抗卡珀斯肉瘤皰疹病毒的疫苗藥物靶點(diǎn)sim的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，涉及抗卡珀斯肉瘤皰疹病毒的疫苗藥物靶點(diǎn)SIM，具體涉及一種抗珀斯肉瘤皰疹病毒的SIM多肽序列及其在制備疫苗中的用途。所述SIM結(jié)構(gòu)域?qū)ㄧ晁谷饬霭捳畈《镜幕蚪M穩(wěn)定、持續(xù)遺傳等維護(hù)潛伏期感染有重要作用；其可識(shí)別由SUMO-2修飾KAP1和Sin3A等多種轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄沉默復(fù)合物；其缺失可影響KSHV病毒基因組的穩(wěn)定遺傳和潛伏感染，以及提高微環(huán)境應(yīng)激條件下KSHV病毒啟動(dòng)裂解生活周期和破壞宿主細(xì)胞的效率，可作為抗卡珀斯肉瘤皰疹病毒的治療靶點(diǎn)。本發(fā)明還涉及所述多肽序列的出發(fā)表位的人工改造核苷酸序列、整個(gè)SIM亞功能結(jié)構(gòu)域不同組裝順序相應(yīng)核苷酸序列和其編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，以及在抗卡珀斯肉瘤皰疹病毒方面的治療潛在用途。
【專利說明】抗卡珀斯肉瘤皰疹病毒的疫苗藥物靶點(diǎn)SIM

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬生物醫(yī)學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及基因的開發(fā)與應(yīng)用，具體涉及一種抗珀斯肉瘤皰疹病毒的SIM多肽序列作為疫苗和藥物靶點(diǎn)的免疫治療的用途。

【背景技術(shù)】
[0002]現(xiàn)有技術(shù)公開了卡珀斯肉瘤皰疹病毒KSHV是多種人類惡性腫瘤的主要病原體，是最常見4種感染性腫瘤之一的主因。研究顯示，KSHV感染與HIV相關(guān)艾滋病患者、器官移植免疫抑制患者和部分免疫低下老年人等腫瘤發(fā)病和致死率密切相關(guān)。鑒于HIV感染率上升和器官移植/自身免疫患者免疫治療手段日漸廣泛，干預(yù)KSHV致病途徑已成為一種迫切需要的應(yīng)對舉措。全球范圍內(nèi)，在撒哈拉以南非洲國家流行地區(qū)KSHV檢測到高達(dá)80%，而美國多達(dá)20%。據(jù)估計(jì)，約14%的艾滋病死亡由與KSHV相關(guān)的最常見卡珀斯肉瘤(4%)并發(fā)癌癥引起。另據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界每年約6萬例的原發(fā)性滲出性淋巴瘤(PEL)診斷中，艾滋病相關(guān)淋巴瘤約占3-4%。更重要的是，相關(guān)領(lǐng)域中，目前尚未建立針對KSHV引發(fā)惡性腫瘤的治療方法或疫苗。研究顯示，由于KSHV可利用少數(shù)幾個(gè)病毒基因?qū)⒉《净蚪M附加到宿主的染色體和逃避宿主免疫監(jiān)視系統(tǒng)建立長期潛伏感染，因此，一旦被感染，患者將終身攜帶病毒。
[0003]與其它皰疹病毒相似，KSHV病毒具有潛伏期和裂解期兩個(gè)生活周期。在潛伏感染期，KSHV病毒僅有少量幾個(gè)病毒基因表達(dá)，其中包括了潛伏相關(guān)核抗原LANA。已有研究證明LANA是負(fù)責(zé)維護(hù)KSHV病毒潛伏感染的關(guān)鍵蛋白。研究表明LANA是一個(gè)含1162個(gè)氨基酸的多功能病毒蛋白，其不僅與KSHV病毒基因組的穩(wěn)定持續(xù)遺傳和建立潛伏感染密切相關(guān)，而且與降解腫瘤抑制蛋白如P53和VHL等有直接作用。但是，迄今，尚未有針對KSHV病毒感染特性而設(shè)計(jì)的治療性疫苗。因此，研發(fā)針對KSHV病毒潛伏感染的治療性疫苗至關(guān)重要。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是為克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供抗卡珀斯肉瘤皰疹病毒的疫苗藥物靶點(diǎn)SIM，具體涉及由與艾滋病相關(guān)的卡珀斯肉瘤皰疹病毒(KSHV)編碼的含SUM0-2特異結(jié)合功能結(jié)構(gòu)域(SIM, ^UMO-1nteracting Motif)的多肽序列。
[0005]本發(fā)明的進(jìn)一步目的是，提供所述的抗珀斯肉瘤皰疹病毒的SIM多肽序列及其在制備免疫治療疫苗和藥物靶點(diǎn)中的用途。
[0006]本發(fā)明基于大量前期研究發(fā)現(xiàn)，潛伏相關(guān)核抗原LANA特有SIM功能結(jié)構(gòu)域。該SIM結(jié)構(gòu)域是KSHV病毒編碼潛伏期相關(guān)核抗原LANA的一個(gè)功能結(jié)構(gòu)域，對卡珀斯肉瘤皰疹病毒的基因組穩(wěn)定、持續(xù)遺傳等維護(hù)潛伏期感染起著重要作用。該多肽序列可以識(shí)別包括由SUM0-2修飾KAPl和Sin3A等多種轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄沉默復(fù)合物。
[0007]本發(fā)明經(jīng)實(shí)驗(yàn)表明，上述多肽序列缺失可影響KSHV病毒基因組的穩(wěn)定遺傳和潛伏感染，SIM位點(diǎn)的封閉可促進(jìn)卡珀斯肉瘤病毒啟動(dòng)裂解細(xì)胞生活周期和破壞宿主細(xì)胞的效率。
[0008]本發(fā)明進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明阻斷潛伏感染不僅可阻止隨后的感染，而且可減少腫瘤的進(jìn)展，該SIM結(jié)構(gòu)域可作為抗卡珀斯肉瘤皰疹病毒的候選治療靶點(diǎn)。
[0009]本發(fā)明所述的與SUM0-2結(jié)合的功能結(jié)構(gòu)域SM是LANA蛋白的一個(gè)關(guān)鍵位點(diǎn)，其包含編碼SEQID No:1所示的61個(gè)氨基酸殘基的全長多肽；
[0010]I)該序列cDNA片段長為183bp,編碼61個(gè)氨基酸,分子量為9kDa的蛋白；
[0011]2)含有4個(gè)SUM0-2結(jié)合的亞功能結(jié)構(gòu)域，存在I個(gè)IYV，I個(gè)ISI和2個(gè)SSS。
[0012]本發(fā)明還涉及所述多肽序列的出發(fā)表位的人工改造核苷酸序列、整個(gè)SM亞功能結(jié)構(gòu)域不同組裝順序相應(yīng)核苷酸序列和其編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，以及所述基因和蛋白質(zhì)在制備抗卡珀斯肉瘤皰疫病毒方面的治療制劑中的用途。
[0013]如在實(shí)驗(yàn)中所證明的，本發(fā)明的SIM多肽蛋白能與大量的轉(zhuǎn)錄沉默子識(shí)別，該位點(diǎn)的缺失能有效地破壞LANA維護(hù)病毒基因組穩(wěn)定遺傳的能力。
[0014]此外，本發(fā)明SM位點(diǎn)缺失的LANA突變體喪失了阻遏裂解期調(diào)控蛋白R(shí)TA基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)，并可在細(xì)胞內(nèi)有效地裂解破壞腫瘤細(xì)胞。
[0015]本發(fā)明所述的SIM多肽疫苗藥物靶點(diǎn)具有抗KSHV病毒潛伏感染的高特異性、有效性，以及所產(chǎn)生抗體或小分子藥物對抗KSHV病毒感染具有很高的潛在抑制效率。
[0016]本發(fā)明所述的SIM多肽蛋白可作為抗原產(chǎn)生中和抗體以及作為結(jié)合靶點(diǎn)篩選獲得的小分子化學(xué)藥物，進(jìn)一步制備用于預(yù)防和治療KSHV病毒相關(guān)疾病的免疫制劑，如，抗卡珀斯肉瘤病毒潛伏期感染的疫苗。
[0017]為了便于理解，以下將通過具體的附圖和實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)地描述。需要特別指出的是，具體實(shí)例和附圖僅是為了說明，顯然本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以根據(jù)本文說明，在本發(fā)明的范圍內(nèi)對本發(fā)明做出各種各樣的修正和改變，這些修正和改變也納入本發(fā)明的范圍內(nèi)。

【專利附圖】

【附圖說明】
:
[0018]圖1示出卡珀斯肉瘤皰疹病毒編碼LANA中含SIM位點(diǎn)的61個(gè)氨基酸多肽序列(即SEQ ID NO:1)及其蛋白編碼所對應(yīng)的183個(gè)堿基序列(即SEQ ID NO:2)。
[0019]圖2示出含SM位點(diǎn)多肽的61個(gè)氨基酸序列(即SEQ ID NO:1)中兩個(gè)大亞SIM(SIM1和SM2)及附近酸性氨基酸區(qū)段(AD)空間結(jié)構(gòu)上的分布情況。
[0020]圖3為與SIM結(jié)構(gòu)域特異結(jié)合的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物，
[0021]上圖:SDS-PAGE檢測原核表達(dá)蛋白GST和GST-SM結(jié)合293細(xì)胞中蛋白復(fù)合物的考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果；下圖:上圖中與SM結(jié)構(gòu)域特異結(jié)合bl、b2、b3和b4蛋白的質(zhì)譜測序結(jié)果。
[0022]圖4為SM缺失降低LANA與KAPl和Sin3A蛋白結(jié)合能力，
[0023]其中，原核表達(dá)蛋白GST和GST融合野生型(WT)或SM缺失(ASM) LANA (下圖為考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果)與KAPl、Sin3A或DNA-PKc結(jié)合能力(上圖為免疫印跡結(jié)果)的差另1J。
[0024]圖5為SIM缺失降低LANA介導(dǎo)TR穩(wěn)定傳代特性，
[0025]其中，
[0026]A:染色體共沉淀檢測SM位點(diǎn)和酸性區(qū)段AD缺失對LANA結(jié)合TR能力的影響；B:嘌呤酶素處理含不同LANA突變體和TR-Purc/的293細(xì)胞14天后的細(xì)胞菌落分析結(jié)果。
[0027]圖6顯示SIM缺失導(dǎo)致LANA對裂解期調(diào)節(jié)關(guān)鍵蛋白R(shí)TA基因轉(zhuǎn)錄抑制能力的喪失，熒光報(bào)告基因分析正常供氧和低氧條件下不同LANA突變體對Rta基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄能力的影響。
[0028]圖7顯示了 SM缺失突變體顯性負(fù)效應(yīng)激活KSHV病毒DNA復(fù)制，
[0029]其中，含SM缺失的不同LANA突變體對攜帶野生型KSHV病毒的293細(xì)胞的激活作用。

【具體實(shí)施方式】
[0030]實(shí)施例1:LANA中與SUM0-2特異結(jié)合SM結(jié)構(gòu)域的確定與序列分析
[0031]1.與SUM0-2特異結(jié)合的LANA SM位點(diǎn)的確定
[0032]選用帶myc標(biāo)簽的不同區(qū)段LANA突變體與帶FLAG標(biāo)簽的SUM0-1或SUM0-2在人胚腎293細(xì)胞內(nèi)共表達(dá)，然后免疫共沉淀確定與SUM0-2特異高水平結(jié)合位點(diǎn)為LANA中第233至340個(gè)氨基酸區(qū)段。采用缺失和點(diǎn)突變方法確定為兩個(gè)大亞SM(即4個(gè)小亞SM)結(jié)合結(jié)構(gòu)域，分別為 244-1YVGSSS-25(^P 264-1SIGSSS-27(l(如圖1SEQ ID N0:1 所示)，所對應(yīng)核苷酸序列(如圖1SEQ ID NO: 2所示)。
[0033]2.含SM位點(diǎn)功能多肽的空間結(jié)合域和序列分析
[0034]針對含SM位點(diǎn)的LANA第233至340氨基酸序列進(jìn)行空間結(jié)合域和序列比對分析，結(jié)果顯示其第240至300個(gè)氨基酸(SEQ ID NO:2)形成一個(gè)相對獨(dú)立的“馬鞍式”空間結(jié)構(gòu)域，其附近86% QDE含量的酸性氨基酸區(qū)段為“環(huán)抱式”鄰近SM結(jié)構(gòu)域，如圖2所示。
[0035]實(shí)施例2 =SIM多肽蛋白的分離純化及其細(xì)胞內(nèi)結(jié)合蛋白復(fù)合物的鑒定
[0036]1.GST融合SM多肽蛋白基因工程菌的構(gòu)建與其編碼蛋白的表達(dá)純化
[0037]將含SM多肽序列(240-300個(gè)氨基酸)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)Bgl II和EcoRI酶切后，連接到大腸桿菌表達(dá)載體PGEX-2TK，感受態(tài)轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21株，在終濃度為100 μ g/ml氨芐青霉素抗性的培養(yǎng)基篩選后，獲得含重組質(zhì)粒GST-SM原核表達(dá)工程菌GST-SIM/BL21。該重組工程菌株已以甘油保藏方式，在中國科學(xué)院微生物保藏中心保藏備份(北京)。該重組工程菌株經(jīng)30°C IPTG誘導(dǎo)6小時(shí)，得到GST-SM的融合重組蛋白(與GST蛋白融合)，經(jīng)特異吸附的谷胱甘肽親和純化融合蛋白(圖3上圖)。
[0038]具體步驟如下:
[0039]I)重組蛋白樣品準(zhǔn)備:
[0040]a)在5ml LB培養(yǎng)基中接種含有表達(dá)目的蛋白的大腸桿菌工程菌，37°C活化過夜。
[0041]b) 1/100接種量轉(zhuǎn)接到新鮮LB37°C培養(yǎng)到接近對數(shù)生長期，加終濃度為ImM IPTG在30°C誘導(dǎo)6小時(shí)。
[0042]c)收集菌液 4°C, 5000rpmX 5min。
[0043]d)加一定體積的預(yù)冷的IXSTE重懸菌液，4°C,5000rpmX5min,去上清。
[0044]e)加1.5ml含蛋白酶抑制劑的NETN緩沖液和75 μ IlM DTT/lml STE重懸菌液，冰上進(jìn)行超聲波(40%強(qiáng)度，10秒，間隔10秒，50次)。
[0045]f) 4 °C, 10, OOOrpmX 1min,上清轉(zhuǎn)入一新 50ml 離心管，力卩 1.5ml 含 10 %Triton-XlOO的STE和100 μ I谷胱甘肽親和珠子，4°C旋轉(zhuǎn)2hr。
[0046]g)樣品轉(zhuǎn)移至2ml離心管，收集珠子4°C, 3000rpmX 5min。
[0047]h)含蛋白酶抑制劑的NETN緩沖液洗5遍，每次1ml。
[0048]i) NETN緩沖液重懸，放4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0049]2)試劑準(zhǔn)備:
[0050]STE 緩沖液:10mM NaCl，1mM Tris, ImM EDTA, pH=7.5
[0051]NETN 緩沖液:0.5% NP40, 20mM Tris ρΗ=8.0, ImM EDTA, 10mM NaCl
[0052]RIPA 緩沖液:1% NP40, 1mM Tris ρΗ=7.5,2mM EDTA, 150mM NaCl
[0053]2.與SM多肽結(jié)合胞內(nèi)蛋白的質(zhì)譜測序分析
[0054]18個(gè)人胚腎293細(xì)胞核的RIPA裂解物(NE)與100 μ I上述純化獲得的GST和GST-S頂?shù)鞍?°C旋轉(zhuǎn)孵育過夜后，用Iml含蛋白酶抑制劑TBS緩沖液洗5遍，每次4°C，3000rpmX5min。然后加SDS上樣緩沖液100°C 5min變性，4% -15%梯度膠濃度SDS-PAGE電泳分離(如圖3上圖所示);將與GST-SIM結(jié)合的細(xì)胞核裂解物中特有的明顯4條蛋白帶bl，b2，b3和b4切割回收，轉(zhuǎn)移至離心管后5%冰醋酸緩沖液送MALD1-T0F質(zhì)譜分析；結(jié)果表明，bl帶中高豐度蛋白為DNA-PKc ；b2帶中高豐度蛋白為CBP和p300 ；b3帶中高豐度蛋白為Sin3A ；b4帶中高豐度蛋白為KAPl (如圖3下圖所示)；
[0055]3.KAPl和Sin3A是SIM多肽結(jié)合復(fù)合物中的關(guān)鍵蛋白
[0056]為確定質(zhì)譜測定與SIM多肽結(jié)合復(fù)合物中5種蛋白中哪一個(gè)或幾個(gè)是關(guān)鍵蛋白，如步驟I純化獲得的GST、GST-LANA1-329WT和GST-LANA1-329 Δ SIM融合蛋白分別與16個(gè)人胚腎293細(xì)胞RIPA裂解物4°C旋轉(zhuǎn)孵育過夜后，用Iml含蛋白酶抑制劑TBS緩沖液洗5遍，每次4°C，3000rpmX5min ;然后加SDS上樣緩沖液100°C 5min變性，6%梯度膠濃度SDS-PAGE電泳分離后，分別進(jìn)行抗DNA-PKc、CBP、p300、Sin3A和KAPl的蛋白免疫印跡檢測，結(jié)果顯示，KAPl和Sin3A是SM多肽結(jié)合復(fù)合物中的關(guān)鍵蛋白(如圖4上圖所示)。
[0057]GST免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)步驟:
[0058]I)用RIPA細(xì)胞裂解液調(diào)節(jié)總蛋白量為Img體積為1ml，加入50 μ I的GST或GST
融合蛋
[0059]白懸液，4°C緩慢滾動(dòng)1-3小時(shí)；
[0060]2) 4°C, 3, OOOrpm 離心 5 分鐘，去上清；
[0061]3)加入Iml洗液NETN，重懸蛋白珠，4°C緩慢滾動(dòng)20分鐘；
[0062]4)重復(fù)上述兩步五次；
[0063]5)收集蛋白珠，盡量移走痕跡量的洗液；
[0064]6)加入25 μ I的上樣緩沖液；100°C變性3分鐘，
[0065]7) 12，OOOg 離心 20 秒；
[0066]8)上清進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳；
[0067]9)PVDF膜在甲醇中浸泡lmin，與兩層濾紙、海綿墊放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸潤至轉(zhuǎn)膜；
[0068]10)將海綿、濾紙、凝膠、PVDF膜、濾紙、海綿按程序疊放，10v轉(zhuǎn)膜60min ；
[0069]11) 5%脫脂奶粉(PBS配制)封閉，室溫，30min ；
[0070]12) TBST洗滌三次，5min/次，用一級兔源抗體(1:5000，PBS稀釋，杭州華安)，4°C孵育過夜；
[0071]13) TBST洗滌三次，5min/次，用HRP標(biāo)記的羊抗兔抗體室溫孵育Ih ； (1:5000, PBS稀釋，艾比馬特)TBST洗滌三次，5min/次；
[0072]14) ECL試劑盒顯影。
[0073]實(shí)施例3 =SIM缺失導(dǎo)致LANA維護(hù)KSHV病毒基因組穩(wěn)定遺傳功能的喪失
[0074]1.染色體免疫共沉淀檢測SM位點(diǎn)缺失對LANA DNA結(jié)合能力的影響
[0075]針對實(shí)施例1中所確定的SM位點(diǎn)和酸性氨基酸區(qū)段AD，構(gòu)建SM位點(diǎn)和/或AD區(qū)段或僅C末端的帶myc標(biāo)簽的LANA突變體后，分別與攜帶KSHV病毒基因組TR (末端重復(fù)序列)和嘌呤酶素抗性的重組質(zhì)粒pBS-Puro-TR共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，48小時(shí)后，按下述方法將轉(zhuǎn)染細(xì)胞的核提取物分別進(jìn)行染色體免疫共沉淀分析，結(jié)果如圖5A所示，表明SIM位點(diǎn)缺失對LANA的DNA結(jié)合能力無顯著影響。
[0076]將轉(zhuǎn)染細(xì)胞的核提取物分別進(jìn)行染色體免疫共沉淀分析:
[0077]1xHEPES-NaOH 緩沖液:
[0078]IM Hepes pH=7.8
[0079]11 % 甲醇溶液(approx)
[0080]交聯(lián)時(shí)工作液濃度為IX
[0081]此溶液為1X母液，實(shí)驗(yàn)時(shí)現(xiàn)用現(xiàn)配，工作液濃度為IX;
[0082]ChIP溶細(xì)胞緩沖液:
[0083]50mM Tris-Cl pH8.0
[0084]1mM EDTA
[0085]I % SDS
[0086]+蛋白酶抑制劑；
[0087]RIPA 緩沖液(IX):
[0088]1mM Tris-Cl ρΗ8.0
[0089]ImM EDTA
[0090]0.5mM EGTA
[0091]140mM NaCl
[0092]I % Triton XlOO
[0093]0.1%脫氧膽酸鈉
[0094]0.1 % SDS
[0095]+蛋白酶抑制劑；
[0096]Digesting 緩沖液:
[0097]mM Tris-Cl pH8.0
[0098]ImM EDTA
[0099]10mM NaCl
[0100]0.5% SDS
[0101](加入100ug/mL K 蛋白酶)。
[0102]實(shí)驗(yàn)步驟:
[0103]I)將2xl07轉(zhuǎn)染后細(xì)胞加入新配的HEPES/甲醛溶液，至終濃度為1%甲醛(加入0.5ml 11%的HEPES-NaOH-甲醛溶液；在實(shí)驗(yàn)前現(xiàn)用現(xiàn)配)，
[0104]2)室溫孵育10分鐘，
[0105]3)消化細(xì)胞后，4°C，2000rpm離心5分鐘，
[0106]4) PBS緩沖液洗滌材料，離心，重復(fù)兩次，
[0107]5)加入含蛋白酶抑制劑的CHIP溶菌緩沖液(ImL每1mg總蛋白)，將樣品分裝至兩個(gè)eppendorf離心管中，每個(gè)約500uL,
[0108]6)將樣品進(jìn)行超聲波破碎，以獲得長度約為500_1200bp的染色質(zhì)，超聲波破碎過程全部在冰上進(jìn)行(參考程序:超聲波處理2秒，暫停10秒，6個(gè)循環(huán))，
[0109]7)高速離心超聲波破碎產(chǎn)物，合并每個(gè)樣品的兩個(gè)離心管中的產(chǎn)物，
[0110]8)取5uL樣品，在I %瓊脂糖膠中電泳檢測大小，若條帶大小約為3kb，則進(jìn)行下面的步驟(通常未解交聯(lián)的染色質(zhì)電泳的條帶大于3kb)，
[0111]9)取一部分樣品作為 PCR 的 input 對照(5-20% )，，，，，，，，
[0112]10)預(yù)純化染色質(zhì):使用樹脂,如Protein A,在免疫沉淀反應(yīng)后得到免疫復(fù)合物，每管40uL分裝的預(yù)洗滌Protein A瓊脂柱并加入0.5X RIPA緩沖液+蛋白酶抑制劑稀釋樣品，根據(jù)電泳結(jié)果，加入約100-200uL超聲波破碎產(chǎn)物，預(yù)純化混合物總體積為Iml，4°C，翻轉(zhuǎn)搖床孵育I小時(shí)以上，去除能結(jié)合在樹脂上的非特異雜質(zhì)；本發(fā)明中優(yōu)選將一個(gè)樣品平均分至多管預(yù)純化，以取得將一個(gè)樣品預(yù)純化后再分裝至多管的更好的效果；短暫離心(2000rpm, lmin),上清轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入適當(dāng)?shù)目贵w(約3ug,取決于抗體濃度)，4°C，翻轉(zhuǎn)搖床孵育3小時(shí)或過夜；
[0113]11)將免疫沉淀下的DNA-蛋白復(fù)合物加入新的預(yù)洗滌過的瓊脂柱，4°C孵育1.5小時(shí)；
[0114]12)短暫離心(2000rpm，lmin)復(fù)合物，用800ul，0.5X RIPA緩沖液洗滌沉淀，重復(fù)3次，(加入緩沖液，振蕩離心管混勻，短暫離心，去除上清，重復(fù)洗滌);
[0115]13)加入300ul digesting緩沖液，65°C孵育4小時(shí)-過夜,解除交聯(lián);
[0116]14)每管加入等體積酹/氯仿/isoamylalchohol,潤旋振蕩，并4°C高速離心10分鐘，轉(zhuǎn)移液態(tài)上清至新的離心管，乙醇沉淀DNA，由于得到的DNA量很少，本發(fā)明中采用糖原或pellet paint作為載體;
[0117]15) 4°C，最高速離心30分鐘，去除上清，干燥沉淀，用20ul水重懸沉淀，用此作為PCR的模板，每個(gè)反應(yīng)用2ul。
[0118]2.細(xì)胞菌落實(shí)驗(yàn)分析SM位點(diǎn)缺失對LANA介導(dǎo)KSHV病毒基因組穩(wěn)定遺傳的影響
[0119]用實(shí)施例3中所得的轉(zhuǎn)染細(xì)胞加入嘌呤酶素進(jìn)行穩(wěn)定遺傳的細(xì)胞菌落分析，經(jīng)14天處理后，結(jié)果顯示了，SIM位點(diǎn)缺失后顯著地降低了 LANA介導(dǎo)KSHV病毒基因組穩(wěn)定遺傳的能力(如圖5B所示)。
[0120]實(shí)施例4SIM位點(diǎn)對LANA抑制KSHV病毒裂解期感染起關(guān)鍵作用
[0121 ] 1.熒光素酶報(bào)告基因分析檢測SIM位點(diǎn)缺失對LANA抑制裂解期激活蛋白R(shí)TA基因轉(zhuǎn)錄能力的影響
[0122]采用實(shí)施例3中相似方法將表達(dá)不同SM位點(diǎn)和/或AD區(qū)段且?guī)yc標(biāo)簽的LANA突變體和裂解期激活蛋白R(shí)TA啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)熒光素酶報(bào)告基因pRta-luc共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24小時(shí)后分別對轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行正常氧和低氧濃度處理，24小時(shí)處理后，分別用200 μ I報(bào)告裂解緩沖液(CatalOg#K801-200PrOmega公司)細(xì)胞，40 μ I細(xì)胞裂解上清與25 μ I熒光素分析底物反應(yīng)，用OpticompI Luminometer (MGM Instruments, Inc.)檢測突光強(qiáng)度，以β -半乳糖苷酶降解ONPG底物的450nm吸光值活性為對照內(nèi)參，以相對于報(bào)告基因載體本身的倍數(shù)作為相對熒光值(RLU)，所得結(jié)果為三次實(shí)驗(yàn)重復(fù)；結(jié)果顯示，正常供氧條件下，SIM位點(diǎn)缺失后顯著地降低了 LANA介導(dǎo)裂解期激活蛋白R(shí)TA轉(zhuǎn)錄抑制能力，而缺氧條件下未見顯著差異(如圖6所示)。
[0123]2.SIM位點(diǎn)缺失的LANA突變體顯性負(fù)調(diào)節(jié)激活KSHV病毒的基因組復(fù)制
[0124]采用實(shí)施例3中相似方法將不同劑量的SM位點(diǎn)和/或AD區(qū)段且?guī)yc標(biāo)簽的LANA突變體表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至攜帶KSHV病毒的293穩(wěn)定細(xì)胞系(293/Bac36)，轉(zhuǎn)染 48 小時(shí)后，分別用裂解緩沖液【1mM Tris-HCl pH8.0,150mM NaCl, 1mM EDTA,1% SDS]和蛋白酶K對轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行裂解提取病毒基因組DNA。所得病毒DNA以特異基因引物 K8:5’-CAAGCTCGCTGTTGTCAACC-3’ ；5’-GTCCTCTTGGTGGTGTGTGA-3’ ；TR:5’ -GGGGCGCGGGGTGTTCACGTAGT-3’ ；5’ -GGGGGCGCCCTCTCTCTACT-3’ 進(jìn)行定量 PCR，以 GAPDH:5’ -ACGACCACTTTGTCAAGCTC-3’ ；5’ -GGTCTACATGGCAACTGTGA-3’ 為內(nèi)參；結(jié)果顯示，SM 位點(diǎn)缺失顯著地提高KSHV病毒基因組的拷貝數(shù)，而AD區(qū)段缺失可進(jìn)一步促進(jìn)SM位點(diǎn)缺失導(dǎo)致的KSHV病毒基因組的復(fù)制拷貝數(shù)上升(如圖7所示)。
【權(quán)利要求】
1.一種抗卡珀斯肉瘤皰疹病毒的多肽序列，其特征在于，其氨基酸序列如SEQID No:1所示； 1)該序列cDNA片段長為183bp，編碼61個(gè)氨基酸，分子量為9kDa的蛋白； 2)含有4個(gè)SUM0-2結(jié)合的亞功能結(jié)構(gòu)域，存在I個(gè)IYV，I個(gè)ISI和2個(gè)SSS。
2.—種核酸，其特征在于，該核酸序列編碼權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)。
3.按權(quán)利要求1所述的抗卡珀斯肉瘤皰疹病毒的多肽序列，其特征在于，它還包括:具有SEQID No:1的氨基酸序列的多肽、或其人工蛋白或相應(yīng)編碼所需的核苷酸序列。
4.權(quán)利要求1、2或3中所述的多肽序列在制備維護(hù)卡珀斯肉瘤病毒基因組的穩(wěn)定性制劑中的用途。
5.權(quán)利要求1、2或3中所述的多肽序列在制備抗卡珀斯肉瘤病毒潛伏期感染的疫苗中的用途。
6.按權(quán)利要求5所述的用途，其中，含SUM0-2特異結(jié)合功能結(jié)構(gòu)域(SIM)位點(diǎn)的封閉促進(jìn)卡珀斯肉瘤病毒啟動(dòng)裂解細(xì)胞生活周期。
7.權(quán)利要求1、2或3中所述的多肽序列在篩選獲得抗卡珀斯肉瘤病毒潛伏期感染的小分子化學(xué)藥物中的用途，其中所述的多肽序列作為藥物靶點(diǎn)。
【文檔編號】G01N33/68GK104447964SQ201310431879
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2013年9月18日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月18日
【發(fā)明者】蔡啟良, 朱彩霞, 蔡屾 申請人:復(fù)旦大學(xué)