一種檢測cyp2c19基因多態(tài)性的試劑盒及方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種檢測CYP2C19基因多態(tài)性的試劑盒及方法，屬于熒光定量PCR領域。所述試劑盒包括檢測用引物以及熒光探針，即包括：CYP2C19基因CYP2C19*2多態(tài)性的特異性引物及特異性Taqman熒光探針、CYP2C19基因CYP2C19*3多態(tài)性的特異性引物及特異性Taqman熒光探針和CYP2C19基因CYP2C19*17多態(tài)性的特異性引物及特異性Taqman熒光探針中的至少一組，采用該試劑盒檢測CYP2C19基因，其敏感度及特異性均顯著提高，檢測時間短，有利于預測藥物劑量。
【專利說明】—種檢測CYP2C19基因多態(tài)性的試劑盒及方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及熒光定量PCR領域，具體涉及一種檢測CYP2C19基因多態(tài)性的試劑盒及方法。
【背景技術】
[0002]CYP2C19基因是一種重要的藥物代謝酶，其對藥物反應起著關鍵性的作用，這是因為CYP2C19基因的活性存在顯著的個體差異，表現為遺傳多態(tài)性，從而產生血藥濃度的個體差異，研究其遺傳多態(tài)性將為臨床確定最佳治療劑量、制定合理用藥方案、發(fā)揮最大療效、避免和減少不良反應提供指導依據。
[0003]在CYP2C19基因中，CYP2C19基因的CYP2C19*2多態(tài)性和CYP2C19*3多態(tài)性在我國人群中的分布頻率分別為39.9%和6.1%，導致CYP2C19編碼的蛋白質活性喪失，使得藥物代謝障礙，引發(fā)藥物蓄積性中毒，而CYP2C19基因的CYP2C19*17多態(tài)性在我國人群中的分布頻率為0.7%，其導致CYP2C19基因編碼的蛋白質活性增加，加速了藥物代謝，使得藥物在體內代謝過快，降低了藥物的治療效果，CYP2C19基因多態(tài)性具體詳見CYP等位基因數據庫(http://www.cypalleles.k1.Se)。
[0004]現有技術中一般采用直接測序或定性PCR (Polymerase Chain Reaction,聚合酶鏈式反應)檢測技術檢測CYP2C19基因C YP2C19*2多態(tài)性、CYP2C19*3多態(tài)性和CYP2C19*17
多態(tài)性。
[0005]研究發(fā)現，采用直接測序或定性PCR技術檢測CYP2C19基因CYP2C19*2多態(tài)性、CYP2C19*3多態(tài)性和CYP2C19*17多態(tài)性，其檢測的靈敏度和特異性均不高，所以，不能準確的檢測出CYP2C19基因CYP2C19*2多態(tài)性、CYP2C19*3多態(tài)性和CYP2C19*17多態(tài)性，這樣不利于預測藥物療效及指導藥物的選擇性用藥。另外，檢測時間過長，一般需要48個小時以上，使該檢測的效率降低，因此，為檢測CYP2C19基因多態(tài)性帶來不便。

【發(fā)明內容】

[0006]針對現有技術中檢測CYP2C19基因CYP2C19*2、CYP2C19*3和CYP2C19*17多態(tài)性的靈敏度和特異性均不高、而且檢測時間長等問題，本發(fā)明的目的在于提供一種檢測CYP2C19基因多態(tài)性的試劑盒。
[0007]本發(fā)明的另一目的在于提供一種檢測CYP2C19基因多態(tài)性的方法。
[0008]為了解決現有技術檢測CYP2C19 基因 CYP2C19*2、CYP2C19*3 和 CYP2C19*17 多態(tài)性的靈敏度和特異性均不高、而且檢測時間長等問題，本發(fā)明采用了以下技術方案:
[0009]一種檢測CYP2C19基因多態(tài)性的試劑盒，包括檢測用引物以及檢測用熒光探針，所述檢測用引物以及檢測用熒光探針包括:CYP2C19基因CYP2C19*2多態(tài)性的特異性上下游引物及所述CYP2C19基因CYP2C19*2多態(tài)性的特異性Taqman熒光探針、CYP2C19基因CYP2C19*3多態(tài)性的特異性上下游引物及所述CYP2C19基因CYP2C19*3多態(tài)性的特異性Taqman熒光探針、和CYP2C19基因CYP2C19*17多態(tài)性的特異性上下游引物及所述CYP2C19基因CYP2C19*17多態(tài)性的特異性Taqman熒光探針中的至少一組，其中:
[0010]所述CYP2C19基因CYP2C19*2多態(tài)性的特異性上游引物序列如序列表中SEQ IDNO:1所示；
[0011]所述CYP2C19基因CYP2C19*2多態(tài)性的特異性下游引物序列如序列表中SEQ IDN0:2所示；
[0012]所述CYP2C19基因CYP2C19*2多態(tài)性的特異性Taqman熒光探針的堿基序列如序列表中SEQ ID NO:3所示；
[0013]所述CYP2C19基因CYP2C19*3多態(tài)性的特異性上游引物序列如序列表中SEQ IDNO:4所示；
[0014]所述CYP2C19基因CYP2C19*3多態(tài)性的特異性下游引物序列如序列表中SEQ IDN0:5所示；
[0015]所述CYP2C19基因CYP2C19*3多態(tài)性的特異性Taqman熒光探針的堿基序列如序列表中SEQ ID NO:6所示；
[0016]所述CYP2C19基因CYP2C19*17多態(tài)性的特異性上游引物序列如序列表中SEQ IDN0:7所示；
[0017]所述CYP2C19基因CYP2C19*17多態(tài)性的特異性下游引物序列如序列表中SEQ IDNO:8所示；
[0018]所述CYP2C19基因CYP2C19*17多態(tài)性的特異性Taqman熒光探針的堿基序列如序列表中SEQ ID NO:9所示。
[0019]在上述試劑盒中，作為一種優(yōu)選實施方式，所述試劑盒還包括內參基因GPADH、所述內參基因GAPDH的上下游引物及所述內參基因GAPDH的Taqman熒光探針，其中，
[0020]所述內參基因GAPDH的上游引物序列如序列表中SEQ ID NO: 10所示；
[0021]所述內參基因GAPDH的下游引物序列如序列表中SEQ ID NO: 11所示；
[0022]所述內參基因GAPDH的Taqman突光探針的喊基序列如序列表中SEQ ID NO: 12所示；
[0023]所述內參基因GAPDH的序列如序列表中SEQ ID NO: 13所示。
[0024]在上述試劑盒中，作為一種優(yōu)選實施方式，所述CYP2C19基因CYP2C19*2多態(tài)性的特異性Taqman熒光探針、所述CYP2C19基因CYP2C19*3多態(tài)性的特異性Taqman熒光探針、所述CYP2C19基因CYP2C19*17多態(tài)性特異性Taqman熒光探針和所述內參基GAPDH的Taqman熒光探針的5’端均連接有熒光報告基團FAM，3’端均連接有熒光淬滅基團TAMRA-MGBο
[0025]在上述試劑盒中，作為一種優(yōu)選實施方式，所述試劑盒還包括各種熒光定量PCR反應試劑或者各種熒光定量PCR反應試劑的混合物，優(yōu)選地，所述各種熒光定量PCR反應試劑包括PCR預混合液、Mg2+ (比如氯化鎂)、dNTPs、dUTP、Taq酶、UNG酶和無RNase去離子水。
[0026]在上述試劑盒中，作為一種優(yōu)選實施方式，所述試劑盒還包括內部陽性控制序列、內部陽性控制序列的上下游引物和Taqman熒光探針，其中:
[0027]所述內部陽性控制序列如序列表中SEQ ID NO: 14所示；
[0028]所述內部陽性控制序列的上游引物如序列表中SEQ ID NO: 15所示；
[0029]所述內部陽性控制序列的下游引物如序列表中SEQ ID NO: 16所示；[0030]所述內部陽性控制序列的Taqman熒光探針的堿基序列如序列表中SEQ ID NO: 17所示。更優(yōu)選地，所述內部陽性控制序列的Taqman熒光探針的5’端連接有熒光報告基團TET，3’端連接有熒光淬滅基團TAMRA。
[0031]在上述試劑盒中，作為一種優(yōu)選實施方式，所述試劑盒還包括陽性對照和陰性對照，其中，所述陰性對照為去離子水；所述陽性對照為同時含有所述CYP2C19基因CYP2C19*2多態(tài)性、所述CYP2C19基因CYP2C19*3多態(tài)性和所述CYP2C19基因CYP2C19*17多態(tài)性的基因組DNA樣品。
[0032]一種檢測CYP2C19基因多態(tài)性的方法，采用熒光定量PCR法，包括如下步驟:
[0033]步驟一，提取受檢者基因組DNA ；
[0034]步驟二，以稀釋成不同濃度的如序列表中SEQ ID NO: 13所示的內參基因GAPDH標準品為模板，采用如序列表中SEQ ID NO: 10所示的上游引物、如序列表中SEQ ID NO: 11所示的下游引物和如序列表中SEQ ID NO: 12所示的Taqman熒光探針進行熒光定量PCR反應以制作內參基因GAPDH標準品的標準曲線；
[0035]步驟三，以步驟一得到的基因組DNA為模板，采用如序列表中SEQ ID NO:1所示的上游引物、如序列表中SEQ ID N0:2所示的下游引物和如序列表中SEQ ID N0:3所示的Taqman熒光探針，對CYP2C19基因CYP2C19*2多態(tài)性進行熒光定量PCR擴增；以步驟一得到的基因組DNA為模板，采用如序列表中SEQ ID N0:4所示的上游引物、如序列表中SEQ IDN0:5所示的下游引物和如序列表中SEQ ID勵:6所示的了&9!11&11熒光探針，對0￥?2(:19基因CYP2C19*3多態(tài)性進行熒光定量PCR擴增；以步驟一得到的基因組DNA為模板，采用如序列表中SEQ ID N0:7所示的上游引物、如序列表中SEQ ID NO:8所示的下游引物和如序列表中SEQ ID NO:9所示的Taqman熒光探針，對CYP2C19基因CYP2C19*17多態(tài)性進行熒光定量PCR擴增；其中所述步驟三中的熒光定量PCR擴增的反應條件與步驟二的熒光定量PCR反應條件相同；
`[0036]步驟四，數據收集處理和分析。
[0037]在上述方法中，作為一種優(yōu)選實施方式，在所述步驟二和所述步驟三中，所述熒光定量PCR反應中均加入了如序列表中SEQ ID N0:14所示的內部陽性控制序列、如序列表中SEQ ID NO: 15所示的內部陽性控制序列的上游引物、如序列表中SEQ ID NO: 16所示的內部陽性控制序列的下游引物以及如序列表中SEQ ID NO: 16所示的內部陽性控制序列的Taqman突光探針。
[0038]在上述方法中，作為一種優(yōu)選實施方式，在所述步驟二和所述步驟三中，所述熒光定量PCR反應的條件為:95°C IOmin預變性，然后95°C 15s，60°C Imin擴增40個循環(huán)。更優(yōu)選地，所述熒光定量PCR的反應液中部分組分及終濃度如下:1X的PCR預混合液、
2.5-4.0mM 的Mg2+、0.2-0.4mM 的 dNTPs、0.3-0.6mM 的 dUTP、0.2U/μ L 的 Taq酶、0.01-0.05U/μ L的UNG酶。
[0039]本發(fā)明試劑盒及檢測方法的優(yōu)點和效果如下:
[0040](I)敏感性高:可重復敏感度為0.01%,即10000個細胞中有一個含CYP2C19基因CYP2C19*2多態(tài)性、CYP2C19基因CYP2C19*3多態(tài)性或CYP2C19基因CYP2C19*17多態(tài)性就可以被檢測出。
[0041](2)特異性強:使用特異性探針對定量分子進行識別，準確性高。同時，靶序列由引物和探針雙重控制，特異性好、假陽性低。
[0042](3)簡便安全:操作簡單、安全、自動化程度高而且防止污染。擴增和檢測可以在同一管內檢測，不需要開蓋，不易被污染；同時擴增和檢測一步完成，不需要后期處理，無需要擔心放射性污染。
[0043](4)全程監(jiān)控:本發(fā)明實施例提供的試劑盒引入了內部陽性控制質量控制體系，對檢測過程進行全程質量監(jiān)控，有效避免假陽性或者假陰性。
[0044](5)快速:速度快、高通量，可在3-4小時完成。
[0045]本發(fā)明的試劑盒及檢測方法能快速、準確、定量檢測CYP2C19基因CYP2C19*2多態(tài)性、CYP2C19基因CYP2C19*3多態(tài)性和CYP2C19基因CYP2C19*17多態(tài)性，有效杜絕了假陽性和假陰性的發(fā)生，用于經CYP2C19代謝的藥物的使用劑量的預測并為藥物的選擇提供了重要的技術手段。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0046]為了更清楚地說明本發(fā)明實施例中的技術方案，下面將對實施例描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實施例，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據這些附圖獲得其他的附圖。
[0047]圖1是本發(fā)明實施例2提供的采用實施例1試劑盒的熒光實時定量PCR反應體系擴增CYP2C19基因CYP2C19*2多態(tài)性陽性的受檢者外周血的熒光曲線圖，及內參基因GAPDH標準品擴增的熒光曲線圖和內部陽性控制序列標準品擴增的熒光曲線圖，其橫坐標為Cycle Number (循環(huán)數，個)，其縱坐標為FL U0RESCENCE (熒光強度，a.u.)；
[0048]圖2是本發(fā)明實施例2提供的采用實施例1試劑盒的熒光實時定量PCR反應體系擴增CYP2C19基因CYP2C19*3多態(tài)性陽性的受檢者外周血的熒光曲線圖，及內參基因GAPDH標準品擴增的熒光曲線圖和內部陽性控制序列標準品擴增的熒光曲線圖，其橫坐標為Cycle Number (循環(huán)數，個)，其縱坐標為FL U0RESCENCE (熒光強度，a.U.)。
[0049]圖3是本發(fā)明實施例2提供的采用實施例1試劑盒的熒光實時定量PCR反應體系擴增CYP2C19基因CYP2C19*17多態(tài)性陽性的受檢者外周血的熒光曲線圖，及內參基因GAPDH標準品擴增的熒光曲線圖和內部陽性控制序列標準品擴增的熒光曲線圖，其橫坐標為Cycle Number (循環(huán)數，個)，其縱坐標為FL U0RESCENCE (熒光強度，a.U.)。
[0050]圖中:1-CYP2C19*2多態(tài)性的陽性擴增曲線、2-GAPDH標準品的擴增曲線、3-內部陽性控制品擴增曲線、4-CYP2C19*3多態(tài)性的陽性擴增曲線、5-CYP2C19*17多態(tài)性的陽性擴增曲線。
【具體實施方式】
[0051]為使本發(fā)明的目的、技術方案和優(yōu)點更加清楚，下面結合附圖對本發(fā)明實施方式作進一步地詳細描述。下面實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常為本領域常規(guī)方法，如按照常規(guī)實驗條件如SambiOOk等人，分子克隆，實驗手冊(第三版)(科學出版社，2002)中所述的條件，或按照試劑制造廠家所建議的條件。
[0052]實施例1.試劑盒的制備[0053]1、內參基因GAPDH以及檢測用引物和熒光探針的設計
[0054]根據基因序列分別設計對上述各基因序列特異的引物和熒光探針，其中，GAPDH基因序列和CYP2C19基因序列來源于美國國家生物技術信息中心核酸數據庫(NCBI)，GAPDH基因ID分別為2597，參考序列號為NG_007073.2，也可參見本發(fā)明序列表中SEQ ID NO: 13 ；CYP2C19基因ID分別為1557，參考序列號為NG_008384.1。采用Primer5.0引物設計軟件分別設計如下引物:CYP2C19基因CYP2C19*2多態(tài)性的特異性上下游引物及所述CYP2C19基因CYP2C19*2多態(tài)性的特異性Taqman熒光探針、CYP2C19基因CYP2C19*3多態(tài)性的特異性上下游引物及所述CYP2C19基因CYP2C19*3多態(tài)性的特異性Taqman熒光探針、CYP2C19基因CYP2C19*17多態(tài)性的特異性上下游引物及所述CYP2C19基因CYP2C19*17多態(tài)性的特異性Taqman熒光探針、內參基因GAPDH的上下游引物及內參基因GAPDH的Taqman熒光探針。
[0055]通過上述設計得到:
[0056]CYP2C19基因CYP2C19*2多態(tài)性的特異性上游引物序列:5’-CCCACTATCATTGATTATTTCCCA-3’(序列表中 SEQ ID NO:1 所示)。
[0057]CYP2C19基因CYP2C19*2多態(tài)性的特異性下游引物序列:5’-ACAAATACGCAAGCAGTCACA-3’(序列表中 SEQ ID N0:2 所示)。
[0058]CYP2C19 基因 CYP2C19*2 多態(tài)性的特異性 Taqman 熒光探針:FAM5’_ATGGAAAGTGATATTTTGG-3’ TAMRA-MGB (序列表中 SEQ ID NO:3 所示)。
[0059]CYP2C19基因CYP2C19*3多態(tài)性的特異性上游引物序列:5’-CAGGATTGTAAGCACCCCCTA-3’(序列表中 SEQ ID N0:4 所示)。
[0060]CYP2C19基因CYP2C19*3多態(tài)性的特異性下游引物序列:5’-CAGGGAGCTAATGGGCTTAGA-3’(序列表中 SEQ ID N0:5 所示)。
[0061]CYP2C19 基因 CYP2C19*3 多態(tài)性的特異性 Taqman 熒光探針:FAM5’_AGTCTTGCCTAGACAGC-3’ TAMRA-MGB (序列表中 SEQ ID N0:6 所示)。
[0062]CYP2C19基因CYP2C19*17多態(tài)性的特異性上游引物序列:5’ -AATTTGTGTCTTCTGTTCTCAAAGT-3’(序列表中 SEQ ID NO:7)。
[0063]CYP2C19基因CYP2C19*17多態(tài)性的特異性下游引物序列:5’ -AAAAGGGAGACCCTGGGAGA-3’(序列表中 SEQ ID NO:8)。
[0064]CYP2C19基因CYP2C19*17多態(tài)性的特異性Taqman熒光探針:FAM5’ -CTCAGCTCAAATCC-3’ TAMRA-MGB (序列表中 SEQ ID NO:9)。
[0065]內參基因GAPDH的上游引物序列:5’-CCTTTTGCAGACCACAGTCCAT-3’(序列表中SEQID NO: 10 所示)。
[0066]內參基因GAPDH的下游引物序列:5’-GGCCATGCCAGTGAGCTT-3’(序列表中SEQ IDNO: 11 所示)。
[0067]內參基因GAPDH 的 Taqman 熒光探針:FAM5’ -CCATCACTGCCACCC-3’ TAMRA-MGB (序列表中SEQ ID NO: 12所示)。
[0068]對于上述四個Taqman熒光探針，均采用添加熒光染料的方法分別在5’端標記了FAM，3，端標記了 TAMRA-MGB。
[0069]2、內部陽性控制序列及其引物和探針的設計[0070]該內部陽性控制序列為人工合成序列，包含CYP2C19基因部分序列和一部分人工合成序列，如序列表中SEQ ID N0:14所示。
[0071]采用Primer5.0引物設計軟件并按照上述引物和探針設計原則設計出上述內部陽性控制序列的上下游引物分別為:5’ -CGTATTGCACTCACTCAGAG-3’(如序列表中SEQ IDNO: 15 所示)、5’ -ACAACAGCGTAAGATGATCACTATC-3’(如序列表中 SEQ ID NO: 16 所示)，內部陽性控制序列的Taqman熒光探針為:TET5’ -AATAAGTCCTCTACTATATTAGC-3 ’ TAMRA (序列表中序列17)。對于該Taqman熒光探針，采用添加熒光染料的方法在5’端標記了 TET，3’端標記了 TAMRA。
[0072]3、試劑盒的組成及制備
[0073]本發(fā)明試劑盒組成如下:
[0074]①基因組DNA提取試劑:該提取試劑為本領域常用試劑，本實施例采用組織基因組DNA提取試劑盒(Qiagen公司，貨號:69504)中的試劑。
[0075]②引物、探針:上述CYP2C19基因CYP2C19*2多態(tài)性的特異性上下游引物、上述CYP2C19基因CYP2C19*2多態(tài)性的特異性Taqman熒光探針、上述CYP2C19基因CYP2C19*3多態(tài)性的特異性上下游引物、上述CYP2C19基因CYP2C19*3多態(tài)性的特異性Taqman熒光探針、上述CYP2C19基因CYP2C19* 17多態(tài)性的特異性上下游引物、上述CYP2C19基因CYP2C19*17多態(tài)性的特異性Taqman熒光探針、上述內部陽性控制序列的上下游引物、上述內部陽性控制序列的Taqman熒光探針、上述內參基因GAPDH的上下游引物以及上述內參基因GAPDH的Taqman熒光探針。
[0076]③上述內參基因G APDH和內部陽性控制序列標準品。
[0077]上述引物序列、內部控制序列、內參基因GAPDH序列和上述各Taqman熒光探針序列均由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。
[0078]④陰性對照和陽性對照:以去離子水為陰性對照，以含有CYP2C19*2基因多態(tài)性、CYP2C19*3基因多態(tài)性和CYP2C19*17基因多態(tài)性的基因組DNA樣品為陽性對照；
[0079]陽性對照的制備方法:采用組織基因組DNA提取試劑盒(Qiagen公司，貨號:69504)快速提取已經確診的含有CYP2C19*2基因多態(tài)性、CYP2C19*3基因多態(tài)性以及CYP2C19*17基因多態(tài)性的0.5ml受檢者外周血基因組DNA，作為陽性對照。
[0080]⑤各種熒光定量PCR反應試劑:PCR預混合液，本實施例中選用2XPCR Premix(Qiagen公司，產品貨號:210212) ；Mg2+ (本實例選用氯化鎂)、dNTPs、dUTP、Taq酶、UNG酶和無RNase去離子水。
[0081]實施例2.用實施例1的試劑盒檢測CYP2C19基因多態(tài)性
[0082]以隨機檢測30例受檢者外周血標本結果為例。
[0083]用本發(fā)明的試劑盒檢測某一受檢者的CYP2C19*2基因多態(tài)性、CYP2C19*3基因多態(tài)性和CYP2C19*17基因多態(tài)性的檢測流程為:首先獲取臨床受檢者外周血樣本，快速提取基因組DNA ;其次，先配制內參基因GAPDH和內部陽性控制序列的熒光定量PCR反應液，將內部陽性控制序列標準品和內參基因GAPDH標準品分別稀釋至拷貝數/mL為1.0xlO3,
1.0xlO4U.0xlO5和1.0xlO6，分別制作內部陽性控制序列標準品的標準曲線和內參基因GAPDH標準品的標準曲線；接下來再配制CYP2C19*2基因多態(tài)性、CYP2C19*3基因多態(tài)性和CYP2C19*17基因多態(tài)性的熒光定量PCR反應液，進行熒光定量PCR檢測樣品，在熒光定量PCR儀數據分析系統中讀出CT值結果。PCR擴增結束后，先分析各待檢測樣品的熒光定量PCR反應中內部陽性控制序列的擴增結果，如果其Ct值小于33，提示整個檢測過程有效；如果其Ct值大于35，提示檢測失敗，則需要重新進行檢測；如果其Ct值位于33~35之間，需要重復檢測。當內部陽性控制序列Ct值小于33時，將實時熒光定量PCR所得數據進行計算即分別計算如圖1所示的CYP2C19*2基因多態(tài)性、如圖2所示的CYP2C19*3基因多態(tài)性、如圖3所示的CYP2C19*17基因多態(tài)性及內參基因GAPDH的Ct值，兩者之差即為ACt值。最后，熒光定量PCR結果采用軟件分析，并標化計算樣本數據。
[0084]各受檢者的CYP2C19基因多態(tài)性的具體檢測步驟如下:
[0085]①受檢者外周血基因組DNA的抽提:采用實施例1試劑盒中的基因組DNA提取試劑按DNA抽提純化的方法快速提取0.5ml受檢者外周血基因組DNA。
[0086]②將上述提取的受檢者外周血基因組DNA經瓊脂糖凝膠電泳鑒定其完整性，通過紫外分光光度計測定260nm與280nm光密度值計算DNA的純度與濃度，用無菌去離子水調節(jié)抽提的DNA至相同濃度，置冰箱_20°C保存。
[0087]③將實施例1試劑盒中的內部陽性控制序列標準品和內參基因GAPDH標準品分別稀釋至拷貝數/mL為1.0xlO3、1.0xlO4、1.0xlO5和1.0xlO6，按以下熒光定量PCR反應體系進行反應以分別制作內部陽性控制序列標準品的標準曲線和內參基因GAPDH標準品的標準曲線。
[0088]稀釋成不同濃度的內參基因GAPDH的熒光定量PCR擴增:
[0089]各PCR反應體系為20 μ L，該反應體系中各組分及其終濃度為:1 XPCR混合液(Qiagen 公司，產品貨號:210212, 2XPCR Premix, 10.0μ L),3mM 的 Mg2+、0.3mM 的 dNTPs、
0.5mM的dUTP、0.2U/ μ L的T aq酶、0.04U/ μ L的UNG酶，內參基因GAPDH的上、下游引物的終濃度均為0.2 μ mol/L,內參基因GAPDH的Taqman熒光探針的終濃度為0.2 μ mo I/L ;另外，各稀釋梯度的內參基因GAPDH標準品用量為1.0 μ L，其余為無RNase去離子水。
[0090]稀釋成不同濃度的內部陽性控制序列的熒光定量PCR擴增:
[0091]各PCR反應體系為20 μ L，該反應體系中各組分及其終濃度為:1 XPCR混合液(Qiagen 公司，產品貨號:210212, 2XPCR Premix, 10.0μ L),3mM 的 Mg2+、0.3mM 的 dNTPs、0.5mM的dUTP、0.2U/ μ L的Taq酶、0.04U/ μ L的UNG酶，內部陽性控制序列的上、下游引物的終濃度均為0.25pmol/yL,內部陽性控制序列的Taqman熒光探針的終濃度為0.3pmol/μ L ;另外，各稀釋梯度的內部陽性控制序列標準品用量為1.0 μ L，其余為無RNase去離子水。
[0092]將上述各PCR反應體系置于Iightcycler熒光定量PCR儀上進行熒光定量PCR:先經過50°C 10s、95°C IOmin預變性，然后95°C 15s,60°C Imin擴增40個循環(huán)，擴增過程中儀器自動收集熒光信號。
[0093]④CYP2C19*2基因多態(tài)性熒光定量PCR擴增:
[0094]PCR反應體系為20 μ L,該反應體系中各組分及終濃度為:I X PCR預混合液(Qiagen 公司，產品貨號:210212, 2XPCR Premix, 10.0μ L),3mM 的 Mg2+0.3mM 的 dNTPs 和
0.5mM的dUTP、0.2U/ μ L的Taq酶和0.04U/ μ L的UNG酶，CYP2C19*2基因多態(tài)性特異性上、下游引物終濃度均為0.2 μ mol/L, CYP2C19*2基因多態(tài)性特異性Taqman熒光探針終濃度為0.3ymol/L，同時加入內部陽性控制序列上、下游引物的終濃度均為0.2ymol/L，內部陽性控制序列的Taqman熒光探針的終濃度為0.3 μ mol/L,內部陽性控制序列的終濃度為0.2 μ mol/L ;另外，被提取的受檢者外周血基因組DNA的用量為2.0 μ L，其余為無RNase去離子水。
[0095]將上述PCR反應體系置于Iightcycler熒光定量PCR儀上進行反應，擴增條件:先經過50°C 10s，95°C IOmin預變性，然后95°C 15s，60°C Imin擴增40個循環(huán)，擴增過程中儀器自動收集熒光信號。
[0096]⑤CYP2C19*3基因多態(tài)性熒光定量PCR擴增:
[0097]PCR反應體系為20 μ L,該反應體系中各組分及終濃度為:I X PCR預混合液(Qiagen 公司，產品貨號:210212, 2XPCR Premix, 10.0μ L),3mM 的 Mg2+、0.3mM 的 dNTPs 和
0.5mM的dUTP、0.2U/ μ L的Taq酶和0.04U/ μ L的UNG酶，CYP2C19*3基因多態(tài)性特異性上、下游引物終濃度均為0.2 μ mol/L, CYP2C19*3基因多態(tài)性特異性Taqman熒光探針終濃度為0.3ymol/L，同時加入內部陽性控制序列上、下游引物的終濃度均為0.2ymol/L，內部陽性控制序列的Taqman熒光探針的終濃度為0.3 μ mol/L,內部陽性控制序列的終濃度為0.2 μ mol/L ;另外，被提取的受檢者外周血基因組DNA的用量為2.0 μ L，其余為無RNase去離子水。
[0098]將上述PCR反應體系置于Iightcycler熒光定量PCR儀上進行反應:，擴增條件:先經過50°C 10s,95°C IOmin預變性，然后95°C 15s,60°C Imin擴增40個循環(huán)，擴增過程中儀器自動收集熒光信號。
[0099]⑥CYP2C19*17基因多態(tài)性熒光定量PCR擴增
[0100]PCR反應體系為 20μ L,該反應體系中各組分及終濃度為:1XPCR預混合液(Qiagen 公司，產品貨號:210212, 2XPCR Premix, 10.0μ L),3mM 的 Mg2+、0.3mM 的 dNTPs 和
0.5mM的dUTP、0.2U/ μ L的Taq酶和0.04U/ μ L的UNG酶，CYP2C19氺17基因多態(tài)性特異性上、下游引物的終濃度均為0.2 μ mol/L, CYP2C19*17基因多態(tài)性的特異性Taqman熒光探針終濃度為0.3 μ mol/L，同時加入內部陽性控制序列上、下游引物的終濃度均為0.2μπιο1/L，內部陽性控制序列的Taqman熒光探針的終濃度為0.3 μ mol/L,內部陽性控制序列的終濃度為0.2 μ mol/L ;另外，被提取的受檢者外周血基因組DNA的用量為2.0μ L，其余為無RNase去離子水。
[0101]將上述PCR反應體系置于Iightcycler熒光定量PCR儀上進行反應，擴增條件--先經過50°C 10s，95°C IOmin預變性，然后95°C 15s，60°C Imin擴增40個循環(huán)，擴增過程中儀器自動收集熒光信號。
[0102]在CYP2C19*2、CYP2C19*3、CYP2C19*17基因多態(tài)性的熒光定量PCR擴增的同時設置陰性對照和陽性對照，陽性對照、陰性對照熒光定量PCR擴增的反應體系均為20 μ L，該反應體系中各組分及終濃度為=IXPCR混合液(Qiagen公司，產品貨號:210212，2XPCRPremix, 10.0 μ L)，3mM 的 Mg2+、0.3mM 的 dNTPs 和 0.5mM 的 dUTP、0.2U/μ L 的 Taq 酶和 0.04U/μ L的UNG酶，CYP2C19*2基因多態(tài)性、CYP2C19*3基因多態(tài)性和CYP2C19*17基因多態(tài)性的特異性上、下游引物的終濃度均為0.2 μ mol/L, CYP2C19*2基因多態(tài)性、CYP2C19*3基因多態(tài)性和CYP2C19*17基因多態(tài)性的特異性Taqman熒光探針的終濃度均為0.3 μ mol/L ;另外，陽性對照的基因組DNA樣品用量為1.0yL或者陰性對照去離子水用量為1.0 μ L，其余為無RNase去離子水。[0103]將該陰性對照和陽性對照也置于Iightcycler熒光定量PCR儀上反應:擴增條件為:先經過50°C 10s，95°C IOmin預變性，然后95°C 15s，60°C Imin擴增40個循環(huán)，擴增過程中儀器自動收集熒光信號。
[0104]⑦數據收集處理和分析:PCR擴增結束后，首先分析各反應體系中的內部陽性控制序列擴增結果，如果其Ct值小于33，提示整個檢測過程有效，如果其Ct值大于35，則需要重新進行檢測。當內部陽性控制序列Ct值小于33時，將實時熒光定量PCR所得數據進行計算，得出CYP2C19*2基因多態(tài)性、CYP2C19*3基因多態(tài)性或CYP2C19*17基因多態(tài)性相對于內參基因GAPDH的相對表達量后再進行統計分析，以比值大于或等于0.0001為陽性表達，小于0.0001為陰性表達,具體參見表1。
[0105]表1為熒光定量PCR分析CYP2C19*2基因多態(tài)性、CYP2C19*3基因多態(tài)性或CYP2C19*17基因多態(tài)性在受檢者外周血標本中的表達數據
[0106]
【權利要求】
1.一種檢測CYP2C19基因多態(tài)性的試劑盒，包括檢測用引物以及檢測用熒光探針，其特征在于，所述檢測用引物以及檢測用熒光探針包括:CYP2C19基因CYP2C19*2多態(tài)性的特異性上下游引物及所述CYP2C19基因CYP2C19*2多態(tài)性的特異性Taqman熒光探針、CYP2C19基因CYP2C19*3多態(tài)性的特異性上下游引物及所述CYP2C19基因CYP2C19*3多態(tài)性的特異性Taqman熒光探針、和CYP2C19基因CYP2C19*17多態(tài)性的特異性上下游引物及所述CYP2C19基因CYP2C19*17多態(tài)性的特異性Taqman熒光探針中的至少一組，其中: 所述CYP2C19基因CYP2C19*2多態(tài)性的特異性上游引物序列如序列表中SEQ ID NO:1所示； 所述CYP2C19基因CYP2C19*2多態(tài)性的特異性下游引物序列如序列表中SEQ ID NO: 2所示； 所述CYP2C19基因CYP2C19*2多態(tài)性的特異性Taqman熒光探針的堿基序列如序列表中 SEQ ID NO:3 所示； 所述CYP2C19基因CYP2C19*3多態(tài)性的特異性上游引物序列如序列表中SEQ ID NO:4所示； 所述CYP2C19基因CYP2C19*3多態(tài)性的特異性下游引物序列如序列表中SEQ ID NO:5所示； 所述CYP2C19基因CYP2C19*3多態(tài)性的特異性Taqman熒光探針的堿基序列如序列表中 SEQ ID NO:6 所示； 所述CYP2C19基因CYP2C 19*17多態(tài)性的特異性上游引物序列如序列表中SEQ ID NO: 7所示； 所述CYP2C19基因CYP2C19*17多態(tài)性的特異性下游引物序列如序列表中SEQ ID NO: 8所示； 所述CYP2C19基因CYP2C19*17多態(tài)性的特異性Taqman熒光探針的堿基序列如序列表中 SEQ ID NO:9 所示。
2.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括內參基因GPADH、所述內參基因GAPDH的上下游引物及所述內參基因GAPDH的Taqman熒光探針，其中， 所述內參基因GAPDH的上游引物序列如序列表中SEQ ID NO: 10所示； 所述內參基因GAPDH的下游引物序列如序列表中SEQ ID NO: 11所示； 所述內參基因GAPDH的Taqman突光探針的喊基序列如序列表中SEQ ID NO: 12所不； 所述內參基因GAPDH的喊基序列如序列表中SEQ ID NO: 13所不。
3.根據權利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述CYP2C19基因CYP2C19*2多態(tài)性的特異性Taqman熒光探針、所述CYP2C19基因CYP2C19*3多態(tài)性的特異性Taqman熒光探針、所述CYP2C19基因CYP2C19*17多態(tài)性特異性Taqman熒光探針和所述內參基GAPDH的Taqman熒光探針的5’端均連接有熒光報告基團FAM，3’端均連接有熒光淬滅基團TAMRA-MGBο
4.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括各種熒光定量PCR反應試劑或者各種熒光定量PCR反應試劑的混合物，優(yōu)選地，所述各種熒光定量PCR反應試劑包括PCR預混合液、Mg2+、dNTPs、dUTP、Taq酶、UNG酶和無RNase去離子水。
5.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括內部陽性控制序列、內部陽性控制序列的上下游引物和Taqman熒光探針，其中: 所述內部陽性控制序列如序列表中SEQ ID NO: 14所示； 所述內部陽性控制序列的上游引物如序列表中SEQ ID NO: 15所示； 所述內部陽性控制序列的下游引物如序列表中SEQ ID NO: 16所示； 所述內部陽性控制序列的Taqman熒光探針的堿基序列如序列表中SEQ ID NO: 17所/Jn ο
6.根據權利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述內部陽性控制序列的Taqman熒光探針的5’端連接有熒光報告基團TET，3’端連接有熒光淬滅基團TAMRA。
7.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括陽性對照和陰性對照，其中，所述陰性對照為去離子水；所述陽性對照為同時含有所述CYP2C19基因CYP2C19*2多態(tài)性、所述CYP2C19基因CYP2C19*3多態(tài)性和所述CYP2C19基因CYP2C19*17多態(tài)性的基因組DNA樣品。
8.一種檢測CYP2C19基因多態(tài)性的方法，采用熒光定量PCR法，其特征在于，包括如下步驟: 步驟一，提取受檢者基因組DNA ； 步驟二，以稀釋成不同濃度的如序列表中SEQ ID NO: 13所示的內參基因GAPDH標準品為模板，采用如序列表中SEQ ID NO: 10所示的上游引物、如序列表中SEQ ID NO: 11所示的下游引物和如序列表中SEQ ID NO: 12所示的Ta qman熒光探針進行熒光定量PCR反應以制作內參基因GAPDH標準品的標準曲線； 步驟三，以步驟一得到的基因組DNA為模板，采用如序列表中SEQ ID ΝΟ:1所示的上游引物、如序列表中SEQ ID NO:2所示的下游引物和如序列表中SEQ ID NO:3所示的Taqman熒光探針，對CYP2C19基因CYP2C19*2多態(tài)性進行熒光定量PCR擴增；以步驟一得到的基因組DNA為模板，采用如序列表中SEQ ID NO:4所示的上游引物、如序列表中SEQ ID NO:5所示的下游引物和如序列表中SEQ ID NO:6所示的Taqman熒光探針，對CYP2C19基因CYP2C19*3多態(tài)性進行熒光定量PCR擴增；以步驟一得到的基因組DNA為模板，采用如序列表中SEQ ID NO:7所示的上游引物、如序列表中SEQ ID NO:8所示的下游引物和如序列表中SEQ ID NO:9所示的Taqman熒光探針，對CYP2C19基因CYP2C19*17多態(tài)性進行熒光定量PCR擴增；其中所述步驟三中的熒光定量PCR擴增的反應條件與步驟二的熒光定量PCR反應條件相同； 步驟四，數據收集處理和分析。
9.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，在所述步驟二和所述步驟三中，所述熒光定量PCR反應中均加入了如序列表中SEQ ID N0:14所示的內部陽性控制序列、如序列表中SEQ ID NO: 15所示的內部陽性控制序列的上游引物、如序列表中SEQ ID NO: 16所示的內部陽性控制序列的下游引物以及如序列表中SEQ ID NO: 16所示的內部陽性控制序列的Taqman突光探針。
10.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，在所述步驟二和所述步驟三中，所述熒光定量PCR反應的條件為:先經過500C 10s，95。。IOmin預變性，然后95°C 15s，60。。lmin，擴增40個循環(huán)。
【文檔編號】G01N21/64GK103468818SQ201310437151
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年9月22日 優(yōu)先權日:2013年9月22日
【發(fā)明者】劉輝 申請人:劉輝