尿液中丙烯酰胺巰基尿酸代謝物的自動(dòng)在線分析方法
【專利摘要】一種尿液中丙烯酰胺巰基尿酸代謝物的自動(dòng)在線分析方法，是對(duì)N-乙酰-S-（2－氨基甲酰乙基）-L-巰基丙氨酸（AAMA）、N-乙酰-S-（2-氨基甲酰-2-羥基乙基）-L-巰基丙氨酸（GAMA）的HPLC-MS/MS的測(cè)定分析方法，其特征在于：尿樣解凍后加入GAMA-d3、AAMA-d4內(nèi)標(biāo)，經(jīng)混勻、離心后，直接進(jìn)LC-MS/MS進(jìn)行AAMA、GAMA定量分析，通過(guò)液相色譜柱的選擇，六通閥轉(zhuǎn)換時(shí)間的確定及流動(dòng)相組成的優(yōu)化，以乙腈與0.1%甲酸水溶液為流動(dòng)相，采用四級(jí)桿串接質(zhì)譜對(duì)主流煙氣中的丙烯酰胺進(jìn)行檢測(cè)。通過(guò)本發(fā)明的在線分析方法，樣品不用經(jīng)任何前處理，操作簡(jiǎn)單，重復(fù)性和回收率好，適用于大批量樣品的分析。
【專利說(shuō)明】尿液中丙烯酰胺巰基尿酸代謝物的自動(dòng)在線分析方法
[0001]
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明屬于液相色譜-質(zhì)譜分析技術(shù)的領(lǐng)域，具體涉及一種丙烯酰胺巰基尿酸代謝物即N-乙酰-S- (2 —氨基甲酰乙基)-L-巰基丙氨酸(AAMA)、N-乙酰-S- (2-氨基甲酰-2-羥基乙基)-L-巰基丙氨酸(GAMA)的自動(dòng)在線分析方法。
【背景技術(shù)】
[0003]2001年，周元陵在《生物標(biāo)志物巰基尿酸的研究進(jìn)展》中指出由于巰基尿酸是外源性親電子化合物與GSH結(jié)合后代謝的終產(chǎn)物，所以，它能反映這些化合物的原型、中間產(chǎn)物以及它們與GSH結(jié)合的機(jī)制和在生物體內(nèi)的代謝狀況。
[0004]，丙烯酰胺巰基尿酸代謝物N-乙酰-S-(2 一氨基甲酰乙基)-L-巰基丙氨酸(AAMA)、N-乙酰-S- (2-氨基甲酰-2-羥基乙基)-L-巰基丙氨酸(GAMA)含量水平反映了人體對(duì)丙烯酰胺的吸收情況，是評(píng)價(jià)丙烯酰胺暴露水平特異而敏感的生物標(biāo)記物。
[0005]由于GAMA含量較低，為了實(shí)現(xiàn)AAMA、GAMA的同時(shí)測(cè)定，文獻(xiàn)中報(bào)道方法常需要對(duì)尿樣進(jìn)行復(fù)雜的富集凈化。如2005年，Melanie Isabell Boettcher, 2007年，ThomasBjellaas均采用固相萃取，濃縮富集樣品，然后利用LC-MS-MS對(duì)尿液中AAMA、GAMA進(jìn)行測(cè)定，前處理過(guò)程較為復(fù)雜。采用柱轉(zhuǎn)換在線預(yù)處理技術(shù)能實(shí)現(xiàn)生物樣品在線富集凈化，免去了其它前處理方法中繁瑣的操作，已成功應(yīng)用于體外DNA加合物、尿液中核苷的在線預(yù)處理。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的即建立簡(jiǎn)單、靈敏、準(zhǔn)確的丙烯酰胺巰基尿酸代謝物AAMA及GAMA分析方法。本發(fā)明以Agilent 6490質(zhì)譜儀(美國(guó)Agilent公司)；Agilent 1200高效液相色譜系統(tǒng)(包括2個(gè)二元液相泵，美國(guó)Agilent公司)；六通閥；富集柱；分析柱構(gòu)建了自動(dòng)在線分析尿液中AAMA、GAMA系統(tǒng)。樣品經(jīng)離心后，無(wú)需經(jīng)過(guò)任何凈化，可直接進(jìn)系統(tǒng)分析。實(shí)現(xiàn)了樣品在線富集凈化分析的全自動(dòng)過(guò)程。
[0007]本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的:
尿液中丙烯酰胺巰基尿酸代謝物的自動(dòng)在線分析方法，是將尿樣解凍后加入GAMA-d3、AAMA-d4內(nèi)標(biāo)，經(jīng)混勻、離心后，直接進(jìn)LC-MS/MS進(jìn)行AAMA、GAMA定量分析，通過(guò)液相色譜柱的選擇及流動(dòng)相組成的優(yōu)化，以乙腈與0.1%甲酸水溶液為流動(dòng)相，采用四級(jí)桿串接質(zhì)譜對(duì)對(duì)丙烯酰胺巰基尿酸代謝物AAMA及GAMA進(jìn)行檢測(cè)，具體測(cè)定步驟如下:
a.標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制和標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作:分別稱取GAMA Img>AAMA IOmg于兩個(gè)IOml容量瓶中，均以甲醇定容至10ml，得到GAMA及AAMA母液。取GAMA、AAMA母液各Iml于同一個(gè)IOOml容量瓶中，以甲醇定容，得到標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液。分別稱取GAMA-d3 lmg、AAMA_d410mg，于兩個(gè)IOml容量瓶中，均以甲醇定容至10ml，得到GAMA_d3及AAMA_d4母液。取GAMA_d3、AAMA-d4母液各200μ?于同一個(gè)IOml容量瓶中，以甲醇定容，得到內(nèi)標(biāo)溶液。分別取儲(chǔ)備液10、20、50、100、200、500、1000μ?于七個(gè)10 mL容量瓶中，每個(gè)容量瓶中加入內(nèi)標(biāo)溶液ΙΟΟμ?，以甲醇分別定容至10mL，得到7個(gè)系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。利用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀分別測(cè)定上述所有濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液中AAMA、GAMA含量，根據(jù)待測(cè)物及相應(yīng)內(nèi)標(biāo)的峰面積比和二者相應(yīng)的濃度比繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線并計(jì)算得到其回歸方程。
[0008]b.樣品制備:取Iml解凍后的待測(cè)測(cè)尿樣，加入GAMA-d3、AAMA-d4內(nèi)標(biāo)溶液ΙΟμ?，經(jīng)混勻、離心后，利用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)待測(cè)物及相應(yīng)內(nèi)標(biāo)的峰面積比及標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的回歸方程,計(jì)算出樣品中GAMA及AAMA含量。
[0009]c.液相色譜及質(zhì)譜條件:米用 Waters Symmetry Shield? RP18C30 mm X 2.I mm
1.d., 3.5 μ m)為富集柱,Waters Xbridge-C8 (150 mm X4.6 mm 1.d., 5 μ m)為分析柱的柱子配套系統(tǒng)，柱溫為室溫，各流動(dòng)相梯度及流速如表1。流動(dòng)相A、流動(dòng)相C均為0.1%甲酸水溶液，流動(dòng)相B、流動(dòng)相D均為乙腈溶液。
[0010]表1自動(dòng)分析系統(tǒng)液相條件
【權(quán)利要求】
1.一種尿液中丙烯酰胺巰基尿酸代謝物的自動(dòng)在線分析方法，是對(duì)N-乙酰-s_(2 —氨基甲酸乙基)-L-疏基丙氛酸(AAMA)、N_乙酸-S- (2-氛基甲酸_2_羥基乙基)-L-疏基丙氨酸(GAMA)的HPLC-MS/MS的測(cè)定分析方法，其特征在于:尿樣解凍后加入GAMA-d3、AAMA_d4內(nèi)標(biāo)，經(jīng)混勻、離心后，直接進(jìn)LC-MS/MS進(jìn)行AAMA、GAMA定量分析，通過(guò)液相色譜柱的選擇及流動(dòng)相組成的優(yōu)化，以乙腈與0.1%甲酸水溶液為流動(dòng)相，采用四級(jí)桿串接質(zhì)譜對(duì)丙烯酰胺巰基尿酸代謝物AAMA及GAMA進(jìn)行檢測(cè)，具體測(cè)定步驟如下: a.標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制和標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作:分別稱取GAMA、AAMA標(biāo)準(zhǔn)品，配制含有內(nèi)標(biāo)的7個(gè)系列標(biāo)準(zhǔn)溶液；利用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀分別測(cè)定上述所有濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液中AAMA、GAMA含量，根據(jù)待測(cè)物及相應(yīng)內(nèi)標(biāo)的峰面積比和二者相應(yīng)的濃度比繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線并計(jì)算得到其回歸方程； b.樣品制備:取Iml解凍后的待測(cè)測(cè)尿樣，加入GAMA-d3、AAMA-d4內(nèi)標(biāo)溶液ΙΟμ?，經(jīng)混勻、離心后，利用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)待測(cè)物及相應(yīng)內(nèi)標(biāo)的峰面積比及標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的回歸方程,計(jì)算出樣品中GAMA及AAMA含量； c.液相色譜及質(zhì)譜條件:采用富集柱、分析柱組成的柱子配套系統(tǒng)，柱溫為室溫，各流動(dòng)相梯度及流速如表1:流動(dòng)相Α、流動(dòng)相C均為0.1%甲酸水溶液，流動(dòng)相B、流動(dòng)相D均為乙腈溶液， 表1自動(dòng)分析系統(tǒng)液相條件
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的尿液中丙烯酰胺巰基尿酸代謝物的自動(dòng)在線分析方法，其特征在于:標(biāo)準(zhǔn)溶液的具體配制方法如下:分別稱取GAMA、AAMA—定量于兩個(gè)IOml容量瓶中，得到GAMA及AAMA母液；取GAMA、AAMA母液各一定量于同一個(gè)100ml容量瓶中，以甲醇定容，得到標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液；分別稱取GAMA-d3、AAMA-d4 —定量于兩個(gè)IOml容量瓶中，均以甲醇定容至10ml，得到GAMA-d3及AAMA_d4母液；取GAMA_d3、AAMA_d4母液各一定量于同一個(gè)IOml容量瓶中，以甲醇定容，得到內(nèi)標(biāo)溶液；分別取標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液10、20、50、100、200、500、1000PL于七個(gè)10 mL容量瓶中，每個(gè)容量瓶中加入內(nèi)標(biāo)溶液ΙΟΟμ?，以甲醇分別定容至10mL，得到7個(gè)系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的尿液中丙烯酰胺巰基尿酸代謝物的自動(dòng)在線分析方法，其特征在于:所述富集柱為 Waters Symmetry Shield? RP18 規(guī)格 30 mm X 2.I mm 1.d.，3.5P m,分析柱為 Waters Xbridge-C8 規(guī)`格 150 mm X 4.6 mm 1.d., 5 μ m。
【文檔編號(hào)】G01N30/06GK103512991SQ201310430789
【公開(kāi)日】2014年1月15日 申請(qǐng)日期:2013年9月22日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月22日
【發(fā)明者】王冰, 王昇, 趙閣, 余晶晶, 謝復(fù)煒, 蔡君蘭, 張曉兵, 劉惠民 申請(qǐng)人:中國(guó)煙草總公司鄭州煙草研究院