超聲波穿孔-激光光鑷細(xì)胞表面增強拉曼光譜分析方法
【專利摘要】一種基于超聲波穿孔效應(yīng)并結(jié)合激光光鑷表面增強拉曼光譜技術(shù)進行細(xì)胞判別的方法，是利用超聲波對細(xì)胞作用產(chǎn)生穿孔效應(yīng)使細(xì)胞膜通透性瞬間增強將金屬納米粒子快速導(dǎo)入細(xì)胞作為SERS增強基底，并利用激光光鑷技術(shù)捕獲活細(xì)胞同時進行表面增強拉曼光譜檢測，以SERS光譜的手段實現(xiàn)對癌細(xì)胞的病理檢測、篩選功能。本發(fā)明包括銀膠溶液制備；把高濃度銀膠注入活細(xì)胞并進行表面增強拉曼光譜測量；建立判別細(xì)胞為正常細(xì)胞或者癌癥細(xì)胞表面增強拉曼光譜診斷識別模型。本發(fā)明具有簡單迅速，可靠性強，靈敏度高的特點，可推廣應(yīng)用于多種癌變細(xì)胞的判別。
【專利說明】超聲波穿孔-激光光鑷細(xì)胞表面增強拉曼光譜分析方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明是涉及一種利用超聲波穿孔效應(yīng)并結(jié)合激光光鑷表面增強拉曼光譜(SERS)技術(shù)分析細(xì)胞的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]多種生物醫(yī)學(xué)技術(shù)已經(jīng)被應(yīng)用于定性、定量的去探測、篩選正?；虿∽兗?xì)胞。比如現(xiàn)在的放射學(xué)、藥理學(xué)、組織學(xué)、細(xì)胞學(xué)以及分子學(xué)技術(shù)都可以應(yīng)用在細(xì)胞的分析上。但是，這些技術(shù)都是具有破壞性的，同時它們的特異性不夠理想，并且很多時候要多種技術(shù)聯(lián)用才能進行有效的分析，而且還可能會受到細(xì)胞生物學(xué)手段的干擾。我們現(xiàn)在急需一種技術(shù)手段能夠克服上述幾種細(xì)胞分析技術(shù)局限性，能夠在臨床診斷上容易實現(xiàn)精確癌細(xì)胞分析與篩選。
[0003]表面增強拉曼光譜(SERS)技術(shù)與常規(guī)拉曼光譜相比能夠使拉曼信號增強因子達到1014，在某些條件甚至能夠?qū)崿F(xiàn)單分子檢測。同時，SERS技術(shù)還能夠在很大程度上抑制生物自體熒光背景的干擾。因此，SERS技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究。世界上已經(jīng)有多個研究小組利用SERS光譜進行細(xì)胞研究，但要想檢測到細(xì)胞SERS光譜信號，就必須要通過某種特殊方法使金屬納米粒子導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)部或使納米粒子與細(xì)胞能夠緊密吸附在一起，這樣才能檢測到細(xì)胞的SERS光譜信號。要使納米粒子進入細(xì)胞內(nèi)部能夠進行SERS檢測，現(xiàn)在比較常用的辦法是把金屬納米粒子與細(xì)胞共同培養(yǎng)、孵育，經(jīng)過長時間的培育(一般要24小時左右)，利用細(xì)胞的內(nèi)吞效應(yīng)，納米粒子就能夠被“吞”進細(xì)胞內(nèi)部，從而實現(xiàn)細(xì)胞SERS光譜檢測分析，但這種方法非常耗費時間；第二種方法就是利用生物細(xì)胞的自主還原機制，將帶有金屬離子的溶液與細(xì)胞共同孵育，在細(xì)胞內(nèi)部自發(fā)“長出”納米金屬顆粒，這種方法同樣需要長時間進行細(xì)胞培養(yǎng)，而且在細(xì)胞內(nèi)部被還原出來的金屬納米顆粒形狀不規(guī)則；第三方法是利用電穿孔技術(shù)快速將金屬納米粒子導(dǎo)入到細(xì)胞內(nèi)的輸送，但這種方法需要特殊的電穿孔設(shè)備、操作比較復(fù)雜、效率低，而且納米粒子在細(xì)胞中的分布很不均勻。
[0004]鑒于以上各種方法的不足之處，本發(fā)明專利提出利用超聲波聲孔效應(yīng)將金屬納米粒子快速導(dǎo)入細(xì)胞，并將激光光鑷?yán)庾V技術(shù)與這種超聲誘導(dǎo)技術(shù)相結(jié)合能夠檢測獲得高重現(xiàn)性的細(xì)胞SERS光譜，我們還進一步利用細(xì)胞SERS光譜進行癌細(xì)胞與正常細(xì)胞的篩選研究，獲得非常理想的判別效果。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種利用超聲波聲孔效應(yīng)結(jié)合激光光鑷表面增強拉曼光譜技術(shù)進行細(xì)胞分析的方法。它是利用高能超聲波作用瞬間產(chǎn)生聲孔效應(yīng)，使細(xì)胞周圍的微小氣泡發(fā)生劇烈收縮、膨脹并最終崩滅，與此同時這些發(fā)生劇烈變化的氣泡與細(xì)胞發(fā)生熱作用和機械作用在細(xì)胞膜上產(chǎn)生穿孔效應(yīng)，在細(xì)胞膜表面產(chǎn)生可逆性孔狀結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞膜通透性瞬間大大增強；同時金屬納米粒子在超聲波作用下形成單分散且處于高速運動狀態(tài)，這樣就可通過細(xì)胞膜表面短暫瞬間產(chǎn)生的小孔將金屬納米粒子快速導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)部作為SERS增強基底，并利用激光光鑷技術(shù)捕獲細(xì)胞同時進行表面增強拉曼光譜檢測，最后對獲得的細(xì)胞SERS光譜數(shù)據(jù)進行多變量統(tǒng)計分析(PCA-LDA)處理，通過散點圖中的診斷方程可以判別細(xì)胞為癌癥或者正常細(xì)胞。我們以鼻咽癌細(xì)胞和正常鼻咽細(xì)胞為模型對癌癥或者正常細(xì)胞的進行判別分析。在測量過程中利用激光光鑷技術(shù)能夠維持細(xì)胞處于生理活性狀態(tài)下進行SERS光譜測試。本發(fā)明所述的整個處理過程時間僅僅需要10分鐘，操作簡單、快速、可靠性強；能夠使金屬納米粒子非常高效地導(dǎo)入細(xì)胞中，并且金屬納米粒子分布比較均勻，能夠獲得重現(xiàn)性非常好的細(xì)胞SERS光譜。對正常和癌癥細(xì)胞的激光光鑷SERS光譜判別、分析結(jié)論可為醫(yī)生對病人的診斷提供快速、客觀的評價標(biāo)準(zhǔn)?？蓪⒋朔椒ㄍ卣?、應(yīng)用于其它多種癌癥細(xì)胞與正常細(xì)胞的判別分析。
[0006]為實現(xiàn)本發(fā)明的目的采用的技術(shù)方案是:
(1)取硝酸銀粉末溶于200ml的去離子水中加熱至沸騰，再滴入檸檬酸三鈉溶液制成含有銀納米粒子的銀膠溶液備用；
(2)將胰酶消化下來的活性細(xì)胞用RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液制成單細(xì)胞懸浮液備用；
(3)將銀膠溶液和單細(xì)胞懸浮液混合并利用超聲波穿孔效應(yīng)將銀納米粒子快速導(dǎo)入細(xì)
胞；
(4)在維持生理環(huán)境下對單細(xì)胞進行激光光鑷表面增強拉曼光譜檢測；
(5)建立細(xì)胞表面增強拉曼光譜數(shù)據(jù)庫，利用多變量統(tǒng)計分析獲得不同種類細(xì)胞的表面增強拉曼光譜對應(yīng)的散點圖；
(6)利用建立細(xì)胞表面增強拉曼光譜數(shù)據(jù)庫，對未診斷細(xì)胞進行判別。
[0007]所述的銀膠溶液的制備過程是:取36mg硝酸銀粉末溶于200ml的去離子水中，快速攪拌并加熱至沸騰，再滴入5ml濃度為1%檸檬酸三鈉溶液，繼續(xù)攪拌加熱I小時，制備獲得含有銀納米粒子的銀膠溶液，并放在室溫下避光封存?zhèn)溆茫?br> 所述的單細(xì)胞懸浮液的制備過程是:將胰酶消化下來的活性細(xì)胞用RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液制成單細(xì)胞懸浮液，然后通過血球計數(shù)板計算細(xì)胞的數(shù)目，控制細(xì)胞密度為IO5?IO6個/ml。
[0008]所述的利用超聲波穿孔效應(yīng)將銀納米粒子快速導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)部過程是:取預(yù)制備的好的銀膠溶液I ml進行離心，棄上清液后加入0.5ml的細(xì)胞培養(yǎng)液，與預(yù)制備好的活性單細(xì)胞懸浮液按1:1的比例放入離心管中，利用200ul的移液槍通過多次抽吸的方式使它們混合均勻，制成活性單細(xì)胞銀膠混合液；將離心管放入超聲池中，通過調(diào)節(jié)超聲波的功率、頻率，超聲池的溫度、超聲時間參數(shù)，將離心管中的活性單細(xì)胞銀膠混合液超聲作用；將超聲作用過的活性單細(xì)胞銀膠混合液與PBS緩沖液混合并進行低速離心、清洗三次，將沒有進入細(xì)胞內(nèi)部的銀納米顆粒清洗干凈，并將清洗過的細(xì)胞重新懸浮在RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液中備用。
[0009]所述的超聲波的功率為:200W?400W。
[0010]所述的超聲波的頻率為:25HZ、40HZ或59HZ ；
所述的超聲池的溫度為:室溫?60°C ；
所述的超聲時間為:lmin?30min。
[0011]所述的在維持生理環(huán)境下對單細(xì)胞進行激光光鑷表面增強拉曼光譜檢測過程是采用美國Thorlabs公司生產(chǎn)的附帶有拉曼光譜模塊的激光光鑷系統(tǒng)(型號:0TKB)，利用該激光光鑷系統(tǒng)捕獲RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液中活性單細(xì)胞，同時利用波長為785nm的半導(dǎo)體激光器作為激發(fā)光進行細(xì)胞SERS光譜檢測。為獲得高重現(xiàn)性SERS光譜，在保證能夠捕獲住細(xì)胞的條件下盡量降低激發(fā)光功率進行細(xì)胞SERS光譜測試，可獲得高重現(xiàn)性細(xì)胞SERS光譜。
[0012]所述的建立細(xì)胞表面增強拉曼光譜數(shù)據(jù)庫模型，其過程是:對細(xì)胞性質(zhì)進行判別必須由一個診斷模型來實現(xiàn)，而這一模型是通過定標(biāo)過程來建立的。為保證數(shù)據(jù)具有統(tǒng)計意義，需要采集足夠多確診病例的細(xì)胞SERS光譜，建立定標(biāo)光譜數(shù)據(jù)庫。在此基礎(chǔ)上，使用主元素分析方法和線性判別分析算法，建立由細(xì)胞SERS光譜參數(shù)構(gòu)成的診斷方程。我們首先需對細(xì)胞SERS光譜進行扣熒光和強度歸一化處理，把整條譜線數(shù)據(jù)輸入SPSS軟件進行主成分(PCA)分析，接著利用獨立變量T檢驗得到具有顯著性差異的PCA得分，并利用具有顯著性差異的PCA得分畫出帶有診斷方程的散點圖，并且進一步利用線性判別分析(LDA)得出統(tǒng)計結(jié)果。
[0013]所述的利用已建立細(xì)胞表面增強拉曼光譜數(shù)據(jù)庫模型，對未診斷細(xì)胞進行判別，其過程是:對未診斷細(xì)胞按照技術(shù)方案所述的方法制成所需的活性單細(xì)胞銀膠混合液，并在維持生理環(huán)境下對單細(xì)胞進行激光光鑷表面增強拉曼光譜檢測SERS光譜，將光譜導(dǎo)入已經(jīng)建立好的細(xì)胞表面增強拉曼光譜數(shù)據(jù)庫，利用多變量統(tǒng)計分析獲得未診斷細(xì)胞的表面增強拉曼光譜對應(yīng)的散點圖，根據(jù)分布在散點圖中診斷方程兩邊的區(qū)域來判別細(xì)胞。
[0014]本發(fā)明優(yōu)勢在于采用超聲穿孔效應(yīng)使金屬納米粒子能夠快速進入細(xì)胞，具有納米粒子導(dǎo)入效率高、金屬納米粒子在細(xì)胞內(nèi)部分布較均勻的特點，同時與激光光鑷技術(shù)相結(jié)合能保證細(xì)胞活性，能夠檢測獲得高重現(xiàn)性細(xì)胞SERS光譜；并且用此細(xì)胞SERS光譜數(shù)據(jù)建立診斷模型，可用于對鼻咽癌細(xì)胞的判別。也可將此方法拓展應(yīng)用于食道癌、皮膚癌等多種癌癥細(xì)胞的判別分析。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1是本發(fā)明對63個NP69正常細(xì)胞在超聲穿孔作用下細(xì)胞SERS光譜平均譜，影陰部分代表細(xì)胞SERS光譜的標(biāo)準(zhǔn)偏差。
[0016]圖2是本發(fā)明對67個C666鼻咽癌細(xì)胞在超聲穿孔作用下細(xì)胞SERS光譜平均譜，影陰部分代表細(xì)胞SERS光譜的標(biāo)準(zhǔn)偏差。
[0017]圖3是本發(fā)明對67個C666細(xì)胞與63個NP69細(xì)胞SERS光譜PCA得分PCl與PC2
二維散點圖。
[0018]圖4是本發(fā)明對67個C666細(xì)胞與63個NP69細(xì)胞SERS光譜PCA得分PCl、PC2和PC3三維散點圖。
【具體實施方式】
[0019]本發(fā)明的具體技術(shù)細(xì)節(jié)針對正常鼻咽細(xì)胞NP69、高分化鼻咽鱗狀細(xì)胞癌C666兩種類型細(xì)胞進行實施闡述如下:
實施例1
1、取36mg的固體硝酸銀溶于200ml的去離子水中，快速攪拌并加熱至沸騰，再滴入5ml的1%檸檬酸三鈉，繼續(xù)攪拌加熱I小時，得到銀溶膠溶液，并放在室溫下避光密封保存以備后續(xù)超聲誘導(dǎo)步驟使用；把用胰酶剛消化完的兩種活性細(xì)胞NP69、C666分別用市售的RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液制成單細(xì)胞懸浮液，然后通過血球計數(shù)板計算細(xì)胞的數(shù)目，控制細(xì)胞密度為IO6個/ml。
[0020]2、取上述制備好的銀膠溶液IOml進行離心，棄上清液后，平均分成兩組，每組分別加入2.5ml的細(xì)胞培養(yǎng)液混勻；每組分別取0.5ml銀溶膠與NP69、C666細(xì)胞懸浮液按1:1的比例分別放入各自的EP管中，利用200ul的移液槍通過多次抽吸的方式使銀溶膠懸浮液和細(xì)胞懸浮液混合均勻，制成單細(xì)胞銀膠混合液；
3、將裝有銀溶膠和細(xì)胞懸浮液的離心管放入超聲池中，通過調(diào)節(jié)超聲池的超聲波功率為200W、超聲波頻率為25HZ、超聲池溫度30°C、超聲時間lmin，使得離心管中的混合液處于最佳的超聲條件下超聲作用。
[0021]4、將超聲作用過的細(xì)胞與PBS緩沖液混合并進行低速離心，清洗三次，將沒有進入細(xì)胞內(nèi)部的金屬納米顆粒清洗干凈，并將清洗過的細(xì)胞重新懸浮在培養(yǎng)液中備用。
[0022]5、將清洗過的細(xì)胞懸浮液注入激光光鑷?yán)綔y系統(tǒng)的樣品池中，在細(xì)胞培養(yǎng)液的環(huán)境中進行光鑷SERS光譜檢測，激發(fā)光波長為785nm的半導(dǎo)體激光器。測試條件為100倍Nikon油鏡。
[0023]6、將已經(jīng)確定的正常鼻咽細(xì)胞和鼻咽癌細(xì)胞SERS光譜建立定標(biāo)光譜數(shù)據(jù)庫，并將所有細(xì)胞SERS譜線輸入到SPSS軟件進行PCA分析，下面是應(yīng)用PCA分析的具體計算過程:
(1)首先把63個正常NP69鼻咽細(xì)胞和67個C666鼻咽癌細(xì)胞SERS光譜利用多項式擬合消除熒光背景；
(2)為減小實驗誤差影響，把已經(jīng)消除熒光背景的正常與鼻咽癌細(xì)胞SERS光譜進行面積歸一化處理；
(3)利用SPSS軟件把經(jīng)過(I)、(2)處理過的正常與鼻咽癌細(xì)胞SERS光譜進行PCA分
析；
(4)在此基礎(chǔ)上利用SPSS中的T檢驗法，選擇最有顯著性差異的三個PCA得分來進一步進行LDA分析；
利用T檢驗獲得三個最有顯著性差異的PCA得分并畫出散點圖分布。
[0024]本發(fā)明通過獨立變量T檢驗確認(rèn)PCA分析后主成分1、主成分2以及主成分4這三個主成分具有顯著性差異。我們進一步畫出主成分I與主成分4帶有診斷方程的二維散點圖，如附圖3所示。診斷方程為y=_2.73x-0.43，這條診斷方程線能夠?qū)⒈茄拾┘?xì)胞點集分布與正常細(xì)胞點集分布有效分隔起來。如果利用兩類細(xì)胞SERS光譜PCA分析中具有顯著性差異的主成分1、主成分2以及主成分4進一步畫出三維散點圖，如圖4所示，可以發(fā)現(xiàn)代表正常鼻咽細(xì)胞和代表鼻咽癌細(xì)胞的數(shù)據(jù)點分布在兩個相互獨立的空間，彼此之間沒有任何重疊，區(qū)分效果非常明顯。進一步利用后續(xù)的LDA分析得出統(tǒng)計結(jié)果，本發(fā)明對定標(biāo)光譜集中的癌癥細(xì)胞識別的特異性和靈敏度都達到100%。正常與鼻咽癌細(xì)胞SERS光譜PCA得分散點圖分布即是本發(fā)明的測量結(jié)果，也可為醫(yī)生診斷提供重要參考依據(jù)。
[0025]實施例2
1、取36mg的固體硝酸銀溶于200ml的去離子水中，快速攪拌并加熱至沸騰，再滴入5ml的1%檸檬酸三鈉，繼續(xù)攪拌加熱I小時，得到銀溶膠溶液，并放在室溫下避光密封保存以備后續(xù)超聲誘導(dǎo)步驟使用；把用胰酶剛消化完的兩種活性細(xì)胞NP69、C666分別用市售的RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液制成單細(xì)胞懸浮液，然后通過血球計數(shù)板計算細(xì)胞的數(shù)目，控制細(xì)胞密度為IO6個/ml。
[0026]2、取上述制備好的銀膠溶液IOml進行離心，棄上清液后，平均分成兩組，每組分別加入2.5ml的細(xì)胞培養(yǎng)液混勻；每組分別取0.5ml銀溶膠與NP69、C666細(xì)胞懸浮液按1:1的比例分別放入各自的EP管中，利用200ul的移液槍通過多次抽吸的方式使銀溶膠懸浮液和細(xì)胞懸浮液混合均勻，制成單細(xì)胞銀膠混合液；
3、將裝有銀溶膠和細(xì)胞懸浮液的離心管放入超聲池中，通過調(diào)節(jié)超聲池的超聲波功率為250W、超聲波頻率為40HZ、超聲池溫度24°C、超聲時間20min，使得離心管中的混合液處于最佳的超聲條件下進行超聲作用。
[0027]4、將超聲作用過的細(xì)胞與PBS緩沖液混合并進行低速離心，清洗三次，將沒有進入細(xì)胞內(nèi)部的金屬納米顆粒清洗干凈，并將清洗過的細(xì)胞重新懸浮在培養(yǎng)液中備用。
[0028]5、將清洗過的細(xì)胞懸浮液注入激光光鑷?yán)綔y系統(tǒng)的樣品池中，在細(xì)胞培養(yǎng)液的環(huán)境中進行光鑷SERS光譜檢測，激發(fā)光波長為785nm的半導(dǎo)體激光器。測試用的物鏡為100倍Nikon油鏡。
[0029]6、將已經(jīng)確定的正常鼻咽細(xì)胞和鼻咽癌細(xì)胞SERS光譜建立定標(biāo)光譜數(shù)據(jù)庫，并將所有細(xì)胞SERS譜線輸入到SPSS軟件進行PCA分析，下面是應(yīng)用PCA分析的具體計算過程:
(1)1)1首先把120個正常NP69鼻咽細(xì)胞和130個C666鼻咽癌細(xì)胞SERS光譜利用多項式擬合消除熒光背景；
(2)為減小實驗誤差影響，把已經(jīng)消除熒光背景的正常與鼻咽癌細(xì)胞SERS光譜進行面積歸一化處理；
(3)利用SPSS軟件把經(jīng)過(I)、(2)處理過的正常與鼻咽癌細(xì)胞SERS光譜進行PCA分
析；
(4)在此基礎(chǔ)上利用SPSS中的T檢驗法，選擇最有顯著性差異的三個PCA得分來進一步進行LDA分析；
(5)利用T檢驗獲得三個最有顯著性差異的PCA得分并畫出散點圖分布。
[0030]本發(fā)明通過獨立變量T檢驗確認(rèn)PCA分析后主成分1、主成分2以及主成分4這三個主成分具有顯著性差異。我們進一步畫出主成分I與主成分4帶有診斷方程的二維散點圖。這條診斷方程線能夠?qū)⒈茄拾┘?xì)胞點集分布與正常細(xì)胞點集分布有效分隔起來。如果利用兩類細(xì)胞SERS光譜PCA分析中具有顯著性差異的主成分1、主成分2以及主成分4進一步畫出三維散點圖，可以發(fā)現(xiàn)代表正常鼻咽細(xì)胞和代表鼻咽癌細(xì)胞的數(shù)據(jù)點分布在兩個相互獨立的空間，彼此之間沒有任何重疊，區(qū)分效果非常明顯。進一步利用后續(xù)的LDA分析得出統(tǒng)計結(jié)果，本發(fā)明對定標(biāo)光譜集中的癌癥細(xì)胞識別的特異性和靈敏度幾乎都達到100%。正常與鼻咽癌細(xì)胞SERS光譜PCA得分散點圖分布即是本發(fā)明的測量結(jié)果，也可為醫(yī)生診斷提供重要參考依據(jù)。
【權(quán)利要求】
1.一種超聲波穿孔-激光光鑷細(xì)胞表面增強拉曼光譜分析方法，其特征在于該方法由以下步驟組成: (I)取硝酸銀粉末溶于200ml的去離子水中加熱至沸騰，再滴入檸檬酸三鈉溶液制成含有銀納米粒子的銀膠溶液備用； (2)將胰酶消化下來的活性細(xì)胞用RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液制成單細(xì)胞懸浮液備用； (3)將銀膠溶液和單細(xì)胞懸浮液混合并利用超聲波穿孔效應(yīng)將銀納米粒子快速導(dǎo)入細(xì)胞； (4)在維持生理環(huán)境下對單細(xì)胞進行激光光鑷表面增強拉曼光譜檢測； (5)建立細(xì)胞表面增強拉曼光譜數(shù)據(jù)庫，利用多變量統(tǒng)計分析獲得不同種類細(xì)胞的表面增強拉曼光譜對應(yīng)的散點圖； (6)利用已建立細(xì)胞表面增強拉曼光譜數(shù)據(jù)庫，對未診斷細(xì)胞進行判別。
2.如權(quán)利要求1所述的一種超聲波穿孔-激光光鑷細(xì)胞表面增強拉曼光譜分析方法，其特征在于所述的利用超聲波穿孔效應(yīng)將銀納米粒子快速導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)部過程是:取預(yù)制備好的銀膠溶液I ml進行離心，棄上清液后加入0.5ml的細(xì)胞培養(yǎng)液，與預(yù)制備好的活性單細(xì)胞懸浮液按1:1的比例放入離心管中，利用200ul的移液槍通過多次抽吸的方式使它們混合均勻，制成活性單細(xì)胞銀膠混合液；將離心管放入超聲池中，通過調(diào)節(jié)超聲波的功率、頻率，超聲池的溫度、超聲時間參數(shù)，將離心管中的活性單細(xì)胞銀膠混合液進行超聲作用；將超聲作用過的活性單細(xì)胞銀膠混合液與PBS緩沖液混合并進行低速離心、清洗三次，將沒有進入細(xì)胞內(nèi)部的銀納米顆粒清洗干凈，并將清洗過的細(xì)胞重新懸浮在RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液中備用。
3.如權(quán)利要求1所述的一種超聲波穿孔-激光光鑷細(xì)胞表面增強拉曼光譜分析方法，其特征在于所述的超聲波，其功率為200W~400W。
4.如權(quán)利要求1所述的一種超聲波穿孔-激光光鑷細(xì)胞表面增強拉曼光譜分析方法，其特征在于所述的超聲波的頻率為:25HZ、40HZ或59HZ。
5.如權(quán)利要求1所述的一種超聲波穿孔-激光光鑷細(xì)胞表面增強拉曼光譜分析方法，其特征在于所述的超聲池溫度為:室溫~60°C連續(xù)可調(diào)。
6.如權(quán)利要求1所述的一種超聲波穿孔-激光光鑷細(xì)胞表面增強拉曼光譜分析方法，其特征在于所述超聲時間為Imin~30min連續(xù)可調(diào)。
7.如權(quán)利要求1所述的一種超聲波穿孔-激光光鑷細(xì)胞表面增強拉曼光譜分析方法，其特征在于所述建立細(xì)胞表面增強拉曼光譜數(shù)據(jù)庫模型，其過程是: (1)通過定標(biāo)過程來建立診斷模型； (2)采集確診病例的細(xì)胞SERS光譜，建立定標(biāo)光譜數(shù)據(jù)庫； (3)使用主元素分析方法和線性判別分析算法，建立由細(xì)胞SERS光譜參數(shù)構(gòu)成的診斷方程； (4)利用具有顯著性差異的PCA得分畫出帶有診斷方程的散點圖，并且進一步利用線性判別分析得出統(tǒng)計結(jié)果。
8.如權(quán)利要求7所述的一種超聲波穿孔-激光光鑷細(xì)胞表面增強拉曼光譜分析方法，其特征在于所述的建立診斷方程是首先需對細(xì)胞SERS光譜進行扣熒光和強度歸一化處理，把整條譜線數(shù)據(jù)輸入SPSS軟件進行主成分分析，接著利用獨立變量T檢驗得到具有顯著性差異的PCA得分，并利用具有顯著性差異的PCA得分畫出帶有診斷方程的散點圖。
9.如權(quán)利要求1所述的一種超聲波穿孔-激光光鑷細(xì)胞表面增強拉曼光譜分析方法，其特征在于所述的利用已建立細(xì)胞表面增強拉曼光譜數(shù)據(jù)庫模型，對未診斷細(xì)胞進行判另O，其過程是:對未診斷細(xì)胞按照技術(shù)方案所述的方法制成所需的活性單細(xì)胞銀膠混合液，并在維持生理環(huán)境下對單細(xì)胞進行激光光鑷表面增強拉曼光譜檢測，將光譜導(dǎo)入已經(jīng)建立好的細(xì)胞表面增強拉曼光譜數(shù)據(jù)庫模型，利用多變量統(tǒng)計分析獲得未診斷細(xì)胞的表面增強拉曼光譜對應(yīng)的散點圖，根據(jù) 分布在散點圖中診斷方程兩邊的區(qū)域來判別細(xì)胞。
【文檔編號】G01N21/65GK103512874SQ201310432508
【公開日】2014年1月15日 申請日期:2013年9月22日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月22日
【發(fā)明者】馮尚源, 黃少華, 林居強, 陳冠楠, 黃祖芳, 李永增, 陳榮 申請人:福建師范大學(xué)