)確到0.0OOl g，于50 ml容量瓶中用水溶解并定容作為標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，濃度記為80 μ g/ml ；然后將所述標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用超純水稀釋成2 μ g/ml>5 μ g/ml>10 μ g/ml、20 μ g/ml、40μ g/ml,80 μ g/ml的腺苷和蟲草素標(biāo)準(zhǔn)溶液； 蛹蟲草子實(shí)體及其固體培養(yǎng)殘基供試溶液制備:將蛹蟲草子實(shí)體置于40 °C烘干箱烘干，經(jīng)粉碎機(jī)粉碎后過200目篩，精確稱取干燥至恒重的蛹蟲草子實(shí)體粉末樣品0.25 g于50ml離心管中，加入25 ml提取液進(jìn)行超聲提取，提取結(jié)束后將離心管置于20 °C,5000 r/min的離心機(jī)中離心15 min,吸取上清液I ml,經(jīng)0.45 μ m水相微孔濾膜過濾；將蛹蟲草固體培養(yǎng)殘基置于40 °C烘干箱烘干，經(jīng)粉碎機(jī)粉碎后過200目篩，精確稱取干燥至恒重的蛹蟲草固體培養(yǎng)殘基粉末樣品0.25 g于50 ml離心管中，加入25 ml提取液進(jìn)行超聲提取，提取結(jié)束后將離心管置于20 0C >5000 r/min的離心機(jī)中離心15 min，吸取上清液I ml，經(jīng)0.45 μ m水相微孔濾膜過濾； (2)分別精密吸取腺苷和蟲草素標(biāo)準(zhǔn)溶液及蛹蟲草子實(shí)體供試溶液，過濾后注入進(jìn)樣小瓶，測定蛹蟲草子實(shí)體供試溶液應(yīng)呈現(xiàn)與腺苷和蟲草素標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜保留時(shí)間相同的色譜峰；分別精密吸取腺苷和蟲草素標(biāo)準(zhǔn)溶液及蛹蟲草固體培養(yǎng)殘基供試溶液，過濾后注入進(jìn)樣小瓶，測定蛹蟲草固體培養(yǎng)殘基供試溶液應(yīng)呈現(xiàn)與腺苷蟲草素標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜保留時(shí)間相同的色譜峰；測試的色譜條件如下:色譜柱為XBridgeTM C18 (5 μ m, 4.6 x 150 mm);流動(dòng)相:甲醇、超純水，體積比為10:90 ;流速:1.0 ml/min ;進(jìn)樣量:10 μ L,自動(dòng)進(jìn)樣；柱溫:30 V ;檢測波長:254 nm。
7.如權(quán)利要求6所述的HPLC法分析蛹蟲草子實(shí)體和其固體培養(yǎng)殘基中腺苷和蟲草素含量的方法，其特征在于，所述提取液為水。
8.如權(quán)利要求7所述的HPLC法分析蛹蟲草子實(shí)體和其固體培養(yǎng)殘基中腺苷和蟲草素含量的方法，其特征在于，所述超聲提取在25°C條件下提取40分鐘，提取一次。
【文檔編號(hào)】G01N30/02GK103512975SQ201310424244
【公開日】2014年1月15日 申請日期:2013年9月17日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月17日
【發(fā)明者】周培, 支月娥, 樂昕, 詹學(xué)佳 申請人:上海交通大學(xué)