一種從城市富營養(yǎng)化藍藻水華水體中提取藍藻毒素的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種從水體中提取藍藻毒素的方法。該方法包括如下步驟：1）向待提取水體中加入甲醇和冰醋酸，使甲醇的終體積含量為40%，使冰醋酸的終體積含量為3-5%，300赫茲連續(xù)超聲15-20min；2）將步驟1）超聲處理后的水樣調節(jié)pH為3，用0.45μm濾膜過濾，濾液于6500g離心5-10min，取上清；3）將步驟2）所得上清過固相萃取柱，用體積含量為40%的甲醇水溶液淋洗，再用體積含量為95%的甲醇水溶液洗脫，得到含有藍藻毒素的洗脫液；4）從步驟3）洗脫液中獲得藍藻毒素。本發(fā)明采用固相萃取技術，連續(xù)富集、純化、提取城市湖泊水體中的兩種藍藻毒素主要異構體MC-LR和MC-RR，具有所得產品純度高，易于操作，成本低廉等特點。
【專利說明】一種從城市富營養(yǎng)化藍藻水華水體中提取藍藻毒素的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于水環(huán)境保護領域，涉及一種從水體中提取藍藻毒素的方法，特別涉及一種從城市富營養(yǎng)化藍藻水華水體中提取兩種主要藍藻毒素類型RR和LR的方法。
【背景技術】
[0002]我國城市水體包括城市周邊濕地湖泊、公園景觀湖泊、城市河道等。然而最近20年來，隨著城市化進程的快速推進，工農業(yè)以及生活污水攜帶著大量的營養(yǎng)鹽排入城市湖泊水體中，導致城市水體營養(yǎng)化現(xiàn)象日益嚴重。水體的富營養(yǎng)化危害最大的一個表征現(xiàn)象就是藍藻水華的出現(xiàn)，更嚴重的后果是藍藻水華能釋放藍藻毒素危害人類和其他生物的安全。研究發(fā)現(xiàn)LR型藍藻毒素(MC-LR)和RR型藍藻毒素(MC-RR)是毒性最強，分布最廣，最為常見的兩種藻毒素類型。藻毒素不僅可以通過飲用水威脅動植物健康，而且可以在動植物體內富集，通過食物鏈的作用威脅人類健康。研究表明藍藻毒素具有強烈的肝毒性和腫瘤促進作用，可打破生命體的磷酸化和脫磷酸化的過程，從而促進腫瘤的發(fā)生。其危害性越來越得到世界范圍內的關注。盡管目前有關藻毒素形成及其生理生化方面的研究報道越來越多，但國際上藻毒素標準品價格仍非常昂貴，這也極大的限制了藻毒素相關研究的發(fā)展。
[0003]我國富營養(yǎng)化城市湖泊眾多，尤其夏秋季藍藻水華現(xiàn)象頻繁發(fā)生，藻毒素含量較大，這也為藻毒素提取制備提供了天然的物質基礎。然而令人遺憾的是目前有關城市湖泊藻毒素污染并未得到重視，每逢藍藻發(fā)生，通常打撈到岸邊或用化學試劑殺滅，這不僅嚴重污染了土壤和水質，也造成藻毒素資源的浪費。當前傳統(tǒng)的藻毒素提取方法通常為從制備的藻粉中提取。然而藻粉制備一為將打撈上來的藍藻在岸邊曝曬陰干，然后將其收集粉碎，這種方法在陰干過程中使得大量的藻細胞死亡腐敗，極大的危害了岸邊附近的土壤，而且其腐敗散發(fā)的揮發(fā)性氣體也污染了周圍的空氣，且不利于藻毒素的提取和純化。二為實驗室用冷凍干燥設備進行藻粉制備，雖然這種方法較好的控制了藻粉制備污染問題，但其制備量有限，且提取成本較高，不適合大量藻毒素提取。此外，目前藻毒素提取多針對MC-LR類型，MC-RR類型較少，這也是為何市場上MC-RR類型藻毒素價格更高的原因之一。

【發(fā)明內容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種從水體中提取藍藻毒素的方法，特別是從城市藍藻水華水體中提取主要藍藻毒素類型LR和RR的方法。
[0005]本發(fā)明所提供的從水體中提取藍藻毒素的方法，具體可包括如下步驟:
[0006](I)取待提取水體，向其中加入甲醇和冰醋酸，使甲醇的終體積含量為40%，使冰醋酸的終體積含量為3-5%，300赫茲連續(xù)超聲15-20min ；
[0007](2)將步驟(1)超聲處理后的水樣調節(jié)pH為3，用0.45 4 111濾膜(如6?/(:玻璃纖維濾膜)過濾，濾液于6500g離心5-10min (如5min或IOmin),取上清；
[0008](3)將步驟(2)所得上清過固相萃取柱(SPE柱)，使藍藻毒素富集到柱子上，用體積含量為40%的甲醇水溶液淋洗，再用體積含量為95%的甲醇水溶液洗脫，得到含有藍藻毒素的洗脫液；
[0009](4)從步驟(3)的洗脫液中獲得藍藻毒素。
[0010]在上述方法中，若要步驟(4)中獲得的藍藻毒素最大產量RR型藍藻毒素(MC-RR)，則所述方法的步驟(I)為:向待提取水體中加入甲醇和冰醋酸，使甲醇的終體積含量為40%，使冰醋酸的終體積含量為3%，300赫茲連續(xù)超聲15min ;若要步驟(4)中獲得最大產量LR藍藻毒素，則所述方法的步驟(I)為:向待提取水體中加入甲醇和冰醋酸，使甲醇的終體積含量為40%，使冰醋酸的終體積含量為5%，300赫茲連續(xù)超聲20min。
[0011]在上述方法的步驟(I)中，在所述向待提取水體中加入甲醇和冰醋酸之前，還可包括如下步驟:將所述待提取水體過100目網(wǎng)篩(去除水體中的大部分懸浮物)，將過篩后水樣用500g離心去沉淀(去除較小顆粒懸浮物)。
[0012]在上述方法的步驟(3)中，所述固相萃取柱可為C18固相萃取柱。在發(fā)明中，所述C18固相萃取柱具體為Cleanert C18-SPE層析柱(天津博納艾杰爾科技有限公司產品)。
[0013]步驟(3)中，在將步驟(2)所得上清過固相萃取柱之前，需先用I倍柱體積的甲醇和2倍柱體積的水(Mill1-Q水)先后沖洗所述固相萃取柱，使之活化。將步驟(2)所得上清過所述固相萃取柱時的流速可為5-10ml.mirT1 (如5ml.mirT1)。
[0014]在上述方法的步驟(4)中，所述從步驟(3)的洗脫液中獲得藍藻毒素的方法具體可包括如下(a)和(b)的步驟:
[0015](a)將所述洗脫液濃縮，得到藍藻毒素的濃縮液，溶劑為甲醇；
[0016](b)用高效液相色譜儀串聯(lián)質譜儀對步驟(a)所得濃縮液進行鑒定與分離，從所述濃縮液中分別得到所述RR型藍藻毒素和所述LR型藍藻毒素。
[0017]在上述方法中，進行所述步驟(b)時，采用的高效液相色譜條件具體如下:色譜柱為C18色譜柱，具體如Welch Ultimate XB-C18色譜柱(4.6mmX 150mm,粒徑5 μ m);流動相為如下流動相A和流動相B，采用所述流動相A和所述流動相B進行梯度洗脫；流動相A:甲醇；流動相B:體積百分含量為0.1%的甲酸水溶液；所述梯度洗脫為:0?3min，所述流動相中所述流動相A和所述流動相B的體積比從30:70線性變化到75:25 ；4?8min，所述流動相中所述流動相A和所述流動相B的體積比為75:25 ；9?12min，所述流動相中所述流動相A和所述流動相B的體積比從75:25線性變化到30:70 ;采用的質譜條件如下:正離子電離方式；噴霧電壓(IS)為5kV ;離子化溫度(TEM)為500°C;源內氣體I (GS1，N2)壓力為55kPa，源內氣體2 (GS2，N2)壓力為55kPa ;掃描方式為選擇離子模式，選擇質荷比為519.8或995.6 (MC-RR的質荷比為519.8，MC-LR的質荷比為995.6);碰撞氣壓力為Medium級;碰撞電壓為35V或50V (MC-LR碰撞電壓50V，MC-RR碰撞電壓35V)。
[0018]在以上所述的高效液相色譜條件中，流速可為0.8ml/min，上樣體積可為5_10 μ L(如5 μ L)，柱溫可為30。。。
[0019]在上述方法中，所述高效液相色譜儀為Ultimate3000型高效液相色譜儀(Dionex, USA);所述質譜儀為3200Q TRAP型串聯(lián)質譜儀(Aglient，USA)。
[0020]在上述方法中，所述步驟(b)具體為:采用以上所述的色譜條件和質譜條件對所述濃縮液進行鑒定與分離，收集與RR型藍藻毒素標準品保留時間(5.14min)—致的洗脫峰，從而實現(xiàn)從所述濃縮液中分離得到所述RR型藍藻毒素(如將洗脫峰液體減壓蒸干獲得RR型藍藻毒素干粉);收集與LR型藍藻毒素標準品保留時間(5.76min)—致的洗脫峰，從而實現(xiàn)從所述濃縮液中分離得到所述LR型藍藻毒素(如將洗脫峰液體減壓蒸干獲得LR型藍藻毒素干粉)。
[0021 ] 所述RR型藻毒素標準品和所述LR型藍藻毒素標準品均購于sigma公司。
[0022]以上本發(fā)明所提供的從水體中提取藍藻毒素的方法，適用于城市藍藻水華水體中提取兩種藍藻毒素主要類型。
[0023]所述水體為藍藻水華水體，如城市藍藻水華水體。
[0024]本發(fā)明針對目前城市湖泊富營養(yǎng)化問題嚴重，藍藻水華引起的藍藻毒素污染問題嚴重且藻毒素資源未加利用這一情況，根據(jù)藻毒素不同類型，建立從城市富營養(yǎng)化藍藻水華水體中提取藍藻毒素方法。該方法采用固相萃取技術，連續(xù)富集、純化、提取城市藍藻水華水體中的藍藻毒素兩種藍藻毒素主要異構體MC-LR和MC-RR，具有所得產品純度高，易于操作，成本低廉等特點。并采用液質聯(lián)用新方法進行藍藻毒素提取與分離，其具有快速，精確定性等優(yōu)點，且此方法能夠極大的克服目前常用ELISA酶聯(lián)反應不能有效區(qū)分藻毒素類型和高效液相色譜無法鑒別出現(xiàn)的假陽性峰，且無法準確定量的不足，是目前最新鑒定與分離的檢測技術。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0025]圖1為本發(fā)明快速提取城市藍藻水華水體中藍藻毒素主要類型MC-RR和MC-LR的流程圖。
[0026]圖2為藍藻毒素標準品的標準曲線和液質圖譜。其中，A為RR型藍藻毒素標準品的標準曲線方程為LR型藍藻毒素標準品的標準曲線方程。C為RR型藍藻毒素標準品的液質圖譜；D為LR型藍藻毒素標準品的液質圖譜。
[0027]圖3為提取的藍藻毒素的液質圖譜。其中，A為提取的RR型藍藻毒素(MC-RR)液質圖譜；B為提取的LR型藍藻毒素(MC-LR)液質圖譜。
【具體實施方式】
[0028]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0029]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0030]下述實施例均按照如下方法從水樣中提取藍藻毒素:
[0031]Cleanert C18-SPE層析柱:天津博納艾杰爾科技有限公司。
[0032]GF/C玻璃纖維濾膜:北京京騰盛景科技有限公司。
[0033]高效液相色譜儀:Ultimate3000型高效液相色譜儀(Dionex, USA)。
[0034]質譜儀:3200QTRAP 型串聯(lián)質譜儀(Aglient, USA)。
[0035]RR型藍藻毒素標準品和LR型藍藻毒素標準品:sigma公司。
[0036]實施例1、城市藍藻水華水體藍藻毒素的提取條件優(yōu)化
[0037]本實施例中的水樣為取自某公園的藍藻水華水體。
[0038]一、藍藻毒素粗提取中提取溶劑優(yōu)化實驗
[0039]1、實驗方法
[0040]按照如下方法進行水體藍藻毒素的提取，期間對“藍藻毒素粗提取”步驟中的提取溶劑進行優(yōu)化。具體如下:[0041](I)去除雜質處理:水樣首先經100目網(wǎng)篩去除里面的大部分懸浮物，然后經500g離心，去除較小顆粒懸浮物，定容到1L，得到過濾水樣。
[0042](2)藍藻毒素的粗提取:向過濾水樣中加入甲醇和冰醋酸，設置不同甲醇和冰醋酸混合提取溶劑組，使之提取溶劑終體積分數(shù)為(如表I所示):10%?70%甲醇+3%冰醋酸、10%?70%甲醇+5%冰醋酸、10%?70%甲醇+7%冰醋酸(每一實驗組均設置兩個平行)。將各平行的混合溶液分別于4°C 300赫茲條件下連續(xù)超聲5min提取藍藻毒素，超聲處理后的水樣PH調為7，用GF/C玻璃纖維濾膜(0.45 μ m)過濾，將濾液于6500g離心5分鐘，以除去溶液中破碎的藍藻細胞碎片；
[0043](3)用I倍柱體積的甲醇和2倍柱體積的Mill1-Q水先后沖洗Cleanert C18-SPE層析柱，使之活化；將步驟(2)所得上清過Cleanert C18-SPE層析柱,流速為5ml.mirT1,進行固相萃取(使藍藻毒素富集到柱子上)；用IOml體積含量為40%的甲醇水溶液淋洗；用20ml體積含量為95%的甲醇水溶液洗脫，得到含有藍藻毒素的洗脫液；
[0044](4)藍藻毒素的濃縮與保存:將含有藍藻毒素的洗脫液進行減壓蒸干后用甲醇溶液定容到1ml，得到藍藻毒素濃縮液，放置_20°C冰箱內。
[0045](5) RR/LR型藍藻毒素的分離及定性定量分析:利用高效液相色譜儀串聯(lián)質譜儀對藍藻毒素濃縮液中的RR/LR型藍藻毒素的進行分離，同時對其含量進行測定。其中，高效液相色譜儀為Ultimate3000型高效液相色譜儀(Dionex, USA)，質譜儀為3200Q TRAP型串聯(lián)質譜儀(Aglient, USA)。
[0046]A.色譜條件和質譜條件
[0047]色譜條件:色譜柱為Welch Ultimate XB-C18 色譜柱(4.6_X 150mm,粒徑 5 μ m);流動相為如下流動相A和流動相B，采用所述流動相A和所述流動相B進行梯度洗脫；流動相A:甲醇；流動相B:體積百分含量為0.1%的甲酸水溶液；所述梯度洗脫為:0?3min，所述流動相中所述流動相A和所述流動相B的體積比從30:70線性變化到75:25 ；4?8min，所述流動相中所述流動相A和所述流動相B的體積比為75:25 ;9?12min,所述流動相中所述流動相A和所述流動相B的體積比從75:25線性變化到30:70 ;柱溫30°C，流速0.8ml/min,進樣體積5 μ L。
[0048]質譜條件:正離子電離方式；噴霧電壓(IS)為5kV ;離子化溫度(TEM)為500°C;源內氣體I (GS1，N2)壓力為55kPa，源內氣體2 (GS2，N2)壓力為55kPa ;掃描方式為選擇離子模式，選擇質荷比為519.8或995.6 (MC-RR的質荷比為519.8，MC-LR的質荷比為995.6)；碰撞氣壓力為Medium級；碰撞電壓為35V或50V (提取MC-LR時碰撞電壓50V，提取MC-RR時碰撞電壓35V)。
[0049]B.待測樣品中藍藻毒素含量的定量分析
[0050]在對步驟(4)中得到的藍藻毒素濃縮液，以及不同濃度的RR型藍藻毒素標準品(或LR型藍藻毒素標準品)(溶劑為甲醇)進行以上液質聯(lián)用檢測過程中，質譜儀分析軟件根據(jù)檢測結果自動提取待測樣品(藍藻毒素濃縮液)中與RR型藍藻毒素標準品(或LR型藍藻毒素標準品)保留時間一致的物質的面積計數(shù)(Area counts)，一方面以RR型藍藻毒素標準品(或LR型藍藻毒素標準品)溶液的濃度(ng/mL)為橫坐標，以RR型藍藻毒素標準品(或LR型藍藻毒素標準品)溶液的面積計數(shù)(Area counts)為縱坐標，制作標準曲線，得到RR型藍藻毒素標準品(或LR型藍藻毒素標準品)的標準曲線方程；另一方面將待測樣品(藍藻毒素濃縮液)的面積計數(shù)(Area counts)自動代入RR型藍藻毒素標準品(或LR型藍藻毒素標準品)的標準曲線方程計算出待測樣品(藍藻毒素濃縮液)中的RR型藍藻毒素(或LR型
藍藻毒素)的含量。
[0051](6)藍藻毒素精提取物質保存:分別收集與RR型藍藻毒素標準品保留時間(5.14min) 一致的洗脫峰和與LR型藍藻毒素標準品保留時間(5.76min) 一致的洗脫峰，減壓蒸干后，放置在_80°C冰箱中保存。從而成功從藍藻毒素濃縮液中同時分離得到RR型藍藻毒素(MC-RR)和LR型藍藻毒素(MC-LR)。
[0052]2、實驗結果 [0053]根據(jù)以上步驟I (5)的檢測，分別得到待測樣品(藍藻毒素濃縮液)中RR型藍藻毒素(MC-RR)和LR型藍藻毒素(MC-LR)的含量。具體結果如表1所示。
[0054]表1藍藻毒素粗提取中不同用量的甲醇和冰醋酸處理提取效果比較
[0055]
【權利要求】
1.一種從水體中提取藍藻毒素的方法，包括如下步驟: (1)取待提取水體，向其中加入甲醇和冰醋酸，使甲醇的終體積含量為40%，使冰醋酸的終體積含量為3-5%，300赫茲連續(xù)超聲15-20min ； (2)將步驟(1)超聲處理后的水樣調節(jié)pH為3，用0.45 μ m濾膜過濾，濾液于6500g離心5-10min,取上清； (3)將步驟(2)所得上清過固相萃取柱，用體積含量為40%的甲醇水溶液淋洗，再用體積含量為95%的甲醇水溶液洗脫，得到含有藍藻毒素的洗脫液； (4)從步驟(3)的洗脫液中獲得藍藻毒素。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于:在上述方法中，步驟(1)為如下(I)或(II): (I)向待提取水體中加入甲醇和冰醋酸，使甲醇的終體積含量為40%，使冰醋酸的終體積含量為3%，300赫茲連續(xù)超聲15min ； (II)向待提取水體中加入甲醇和冰醋酸，使甲醇的終體積含量為40%，使冰醋酸的終體積含量為5%，300赫 茲連續(xù)超聲20min。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的方法，其特征在于:步驟(1)中，在所述向待提取水體中加入甲醇和冰醋酸之前，還包括如下步驟:將所述待提取水體過100目網(wǎng)篩，將過篩后水樣用500g離心去沉淀。
4.根據(jù)權利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于:步驟(3)中，所述固相萃取柱為C18固相萃取柱。
5.根據(jù)權利要求4所述的方法,其特征在于:所述C18固相萃取柱為CleanertC18-SPE層析柱。
6.根據(jù)權利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于:在步驟(4)中，所述從步驟(3)的洗脫液中獲得藍藻毒素的方法包括如下(a)和(b)的步驟: Ca)將所述洗脫液濃縮，得到藍藻毒素的濃縮液，所述濃縮液中的溶劑為甲醇； (b )用高效液相色譜儀串聯(lián)質譜儀對步驟(a)所得濃縮液進行鑒定與分離，從所述濃縮液中分別得到所述RR型藍藻毒素和所述LR型藍藻毒素。
7.根據(jù)權利要求6所述的方法，其特征在于:進行所述步驟(b)時，采用的高效液相色譜條件如下:色譜柱為C18色譜柱；流動相為如下流動相A和流動相B，采用所述流動相A和所述流動相B進行梯度洗脫；流動相A:甲醇；流動相B:體積百分含量為0.1%的甲酸水溶液；所述梯度洗脫為:0~3min，所述流動相中所述流動相A和所述流動相B的體積比從30:70線性變化到75:25 ；4~8min，所述流動相中所述流動相A和所述流動相B的體積比為75:25 ；9~12min，所述流動相中所述流動相A和所述流動相B的體積比從75:25線性變化到30:70 ； 進行所述步驟(b)時，采用的質譜條件如下:正離子電離方式；噴霧電壓為5kV ;離子化溫度為500°C;源內氣體I為N2、壓力為55kPa ;源內氣體2為N2、壓力為55kPa ;掃描方式為選擇離子模式，選擇質荷比為519.8或995.6 ;碰撞氣壓力為Medium級；碰撞電壓為35V或50V。
8.根據(jù)權利要求7所述的方法，其特征在于:所述高效液相色譜條件中，流速為0.8ml/min,上樣體積為5-10 μ L,柱溫為30°C。
9.根據(jù)權利要求6-8中任一所述的方法，其特征在于:所述步驟(b)為:采用權利要求7或8中所述的色譜條件和質譜條件對所述濃縮液進行檢測，收集保留時間為5.14min的洗脫峰，從而實現(xiàn)從所述濃縮液中分離得到所述RR型藍藻毒素；收集保留時間為5.76min的洗脫峰，從而實現(xiàn)從所述濃縮液中分離得到所述LR型藍藻毒素。
10.根據(jù)權利 要求1-9中任一所述的方法，其特征在于:所述待提取水體為藍藻水華水體。
【文檔編號】G01N30/06GK103543219SQ201310424925
【公開日】2014年1月29日 申請日期:2013年9月17日 優(yōu)先權日:2013年9月17日
【發(fā)明者】曲疆奇, 張清靖, 辛知明, 朱華 申請人:北京市水產科學研究所