用于預測或早期診斷妊娠高血壓疾病的試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種用于預測或早期診斷妊娠高血壓疾病的試劑盒，所述試劑盒用于妊娠6周齡之后孕婦血漿、血清、尿液或胎盤中標志物的測定，所述標志物選自sMet、SerpinF2、睪酮、雌二醇中的至少一種。通過對大樣本進行驗證表明，即將患有子癇前期或具有極強子癇前期患病傾向性的人群在妊娠14周齡之后血漿中sMet水平極顯著低于正常孕婦，即將患有子癇前期或具有子癇前期患病傾向性人群在妊娠期血漿中SerpinF2或To/E2水平極顯著高于正常孕婦。該結(jié)果遠優(yōu)于目前被認為預測子癇前期或子癇前期傾向性前景最好的血管生成因子（如VEGF、PlGF）和抗血管生成因子（如sFlt-1和sEndoglin），有助于子癇前期的預測及診斷。
【專利說明】用于預測或早期診斷妊娠高血壓疾病的試劑盒
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種檢測試劑盒，具體地說，涉及一種用于預測或早期診斷妊娠高血壓疾病的試劑盒。
【背景技術】
[0002]子癇前期(preeclampsia)是一種以高血壓和蛋白尿為特征的妊娠期高血壓疾病。該疾病的發(fā)病率為孕婦人群的2-7%，是目前導致母嬰死亡的主要原因之一。子癇前期的典型臨床特征于孕20周之后，可通過血壓和尿液檢查高血壓和蛋白尿而得以發(fā)現(xiàn)。然而，這些臨床特征出現(xiàn)之前，孕婦及其所孕育的胎兒既已遭受了病理損害。因此，在子癇前期臨床特征出現(xiàn)之前的特異的早期診斷可使母嬰得到及時有效的處理，從而減少母嬰所受的風險。目前的各種常規(guī)檢查并不能作為子癇前期的早期診斷方法，臨床上缺乏一種能在孕早期(妊娠6-13周)或中期(妊娠14-26周)子癇前期癥狀出現(xiàn)之前，有效診斷預測子癇前期發(fā)病或發(fā)病傾向性的方法。子癇前的病因目前尚不清楚，但普遍認為胎盤在母體子宮內(nèi)植入過淺是該疾病的主要誘因之一。因此，目前普遍認為具有良好前景的子癇前期的預測分子，如PlGF和sFlt-Ι等，大多是對胎盤發(fā)育具有重要功能的激素、因子或相應的拮抗分子。
[0003]目前，血管生成因子(如VEGF、P1GF)和抗血管生成因子(如sFlt_l、sEndoglin)被普遍認為是預測子癇前期前景最好的分子。然而，這類分子對于人群中子癇前期患者檢測的靈敏性達不到臨床要求的標準，而且不能有效區(qū)別子癇前期和一些其它的產(chǎn)科疾病，如 IUGR0
[0004]C-Met是一種位于細胞膜上的受體酪氨酸激酶。C-Met的配體為肝細胞生長因子(HGF)，二者結(jié)合可促進細胞的增殖、遷移和侵潤。HGF/c-Met系統(tǒng)不僅對胎盤的發(fā)育和形成起作用，還對腎臟正常濾過功能的維持起著重要作用?？扇苄訫et(sMet)是成熟c_Met在細胞膜上被蛋白酶剪切下來的胞外片段。
[0005]SerpinF2是纖溶系統(tǒng)中纖溶酶(plasmin)的天然抑制劑,其高表達可抑制纖溶過程從而促進血栓累積。有證據(jù)表明，子癇前期胎盤中存在較高的纖維蛋白沉積，該現(xiàn)象可能會降低胎盤血流的供應，從而與子癇相關。
[0006]辜酮(To)和雌二醇(E2)是人體內(nèi)雄激素和雌激素的主要存在形式。在非孕婦女中，雌、雄激素主要由卵巢合成。在妊娠期，由于卵巢的功能被抑制，雌、雄激素主要由胎盤合成。
[0007]目前，已知孕婦外周血中可以檢測到一定水平的sMet、SerpinF2、辜酮和雌二醇等分子。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的是提供一種用于預測或早期診斷妊娠高血壓疾病的試劑盒，特別是一種用于子癇前期的預測和診斷的試劑盒。[0009]為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明首先提供用于預測或早期診斷妊娠高血壓疾病的標志物，所述標志物選自sMet、SerpinF2、辜酮、雌二醇中的至少一種。
[0010]優(yōu)選地，所述標志物為sMet，以及SerpinF2、辜酮或雌二醇中的至少一種。
[0011]更優(yōu)選地,所述標志物為sMet、SerpinF2、辜酮和雌二醇。
[0012]所述標志物應用于妊娠6周齡后孕婦血漿、血清、尿液或胎盤中相關標志物的測定。
[0013]所述標志物應用于妊娠14周齡后孕婦血漿、血清、尿液或胎盤中相關標志物的測定。
[0014]所述標志物用于胎盤中SerpinF2蛋白水平和/或基因水平的測定。
[0015]所述標志物用于胎盤中辜酮和雌二醇的測定。
[0016]本發(fā)明還提供一種用于預測或早期診斷妊娠高血壓疾病的試劑盒，所述試劑盒包括特異性結(jié)合sMet的抗體或檢測sMet的試劑。
[0017]前述試劑盒還包括特異性結(jié)合SerpinF2的抗體或檢測SerpinF2的試劑。
[0018]前述試劑盒還包括特異性結(jié)合辜酮的抗體或檢測辜酮的試劑。
[0019]前述試劑盒還包括特異性結(jié)合雌二醇的抗體或檢測雌二醇的試劑。
[0020]本發(fā)明中涉及的抗體可以是單克隆抗體或多克隆抗體，還可以為標記抗體。
[0021]本發(fā)明提供了在子癇前期癥狀出現(xiàn)前診斷預測子癇前期或子癇前期發(fā)病傾向性的方法及應用。
[0022]血漿中sMet在正常妊娠和不同的妊娠疾病情況下隨妊娠時間的變化如圖1所示。在妊娠14周后，患有重度子癇前期或慢高合并重度子癇前期(與子癇前期癥狀類似，但高血壓癥狀在孕前就已經(jīng)存在)的病例血漿sMet水平極顯著低于其他組別。所述sMet包括Met基因(GenBank ID:4233)經(jīng)轉(zhuǎn)錄和翻譯得到的多膚分子或添加一個或幾個氨基酸形成的具有同等抗原性的氨基酸序列，它們的編碼基因，以及與該多膚特異性結(jié)合的抗體。
[0023]血漿中SerpinF2在子癇前期和正常妊娠情況下隨妊娠時間的變化如圖2A所示。妊娠6周后，患有子癇前期的病例血漿SerpinF2水平極顯著高于正常妊娠者。子癇前期胎盤中SerpinF2蛋白和核酸表達升高的情況如圖2B所示。所述SerpinF2包括SerpinF2基因(GenBank ID:5345)經(jīng)轉(zhuǎn)錄和翻譯得到的多膚分子或添加一個或幾個氨基酸形成的具有同等抗原性的氨基酸序列，它們的編碼基因，以及與該多膚特異性結(jié)合的抗體。
[0024]子癇前期病例血漿中辜酮(To)在孕早期(11-14周)、中期(21-26周)的升高如圖3A和圖3B所示，而雌二醇(E2)在孕早期(11-14周)、中期(21-26周)的降低情況如圖4A和圖4B所示。所述To和E2包括相應的類固醇激素分子，以及與該分子特異性結(jié)合的抗體。
[0025]sMet、SerpinF2、辜酮、以及雌二醇在人類血漿、血清或尿液中的測定可采用常規(guī)的免疫分析方法，如ELISA、RIA等。其他方法，如比色法或色譜(包括氣相、液相)法,也可用于上述分子的測定。
[0026]Serp inF2在人類胎盤中的測定可采用常規(guī)的分子生物學方法，如蛋白印跡、RT-PCR、RT-rea ltime qPCR等。一些其他方法，如ELISA也可用于對上述分子的測定。
[0027]利用公式可以將2種或更多的預測指標綜合聯(lián)用，用于預測子癇前期。典型的(并不是所有的)公式為數(shù)學公式和算式。依據(jù)所用公式的不同，顯著高于或低于參照值被診斷為子癇前期。
[0028]sMet可以單獨用于診斷預測子癇前期或子癇前期發(fā)病傾向性，也可以與SerpinF2或To/E2相互聯(lián)用得到更加準確的子癇前期診斷結(jié)果。此外，達里描述的多種診斷方法也可以與其他的方法相互聯(lián)用，以得到更加準確的子癇前期或子癇診斷結(jié)果。
[0029]對sMet，或sMet與SerpinF2或To/E2的相互聯(lián)用，或sMet與其他的方法或SerpinF2或To/E2的相互聯(lián)用，可以在懷孕6周之后的I個或多個時間點獨立進行水平檢測，若相關水平檢測的總體結(jié)果與對照水平相比發(fā)生變化，則可診斷為相關對象患有子癇前期，或具有子癇前期患病傾向性。
[0030]本發(fā)明同時為診斷試劑盒的生產(chǎn)提供了依據(jù)。如果診斷試劑盒中包括sMet、或SerpinF2、或To、或E2的抗體，無論sMet、或SerpinF2、或To、或E2的抗體或多膚是否被標記，無論sMet、或SerpinF2、或To、或E2的抗體或多膚是否被底物結(jié)合，只要存在sMet、或SerpinF2、或To、或E2的抗體與相關多膚結(jié)合并通過相關標記測定含量，即可以對子癇前期作出診斷預測。常規(guī)的ELISA即通過抗體-底物間相互結(jié)合來檢測相應的分子或化合物，并可以作為試劑盒。
[0031]本發(fā)明首次提出即將患有重度子癇前期或具有極強重度子癇前期患病傾向性的人群在妊娠14周之后血漿中sMet水平極顯著低于正常人群和其他幾種妊娠疾病。即將患有子癇前期或具有子癇前期患病傾向性人群在妊娠期血漿中SerpinF2或To/E2水平極顯著高于正常人群。
[0032]對大樣本進行驗證，結(jié)果表明，血漿中sMet的水平可以極清楚地區(qū)別重度子癇前期和其他妊娠病例(如早產(chǎn)、妊娠糖尿病、FGR、妊娠高血壓、慢性高血壓或輕度子癇前期)及對照病例。在妊娠15-20周時，相關的靈敏性和特異性均大于0.95 ;在妊娠21-26周時，相關的靈敏性和特異性大于0.98。該結(jié)果遠優(yōu)于目前被認為預測子癇前期或子癇前期傾向性前景最好的血管生成因子(如VEGF、P1GF)和抗血管生成因子(如sFlt-l、sEndoglin)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0033]圖1顯示血漿中sMet水平隨孕周的變化；其中，O:重度子癇前期；1:正常對照；2:早產(chǎn)；3:妊娠糖尿??；4:新生兒體重過低；5:
[0034]輕度子癇前期；6:妊娠高血壓；7:慢性高血壓；8:輕度慢高合并子癇前期；9:重度慢高合并子癇前期。
[0035]圖2為SerpinF2在子癇前期患者和正常妊娠者中的變化；其中，A圖顯示子癇前期和正常妊娠在妊娠期內(nèi)血漿PAP(SerpinF2-纖溶酶復合物)水平的變化，*表示與對照組相比P < 0.05 表示與對照組相比P < 0.01 ；B圖顯示SerpinF2 mRNA在子癇前期患者和正常妊娠孕婦胎盤中的表達(誤差線表示標準差);C圖顯示SerpinF2蛋白在子癇前期患者和正常妊娠孕婦胎盤中的表達。*表示與對照組相比P < 0.05。
[0036]圖3為正常妊娠和子癇前期血漿中辜酮(To)在孕早、中和晚期的水平；其中，A圖顯示孕早期(11-14周)血漿中辜酮的水平；B圖顯示孕中期(21-26周)血漿中辜酮的水平；C圖顯示孕晚期(27-34周)血衆(zhòng)中辜酮的水平。*表示與對照組相比P < 0.05 表示與對照組相Kp < 0.01。
[0037]圖4為正常妊娠和子癇前期血漿中雌二醇(E2)在孕早、中和晚期的水平；其中，A圖顯示孕早期(11-14周)血漿中雌二醇的水平；B圖顯示孕中期(21-26周)血漿中雌二醇的水平；C圖顯示孕晚期(27-34周)血漿中雌二醇的水平。*表示與對照組相比P < 0.05 ;**表示與對照組相比P < 0.01。
[0038]圖5為每個病例sMet水平隨孕周變化的折線圖；其中，A圖顯示正常對照、早產(chǎn)、妊娠糖尿病以及新生兒體重過低的病例與重度子癇前期病例之間的差別；B圖顯示輕度子癇前期、妊娠高血壓、慢性高血壓、慢高合并輕度子癇前期以及慢高合并重度子癇前期病例與重度子癇前期病例之間的差別。O:重度子癇前期；1:正常對照；2:早產(chǎn)；3:妊娠糖尿??；4:新生兒體重過低5:輕度子癇前期；6:妊娠高血壓；7:慢性高血壓；8:慢高合并輕度子癇前期；9:慢高合并重度子癇前期。
[0039]圖6為妊娠15-26周的最佳截斷點及其對重度子癇前期的分辨力；其中，A圖表示妊娠15-20以及21-26周的最佳截斷點在總體sMet水平中的位置；B圖表示妊娠15-20周時最佳截斷點(284.5ng/mL)對重度子癇前期的具體分辨效果；C圖表示妊娠21-26周時最佳截斷點(295.6ng/mL)對重度子癇前期的具體分辨效果。
[0040]圖7為驗證隊列中血漿sMet水平對重度子癇前期的分辨效果；其中，A圖表示驗證隊列中正常病例和重度子癇前期病例的血漿sMet的平均水平，誤差線表示平均標準誤(SEM) ；B圖為用散點圖顯示重度子癇前期病例的血漿sMet水平與正常病例的血漿sMet水平的重疊度；C圖為分辨重度子癇前期病例和對照病例的ROC曲線及其AUC值；D圖表示在訓練隊列中妊娠15-20周時最佳截斷點(284.5ng/mL)對驗證隊列中重度子癇前期的具體分辨效果。
[0041]圖8為正常妊娠和子癇前期血漿中辜酮和雌二醇的比率(To/E2)在孕早、中和晚期的水平；其中，A圖顯示孕早期(11-14周)血漿中To/E2的水平；B圖顯示孕中期(21-26周)血漿中To/E2的水平；C圖顯示孕晚期(27-34周)血漿中To/E2的水平。*表示與對照組相比P < 0.05 表示與對照組相比P < 0.01。
[0042]圖9為血漿中辜酮和雌二醇的比率(To/E2)對重度子癇前期和正常妊娠的分辨效果，以為ROC曲線及其AUC值表示；其中，A圖顯示孕早期(11-14周)；B圖顯示孕中期(21-26周)；C圖顯示孕晚期(27-34周)。
【具體實施方式】
[0043]以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。
[0044]實施例1 sMet在預測或早期診斷妊娠高血壓疾病中的應用
[0045]1、實驗設計
[0046]該實驗可分為訓練-驗證(training-validation) 2個部分。訓練研究的隊列包括3336名中國漢族妊娠婦女。對這些孕婦在妊娠6-10、11-14、15-20、21_26、27_34周以及> 34周時血漿中sMet水平進行了測定。驗證研究隊列包括62名正常妊娠的中國漢族婦女，及62名患有子癇前期的中國漢族婦女。對這些孕婦在妊娠14-20周時血漿中sMet的水平進行了測定。
[0047]該研究得到了中國科學院動物研究所道德委員會、北京大學第三附屬醫(yī)院道德委員會、北京大學第一附屬醫(yī)院道德委員會以及北京密云醫(yī)院道德委員會的批準。參與研究的病人簽署了知情同意書。
[0048]2、實驗所涉及的病人和樣本
[0049]訓練研究所涉及的前瞻性隊列未自于2009年6月至2010年12月北京大學第三醫(yī)院產(chǎn)前定期保健人群。該人群共包括3336例孕婦，其中194例多胎妊娠，5例的年齡小于18歲或大于45歲，23例于妊娠28周前分娩，784例患有與高血壓無關的其他疾病。以上病例均被排除于本次研究之外。在余下的2330個病例中，1911例為正常妊娠，78例為重度子癇前期，77例為輕度子癇前期，102例為早產(chǎn),21例為妊娠期糖尿病，11例為胎兒生長受限，32例為妊娠期高血壓，41例為慢性高血壓，57例為慢高合并子癇前期。本人群中的孕婦均在妊娠6-10、11-14、15-20,21-26,27-34周以及> 34周時收集2mL外周血并獲得血漿。所收獲的血漿均在取血后12小時內(nèi)保存于_80°C條件下。
[0050]驗證研究所涉及的前瞻性隊列來自于2009年7月至2011年9月北京大學第一醫(yī)院和北京密云醫(yī)院進行唐氏篩查的孕婦人群。該人群包括2455名孕婦，所有孕婦的血液樣品均于妊娠14-20周獲得。所收獲的血漿均在取血后12小時內(nèi)保存于-80°C條件下。在這些孕婦中隨機選取了 62例正常妊娠對照和62例重度子癇前期病例進行sMet檢測。
[0051]孕期綜合征的定義按照Williams產(chǎn)科學(23版)和國際妊娠高血壓學會的界定進行?；加心I病或胎兒染色體異常的病例不在本研究的范疇內(nèi)。正常妊娠病例定義為妊娠前身體健康，孕期無明顯癥狀表現(xiàn)，妊娠37周后分娩，且新生兒體重正常的病例。重度子癇前期指沒有慢性高血壓病史，但在妊娠期20周后2次獨立檢查中均出現(xiàn)收縮壓>16OmmHg或舒張壓> IlOmmHg ;并伴隨有明顯蛋白尿(> 2g/24h或2次間隔大于4小時獨立試紙條測定為3+)。輕度子癇前期指在妊娠期20周后2次獨立檢查中均出現(xiàn)收縮壓在140-160mmHg之間或舒張壓在90_1 IOmmHg之間，并伴隨有300mg_2g/24h或2次間隔大于4小時獨立試紙條測定為2+的蛋白尿。早發(fā)和遲發(fā)的子癇前期的界定主要依據(jù)子癇前期的臨床癥狀是否在妊娠34周之前出現(xiàn)。妊娠高血壓定義為妊娠20周后出現(xiàn)的血壓高于140/90mmHg，但并不伴隨有蛋白尿。慢性高血壓指妊娠前即患有且持續(xù)至妊娠的高血壓。慢高合并子癇前期指慢性高血壓和子癇前期的合并癥，也可以進一步按照蛋白尿是否>2g/24h分為重度和輕度兩組。早產(chǎn)定義為早于37周的分娩。胎兒生長受限定義為新生兒出生體重小于對應周齡的第10百分位。妊娠糖尿病定義為未妊娠時血糖正常，而孕期出現(xiàn)高血糖的狀況，但不伴隨有高血壓。所有早產(chǎn)和胎兒生長受限的病例均不伴隨有高血壓或糖尿病。
[0052]3、血漿中sMet水平的測量
[0053]血漿中sMet的水平采用ELISA方法測量，所有操作均按照R&D公司生產(chǎn)的ELISA檢測試劑說明書進行。測量人員事先并不知道所測樣本的具體情況。所有的樣品均作復?L，并根據(jù)樣品和標準品在450nm波長下的吸光值計算樣品濃度。ELISA測定共重復3次，最終的結(jié)果為3次實驗的平均值。
[0054]4、數(shù)學統(tǒng)計
[0055]進行數(shù)學統(tǒng)計的人員不參與sMet的測定過程。Mann-Whitney U檢測用于分析正常妊娠組與以下病例組間sMet水平的差異，如早產(chǎn)、妊娠糖尿病、胎兒生長受限、妊娠高血壓、慢性高血壓、慢高合并輕度子癇前期、慢高合并重度子癇前期、輕度子癇前期、以及重度子癇前期。所有的檢驗都是雙尾檢驗，且P <0.05認為差異顯著。ROC分析用于檢驗血漿sMet水平對子癇前期的預測價值。ROC曲線以每一個測量得到的sMet水平為一個截斷點，通過連續(xù)計算出相應的1-特異性和敏感性，并描點作圖而成。最佳截斷點定義為特異性和敏感性之和最大的數(shù)值。所有的分析采用R軟件包完成。
[0056]5、妊娠病例特征總結(jié)
[0057]相關病例的臨床特征情況詳見表I和表2。
[0058]在訓練人群中，并發(fā)高血壓的病例組，包括妊娠高血壓、慢性高血壓、慢高合并輕度子癇前期、慢高合并重度子癇前期、輕度子癇前期和重度子癇前期，其收縮壓和舒張壓與對照相比極顯著升高。尿蛋白僅在并發(fā)有子癇前期的病例中檢測到，包括慢高合并輕度子癇前期、慢高合并重度子癇前期、輕度子癇前期和重度子癇前期。正常妊娠組的妊娠時間顯著長于具有合并癥的病例。除妊娠糖尿病病例和妊娠高血壓病例外，其他具有合并癥的病例組新生兒出生體重均小于正常妊娠者。糖耐量在組間沒有顯著變化。
[0059]在驗證人群中，重度子癇前期病例較正常妊娠者表現(xiàn)出顯著增高的血壓、蛋白尿水平、身高-體重指數(shù)(BMI)以及低的新生兒出生體重。
[0060]6、訓練實驗-妊娠過程中血漿sMet水平的變化
[0061]進行訓練實驗的樣本來自前述條款2的隊列中隨機選擇的120例正常妊娠，以及所有的早產(chǎn)、妊娠糖尿病、胎兒生長受限、妊娠高血壓、慢性高血壓、慢高合并輕度子癇前期、慢高合并重度子癇前期、輕度子癇前期以及重度子癇前期病例。每個病例在妊娠6-10、11-14,15-20,21-26,27-34,以及> 34周時的血漿均進行sMet水平測量。結(jié)果如圖1所示，在正常妊娠者中，血漿sMet平均水平于妊娠6-10周時高達566ng/mL，隨著妊娠進程，血漿sMet水平會逐漸降低，至妊娠15-20周時降低至343ng/mL ;但在妊娠21-26周時,血衆(zhòng)sMet水平有一明顯高峰，達到460ng/mL ;在隨后的妊娠期內(nèi)又逐漸降低，分娩前降至280ng/mL。早產(chǎn)、妊娠糖尿病、胎兒生長受限、妊娠高血壓、慢性高血壓、慢高合并輕度子癇前期、以及輕度子癇前期患者血漿sMet水平的變化趨勢與正常妊娠類似(圖1)。值得注意的是，重度子癇前期以及慢高合并重度子癇前期的病例中，血漿sMet水平自妊娠6-10周直至分娩呈現(xiàn)持續(xù)降低模式，在妊娠21-26周也沒有出現(xiàn)類似正常妊娠組的高峰。從孕11-14周開始直至分娩，重度子癇前期以及慢高合并重度子癇前期的病例中血漿sMet水平一直顯著低于正常妊娠及其他各個病例組。
[0062]為了更好地描述各種妊娠期合并癥中sMet水平的變化情況，本發(fā)明匯總制作了每個病例sMet水平隨孕周變化的折線圖，如圖4所示。所有的78例重度子癇前期病例和18例慢高合并重度子癇前期病例中，sMet水平均一地表現(xiàn)為隨妊娠時間加長而逐漸下降，并且在妊娠20-27周時較正常妊娠、早產(chǎn)、妊娠糖尿病、胎兒生長受限、妊娠高血壓、慢性高血壓、慢高合并輕度子癇前期和輕度子癇前期均有明顯的降低，呈現(xiàn)一個極明顯的間隔(圖5)，提示在這個時間段內(nèi)血漿sMet水平可能對重度子癇前期和慢高合并重度子癇前期具有很好的診斷預測價值。
[0063]7、ROC分析sMet與重度子癇前期發(fā)病傾向性的關系
[0064]本發(fā)明進而利用ROC分析，檢測sMet對重度子癇前期的預測和診斷能力。如表3所示，從AUC值可以看出，妊娠15周之后，血漿sMet水平能有效區(qū)分重度子癇前期以及慢高合并重度子癇前期與其他各種妊娠狀況，包括正常妊娠和早產(chǎn)、妊娠糖尿病、胎兒生長受限、妊娠高血壓、慢性高血壓、輕度子癇前期、慢高合并輕度子癇前期等。在妊娠15-20周、21-26周和27-34周時，所有區(qū)別重度子癇前期與其他組別(除去慢高合并重度子癇前期)的AUC值均大于0.95。尤其值得注意的是，在妊娠21-26周時，區(qū)別重度子癇前期和其他所有組別(除去慢高合并重度子癇前期)的AUC值均達到理想值1.00，區(qū)別重度子癇前期和慢高合并輕度子癇前期的AUC值高達0.98。這些結(jié)果說明妊娠早中期血漿sMet水平對重度子癇前期有極強的分辨能力，在妊娠21-26周齡時甚至具備準確的診斷能力。[0065]為進一步探索用于診斷重度子癇前期的血漿sMet的參考閾值，將正常妊娠、早產(chǎn)、妊娠糖尿病、胎兒生長受限、妊娠高血壓、慢性高血壓、慢高合并輕度子癇前期、以及輕度子癇前期等各組病例合并為一組，稱為“非重度子癇前期組”;將重度子癇前期和慢高合并重度子癇前期合并為一組，稱為“重度子癇前期組”。對這兩組之間進行ROC分析，確定在妊娠21-26周時sMet水平的最佳截斷點為295.6ng/ml，此時預測“重度子癇前期”的敏感性、特異性、陽性預測值、陰性預測值以及AUC分別為1.00,0.995,0.980、1.00和0.998 ;在妊娠15-20周時sMet水平的最佳截斷點為284.5ng/mL，此時預測“重度子癇前期”的敏感性、特異性、陽性預測值、陰性預測值以及AUC分別為0.948,0.935,0.798,0.988和0.980。如圖6所示，妊娠15-20周時若以最佳截斷點284.5ng/mL做分割，此時的預測準確率為0.937 ;在539例病例中，出現(xiàn)了 29例(5.3%)假陽性診斷和5例(0.92%)假陰性診斷；妊娠15-20周時若以最佳截斷點295.6ng/mL做分割，此時的預測準確率為0.996 ;在539例病例中，僅出現(xiàn)2例(0.37%)假陽性診斷且沒有假陰性診斷。這些結(jié)果有力地證明了血漿中sMet水平在妊娠15周時即具有極好預測潛力，在妊娠21-26周時則具有優(yōu)越的診斷潛力。
[0066]8、驗證實驗-在獨立隊列中檢測血漿sMet水平對重度子癇前期的預測潛力
[0067]本發(fā)明在北京大學第一醫(yī)院和北京密云醫(yī)院選取了一個獨立于訓練隊列的驗證隊列，其病例的血漿樣本收集于妊娠14-20周。在該隊列中，按照病例-對照分析法，隨機選取了 62例正常妊娠和62例重度子癇前期病例，進行血漿sMet水平測定。
[0068]與預期相符，重度子癇前期病例的血漿sMet平均水平為215.74ng/mL,顯著低于正常妊娠的320.87ng/mL(圖7A);散點圖顯示血漿sMet水平在重度子癇前期病例的與正常妊娠組間有較小的重疊度(圖7B) ;R0C分析顯示，區(qū)別重度子癇前期和正常妊娠組的AUC值達到0.986 (圖7C);當應用訓練研究中總結(jié)出來的最佳截斷點284.5ng/mL做分割時，存在11例(8.87%)假陽性病例和I例(0.81%)假陰性病例(圖7D)，其預測的準確率為
0.903。上述結(jié)果能夠很好地對應于訓練隊列中在15-20周得到的結(jié)果。
[0069]實施例2 SerpinF2在預測或早期診斷妊娠高血壓疾病中的應用
[0070]1、病例的選擇和血漿樣本收集
[0071]本研究采用前瞻性巢式病例-對照研究，研究方案得到中國科學院動物研究所和北京大學第一醫(yī)院道德倫理委員會的批準。研究對象為2005年11月到2007年12月在北京大學第一醫(yī)院進行產(chǎn)前保健的孕婦，分別于妊娠不同階段收集孕婦外周血，待分娩后根據(jù)妊娠結(jié)局將受試者分為正常妊娠組和重度子癇前期組。入選的研究對象均排除慢性高血壓、糖尿病、腎病病史、雙胎、肝炎、腫瘤等疾病和病史；正常妊娠的界定標準為:妊娠前各項指標正常，妊娠期未發(fā)生高血壓、蛋白尿等子癇前期的臨床指征和其它妊娠疾病；重度子癇前期的界定按照國際妊娠高血壓學會的制定的標準:妊娠前無高血壓、蛋白尿病史，妊娠20周后收縮壓≥16OmmHg和/或舒張壓110≥mmHg,伴隨24小時蛋白尿≥2g或定性為++以上。在妊娠8-14周、15-18周、19-24周、25-31周、32-36周以及36-40周分別采集上述研究對象外周靜脈血2ml，EDTA抗凝，4°C放置2_3小時后4000rpm離心20分鐘，收集上清即為血漿。血漿分裝為250 μ L每管，_80°C儲存待用。
[0072]2、血漿中SerpinF2含量的ELISA分析
[0073]血衆(zhòng)中SerpinF2通常與纖溶酶Plasmin結(jié)合成為復合物PAP,并且與Plasmin結(jié)合的SerpinF2是其功能性組分，因而PAP復合物濃度反映了 SerpinF2的濃度。PAP濃度采用人PAP ELISA試劑盒(購自武漢EIAab Science公司)測定。具體操作步驟按照試劑盒說明進行。酶標儀測定波長為450nm。
[0074]3、妊娠過程中血漿PAP濃度的變化
[0075]重度子癇前期病例和正常妊娠者不同階段血漿中PAP的ELISA測定結(jié)果如圖2所示。正常妊娠過程中，血漿PAP水平隨妊娠進程而逐漸升高，妊娠6-14周平均濃度約為0.1 μ g/mL,至妊娠15-18周迅速升高至0.59 μ g/mL,隨后呈現(xiàn)緩慢上升趨勢，分娩前(36-40周)達到峰值，約為1.0 μ g/mL。重度子癇前期組血漿PAP水平隨妊娠周齡的變化模式與正常妊娠組相似，但在各個妊娠階段其濃度遠遠高于相應的正常對照，妊娠6-14周、15-18周、19-24周、25-31周、32-35周和36-40周的水平分別為相應對照組的9.24倍、2.95倍、2.38 倍、2.32 倍、1.95 倍和 1.97 倍(圖 2A)。
[0076]對血漿PAP濃度進行ROC分析，通過計算妊娠各階段AUC、準確度、靈敏度、最佳截斷值(cut-off value)等指標,判定血衆(zhòng)PAP水平對子癇前期的預測價值(表4)。結(jié)果表明血漿PAP水平是預測重度子癇前期的理想指標，在妊娠各個階段都有較好的預測價值，尤其在妊娠6-14周和15-18周其預測價值更高，AUC值分別達到0.937和0.804，最佳截斷值分別為 0.117 μ g/mL 和 1.04 μ g/mL。
[0077]4、子癇前期胎盤中SerpinF2蛋白及核酸的表達
[0078]選取重度子癇前期和分娩周齡匹配的正常妊娠胎盤各12例，分別用實時定量PCR法和蛋白質(zhì)印跡法檢測SerpinF2基因的核酸水平和所編碼的蛋白水平。結(jié)果如圖2B、2C所示，重度子癇前期胎盤中SerpinF2的核酸水平達到正常胎盤的約2倍，蛋白水平為正常胎盤中的約2.4倍。
[0079]實施例3辜酮和雌二醇在預測或早期診斷妊娠高血壓疾病中的應用
[0080]1、實驗所涉及的病例和樣本
[0081]研究所涉及的前瞻性隊列來自于2009年6月至2010年12月北京大學第三醫(yī)院產(chǎn)前定期保健人群。該人群共包括3336例孕婦，其中194例多胎妊娠，5例的年齡小于18歲或大于45歲，23例于妊娠28周前分娩，784例患有與高血壓無關的其他疾病。以上病例均被排除于本次研究之外。在余下的2330個病例中，1911例為正常妊娠，78例為重度子癇前期，其余為其他妊娠合并癥。本人群中的病例均在妊娠6-10、11-14、15-20、21-26、27-34周以及> 34周時采集2mL外周血并獲得血漿。所采集的血漿均在取血后12小時內(nèi)保存于-80°C條件下。
[0082]2、血漿中辜酮(To)和雌二醇(E2)含量的測定:
[0083]隨機選取40例正常妊娠和40例重度子癇前期病例，取其妊娠11-14周、21_26周和27-34周的血漿樣本，進行辜酮(To)和雌二醇(E2)含量的測定。采用Immulite2000化學發(fā)光免疫分析儀(購自德國Siemens公司)進行全自動檢測。測定雌二醇時用雌激素稀釋液(購自德國Siemens公司)將血漿稀釋20倍，測定辜酮時用生理鹽水將血漿稀釋4倍。具體操作步驟按照Immulite2000化學發(fā)光免疫分析系統(tǒng)的說明進行。
[0084]3、妊娠不同階段血漿辜酮(To)和雌二醇(E2)濃度的變化
[0085]重度子癇前期病例和正常妊娠者不同階段血漿中辜酮和雌二醇的測定結(jié)果如圖3和圖4所示。無論是在妊娠早期(11-14周)、中期(21-26周)、或晚期(27-34周)，子癇前期病例組的血漿辜酮水平較正常妊娠者均有顯著上升(圖3)，而血漿雌二醇則有顯著下降(圖4)。辜酮與雌二醇的比值(To/E2)在重度子癇前期病例和正常妊娠者之間具有更小的重疊度(圖8)，說明該指標具有更好的區(qū)別重度子癇前期病例和正常妊娠者的能力。
[0086]對血漿To/E2繪制ROC曲線，通過計算妊娠各階段AUC值，判定血漿To/E2水平對子癇前期的預測價值(圖9)。結(jié)果表明血漿To/E2水平對于預測重度子癇前期具有一定價值，在妊娠21-26周和27-34周時AUC值分別為0.749和0.779 (圖9B、9C)，可作為預測或診斷重度子癇前期的一個有力輔助指標。
[0087]雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎上，可以對之作一些修改或改進，達對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。
[0088]
【權利要求】
1.用于預測或早期診斷妊娠高血壓疾病的標志物，其特征在于，所述標志物選自sMet、SerpinF2、睪酮、雌二醇中的至少一種。
2.根據(jù)權利要求1所述的標志物，其特征在于，所述標志物為sMet，以及SerpinF2、睪酮、雌二醇中的至少一種。
3.根據(jù)權利要求2所述的標志物，其特征在于，所述標志物為sMet、SerpinF2、睪酮和雌二醇。
4.根據(jù)權利要求1-3任一項所述的標志物，其特征在于，所述標志物用于妊娠6周齡后孕婦血漿、血清、尿液或胎盤中sMet、SerpinF2、睪酮和/或雌二醇的測定。
5.根據(jù)權利要求1-3任一項所述的標志物，其特征在于，所述標志物用于妊娠14周齡后孕婦血漿、血清、尿液或胎盤中sMet、SerpinF2、睪酮和/或雌二醇的測定。
6.根據(jù)權利要求1-3任一項所述的標志物，其特征在于，所述標志物用于胎盤中SerpinF2蛋白水平和/或基因水平的測定。
7.根據(jù)權利要求1-3任一項所述的標志物，其特征在于，所述標志物用于胎盤中睪酮和雌二醇的測定。
8.用于預測或早期診斷妊娠高血壓疾病的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括特異性結(jié)合sMet、SerpinF2、睪酮和/或雌二醇的抗體,或者檢測sMet、SerpinF2、睪酮和/或雌二醇的試劑。
9.根據(jù)權利要求8所述的試劑盒，其特征在于，所述抗體為單克隆抗體或多克隆抗體。
10.根據(jù)權利要求8所述的試劑盒，其特征在于，所述抗體為標記抗體。
【文檔編號】G01N33/74GK103513042SQ201310436215
【公開日】2014年1月15日 申請日期:2013年9月23日 優(yōu)先權日:2013年9月23日
【發(fā)明者】王雁玲, 劉明, 李玉俠, 吉蕾 申請人:中國科學院動物研究所