一種用于檢測樣品中重金屬銅離子含量的酶聯(lián)免疫試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于檢測樣品中重金屬銅離子含量的酶聯(lián)免疫試劑盒，包被有包被原的酶標板，酶標記物，銅離子螯合物特異性單克隆抗體或多克隆抗體，銅離子螯合物標準品溶液，底物顯色液，終止液，洗液，稀釋后的螯合劑EDTA。本發(fā)明的檢測銅離子的酶聯(lián)免疫試劑盒具有下列各項優(yōu)點：①特異性強，敏感性高，最低檢測限為0.42μg/L，檢測范圍為2.83～456.04μg／L。②簡便、快速、時效性強。③結(jié)果顯示形象、直觀、準確。④費用低廉，適用范圍廣，便于推廣，能夠現(xiàn)場監(jiān)控且適合大量樣本篩查。
【專利說明】—種用于檢測樣品中重金屬銅離子含量的酶聯(lián)免疫試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】:
[0001]本發(fā)明涉及一種用于檢測銅離子的單克隆抗體及酶聯(lián)免疫試劑盒。
【背景技術(shù)】:
[0002]重金屬污染主要指生物毒性顯著地汞、鉻、鎘、鉛以及類金屬砷，還包括具有毒性的重金屬銅、鈷、鎳、錫等污染物。隨著城市的擴大和大規(guī)模工業(yè)的發(fā)展，大量重金屬進入環(huán)境后，即使?jié)舛群艿?，也可能造成危害，通過飲用水，或者通過生物富集以及食物鏈等方式最終威脅人體健康。重金屬污染不同于其他類型污染，具有隱蔽性、長期性和不可逆轉(zhuǎn)性等特點。
[0003]重金屬銅是自然界存在的一種重要的金屬元素。由于具有多種優(yōu)良性特性，銅及其化合物在工農(nóng)業(yè)中應(yīng)用十分廣泛。常量銅對農(nóng)作物或人均是營養(yǎng)物質(zhì)，而過量時就會產(chǎn)生危害。隨著工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的快速發(fā)展，銅的用途越來越廣泛，用量不斷增加，含銅污染物的排放也越來越多，對土壤等環(huán)境的污染逐漸顯現(xiàn)出來。重金屬的污染來源具有多樣性，農(nóng)作物中積累的重金屬離子通過食物鏈的生物放大作用進入人、畜體內(nèi)，威脅著人、畜健康。重金屬污染是食品、環(huán)境、衛(wèi)生監(jiān)測的重要內(nèi)容之一，銅及其化合物污染日趨嚴重并再度成為全球熱點問題之一。
[0004]傳統(tǒng)的重金屬監(jiān)測方法原子吸收光譜分析、電感耦合等離子發(fā)射光譜分析等需要大型的分析儀器，無法用于現(xiàn)場檢測，難以適應(yīng)環(huán)境及農(nóng)畜產(chǎn)品的現(xiàn)場抽查及產(chǎn)品進出口快速通關(guān)的要求。與傳統(tǒng)的檢測方法相比，重金屬的免疫分析方法作為一種新型的檢測技術(shù)具有快速、靈敏和便攜等優(yōu)點。
[0005]因此，銅離子污染已對人類健康構(gòu)成了嚴重威脅，建立快速、簡便、敏感、特異、經(jīng)濟、篩檢量大的銅離子免疫檢測技術(shù)，對于減少環(huán)境污染、提高食品質(zhì)量、保障食品安全具
有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0006]本發(fā)明的目的:針對現(xiàn)有檢測技術(shù)的不足和缺陷，制備出抗銅離子螯合物的高親和力、特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，以此為基礎(chǔ)提供一種用于檢測銅離子的酶聯(lián)免疫試劑盒，能夠快速、簡便、敏感、特異的檢測食品、茶葉、飼料、飲料、土壤、水等樣品中的銅離子殘留與含量。
[0007]所述的檢測銅離子的酶聯(lián)免疫試劑盒，包括96孔或48孔酶標板、最佳工作濃度的Cu2+ mAb或pAb、最佳工作濃度的RaMIgG-HRP或GaMIgG-HRP、底物顯色劑A、底物顯色劑B、Cu2+-1TCBE-0VA或Cu2+-1TCBE-BSA包被并封閉好的酶標板、終止液，Cu2+螯合物配置的標準品稀釋液I?9，洗液(PBST)。
[0008]所述的檢測銅離子的酶聯(lián)免疫試劑盒，用肉眼或酶標儀獲取結(jié)果，并根據(jù)結(jié)果分析計算所檢測樣品中的銅離子含量。
[0009]所述的檢測銅離子的酶聯(lián)免疫試劑盒，所用的銅離子標準品為銅離子與EDTA的螯合物，螯合物中銅離子含量的用電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法ICP-AES檢測獲得螯合物半抗原中Cu2+的含量。
[0010]所述單克隆抗體或多克隆抗體的制備方法為:
[0011]Al、雙功能螯合劑的選擇:雙功能螯合劑1-(4-異硫氰根苯基)_乙二胺四乙酸(ITCBE)，對氨基苯基-二乙三胺五乙酸(P-NH2-Bn-DTpA)，2-(4_異硫氰根苯基_1，4，7，10-四氮環(huán)十二烷四鹽酸鹽(P-SCN-Bn-DOTA)，然后在堿、酸的作用下，將銅離子螯合在雙功能螯合劑上；
[0012]A2、Cu2+-1TCBE-載體蛋白人工抗原的合成:采用異硫氰酯法合成銅離子人工抗原。分別稱取血藍蛋白(KLH)和牛血清白蛋白(BSA) 20mg溶于ImL濃度為IOmmoL / L，PH9.0的N-2-羥乙基哌嗪-N-乙磺酸緩沖液(HBS)中形成KLH、BSA溶液。稱取IOmg金屬鰲合劑1-(4-異硫氰基苯基)_乙 二胺四乙酸(ITCBE)溶于ImL 二甲基亞颯(DMSO)中形成23nmoL / L金屬鰲合劑溶液；分別取78.1uL濃度為23nmol / L的金屬鰲合劑溶液輕輕攪拌下逐滴滴加到0.5mLKLH和BSA溶液中，用IOmol / L KOH調(diào)節(jié)pH至9.0，室溫下反應(yīng)24h。制備出銅離子人工抗原 Cu2+-1TCBE-OVA, Cu2+-1TCBE-BSA, Cu2+-1TCBE-KLH, _20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0013]A3、銅離子單克隆抗體和多克隆抗體的獲得:用Cu2+-1TCBE-BSA, Cu2+-1TCBE-KLH免疫6周雌性BALB / C小鼠5只，劑量為201^/0.2mL /只，背部皮下分點注射。采用細胞融合技術(shù)無菌取脾臟制備脾細胞，在聚乙二醇-1500作用下與NStl骨髓瘤細胞進行融合；用間接ELISA法和阻斷ELISA法進行陽性孔篩選，用經(jīng)ICP-AES檢測獲得Cu2+螯合物做銅離子標準液，選擇強陽性、抑制率高、細胞生長旺盛的孔進行有限稀釋克隆化，擴大培養(yǎng)、凍存并鑒定，獲得一株雜交瘤細胞株；之后采用體內(nèi)誘生腹水法制備Cu2+HiAb ；
[0014]多抗制備:用Cu2+-1TCBE-BSA, Cu2+-1TCBE-KLH載體蛋白結(jié)合抗原免疫新西蘭白兔，免疫劑量為50 μ g~100 μ g /次，背部皮下分多點注射；首免，用合成的人工抗原與等量弗氏完全佐劑乳化；加強免疫，用合成的人工抗原與等量弗氏不完全佐劑乳化，連續(xù)免疫4~5次，每次間隔4~8周，最后一次免疫后10~15天，以ELISA法測其定效價達到IO5以上時，采血并分離收集高免血清。以飽和硫酸銨鹽析法提取IgG抗體，_20°C凍存?zhèn)溆谩?br> [0015]本發(fā)明的檢測銅離子的酶聯(lián)免疫試劑盒具有下列各項優(yōu)點:
[0016]①特異性強，敏感性高。該檢測銅離子的酶聯(lián)免疫試劑盒以高親和力的單克隆抗體(mAb)或多克隆抗體(pAb)為基礎(chǔ)制備而成。酶聯(lián)免疫試劑盒采用的是非均相間接競爭模式，其基本原理是樣品中的Cu2+與過量鰲合劑鰲合成可溶性的Cu2+-鰲合劑復(fù)合物后，將其與已包被于酶標板上的包被抗原Cu2+-鰲合劑-載體蛋白復(fù)合物共同競爭Cu2+HiAb上有限的結(jié)合位點，反應(yīng)達到平衡后洗脫多余的Cu2+-鰲合劑和Cu2+mAb，然后與酶標二抗反應(yīng)，用酶及其底物顯色系統(tǒng)顯示抗原抗體的結(jié)合情況，進而定量檢測Cu2+在樣品中的含量。該試劑盒最低檢測限為0.42 μ g / L，檢測范圍為2.83~456.04 μ g / L，與其它金屬離子交叉反應(yīng)較小。
[0017]②簡便、快速、時效性強。使用該檢測銅離子的酶聯(lián)免疫試劑盒，無需任何其它試劑和儀器，可現(xiàn)場操作，只要按照該試劑盒說明書上操作步驟進行檢測，60分鐘內(nèi)即可判定檢測結(jié)果，并根據(jù)結(jié)果可計算樣品中銅離子含量。
[0018]③結(jié)果顯示形象、直觀、準確。酶聯(lián)免疫試劑盒根據(jù)顯色液和底物不同顯示不同顏色，本試劑盒顯示藍色，終止后顯色為黃色肉眼可見。與所提供的標準檢測液比較，顯色越深含量越低或不含，顯色越淡或不顯色者說明樣品中含有待檢物，且含量越高如有酶標儀可進行度數(shù)，度數(shù)后根據(jù)稀釋比例進行計算可得出銅離子的含量。結(jié)果判定形象、直觀、準確，簡單明了，不易出現(xiàn)假陽性和假陰性等人為誤判。
[0019]④節(jié)省費用，適用范圍廣，便于推廣。使用酶聯(lián)免疫試劑盒，比用儀器分析的費用大幅下降。另外，酶聯(lián)免疫試劑盒的適用范圍廣，可滿足不同層次人員需要，包括專業(yè)檢驗，海關(guān)檢疫，衛(wèi)生檢疫，質(zhì)量監(jiān)測，加工企業(yè)和養(yǎng)殖場戶等，便于推廣應(yīng)用，具有廣闊的市場前景和明顯的經(jīng)濟、社會效益。
【專利附圖】

【附圖說明】:
[0020]圖1為檢測銅離子酶聯(lián)免疫試劑盒的標準曲線圖。
【具體實施方式】:
[0021]一種用于檢測銅離子的酶聯(lián)免疫試劑盒，它包括檢測酶標板、用于檢測的試劑，其中試劑包括樣品稀釋液，樣品提取液。要制成銅離子的酶聯(lián)免疫試劑盒，首先需要對重金屬銅離子與雙功能螯合劑進行螯合反應(yīng)，制備銅離子螯合物偶聯(lián)載體蛋白，用于制備相應(yīng)的檢測抗體。
[0022]本發(fā)明還包括食品、飼料、飲料、茶葉、土壤等樣品預(yù)處理方法。飼料、茶葉、土壤等固體樣品，研磨搗碎后稱取1.0g樣品，加入IOmL HEPES緩沖液,攪拌30min, 3000r / min離心5min，在上清液中加入30mg EDTA,并用N aOH溶液調(diào)pH至6.0，室溫反應(yīng)過夜；市場購買的飲料、自來水等液體樣品，取IOmL樣品，加入30mg EDTA,用NaOH溶液調(diào)pH至6.0，室溫反應(yīng)過夜，反應(yīng)后待檢。
[0023]本發(fā)明的檢測銅離子的酶聯(lián)免疫試劑盒，樣品處理簡單，適合于大量樣品的快速檢測和篩選，具有高特異性、高靈敏度、高精確率等特點，最低檢測限為0.42 μ g / L，檢測范圍為 2.83 ?456.04 μ g / L。
[0024]以下結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明進行詳細說明。
[0025]實施例1、銅離子螯合物、多克隆、單克隆抗體的制備
[0026]1.1銅離子螯合物的改造與鑒定
[0027]稱取76.7mg純度為99.99%的硝酸銅溶于100 μ L純度為優(yōu)級的濃硝酸，待充分溶解加超純水使終體積為lmL，形成濃度為409mmoL / L銅溶液。稱取IOmgEDTA溶于IOmMHBS緩沖液配制EDTA溶液。將兩者混勻后，用NaOH調(diào)節(jié)pH值為6.0,室溫搖床反應(yīng)24小時，即形成Cu2+-EDTA鰲合物溶液。
[0028]將100 μ g / mL的Cu2+標準儲備液用2 %的硝酸稀釋成O μ g / mL、0.25 μ g / mL、
0.5 μ g / mL>l μ g / mL>2 μ g / mL>4 μ g / mL的濃度梯度,儀器軟件自動繪制標準曲線，并得出線性回歸方程；樣品溶液50倍稀釋，用226nm波長在最佳優(yōu)化實驗條件下進行測定，儀器軟件自動分析結(jié)果。計算出所螯合物中的銅離子含量。
[0029]1.2銅離子人工抗原的合成與鑒定
[0030]分別稱取血藍蛋白(KLH)，牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA) 20mg溶于ImL濃度為IOmmoL / L，pH9.0的N-2-羥乙基哌嗪-N-乙磺酸緩沖液(HBS)中形成KLH、BSA溶液。[0031]稱取IOmg金屬鰲合劑1-(4-異硫氰基苯基)-乙二胺四乙酸(ITCBE)溶于ImL 二甲基亞颯(DMSO)中形成23nmoL / L金屬鰲合劑溶液；分別取160uL濃度為23nmol / L的金屬鰲合劑溶液輕輕攪拌下逐滴滴加到lmLKLH，BSA和OVA溶液中，用IOmol / L NaOH調(diào)節(jié)pH至9.0，室溫下反應(yīng)24h。反應(yīng)產(chǎn)物用30Kd的超濾管純化，超濾管內(nèi)加入反應(yīng)產(chǎn)物超濾，超濾管內(nèi)先用IOmmoL / L，pH9.0HBS沖洗3次，再用IOmmoL / L，pH7.4的HBS緩沖液洗2次，除去其中未反應(yīng)的小分子金屬鰲合劑。
[0032]取16111^濃度為40911111101^ / L銅溶液滴加到已反應(yīng)過的載體蛋白溶液中，用用NaOH調(diào)節(jié)pH值至9.0,室溫搖床反應(yīng)24小時，然后移入透析袋中透析5天。所得產(chǎn)物即分別為純化的銅離子鰲合后的人工抗原:Cu2+-1TCBE-BSA，Cu2+-1TCBE-KLH,包被抗原Cu2+-1TCBE-0VA。用蛋白核酸分析儀在280nm波長下測定人工抗原中的蛋白濃度。
[0033]1.3銅離子單克隆抗體(Cu2+HiAb)和多克隆抗體(Cu2+pAb)的獲得
[0034]用Cu2+-1TCBE-BSA、Cu2+-1TCBE-KLH 分別免疫 6 周雌性 BALB / C 小鼠 5 只，劑量為20 Ug / 0.2mL /只，背部皮下分點注射。采用細胞融合技術(shù)，在PEG-1500作用下與NS。骨髓瘤細胞進行融合；用間接ELISA和阻斷ELISA進行陽性孔篩選，篩選后進行有限稀釋克隆化，擴大培養(yǎng)、凍存并鑒定，獲得一株雜交瘤細胞株。之后采用體內(nèi)誘生腹水法制備Cu2+mAb。用蛋白核酸分析儀在280nm波長下測定所獲抗體的IgG含量。
[0035]多抗制備:用Cu2+-1TCBE-BSA、Cu2+-1TCBE-KLH免疫新西蘭白兔，免疫劑量為50μ g~ΙΟΟμ g /次，背部皮下分多點注射。首免，加等量弗氏完全佐劑(FCA)乳化；加強免疫，加等量弗氏不完全佐劑(FIA)乳化，連續(xù)免疫4~5次，每次間隔4~8周，最后一次免疫后10~15天，以ELISA法測其定效價達到1:1O5以上時，采血并分離收集高免血清。以飽和硫酸銨鹽析法提取IgG抗體，_20°C凍存?zhèn)溆谩?br> [0036]實施例2、銅離子檢測酶聯(lián)免疫試劑盒的制備
[0037]2.1聯(lián)免疫試劑盒檢測反應(yīng)原理
[0038]聯(lián)免疫試劑盒選用合適的包被抗原濃度包被酶標板，用異源蛋白封閉后制成的檢測試劑盒，可用于樣品的檢測。將待測已處理后的樣品按要求取用和提供的多克隆或單克隆抗體結(jié)合反應(yīng)，未完全結(jié)合的抗體與酶標板上的位點結(jié)合，通過辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠或兔抗鼠二抗結(jié)合反應(yīng)，通過顯色體現(xiàn)顯色，觀察結(jié)果，或用酶標儀瀆度數(shù)，根據(jù)結(jié)果計算待測物的含量。結(jié)果的判斷同所提供的陰性、陽性對照比較，如顯色深淺同陰性對照完全相同，則視為陰性，即為不含待測物；如顯色較弱，或是不顯色則為陽性或弱陽性，即為含有待測物。如空白對照顯色，或陰性對照不顯色則視為無效。
[0039]2.2銅離子檢測酶聯(lián)免疫試劑盒的制備
[0040](1)待標銅離子mAb或pAb的工作濃度將待標銅離子mAb或pAb溶液1000Orpm離心30min,除去雜質(zhì)。采用方陣法篩選確定銅離子mAb或pAb的工作濃度。用不同濃度的包被抗原包被，測出最佳包被濃度和最佳抗體濃度。本試劑盒最佳包被濃度即用Cu2+-1TCBE-BSA包被，蛋白質(zhì)濃度為0.25mg / mL ;銅離子mAb的工作濃度為1: 1.6 X IO5 ;銅離子pAb的工作濃度為1: 2.56X 105。
[0041](2)銅離子檢測酶聯(lián)免疫試劑盒標準品的制備稱取IOmgEDTA溶于IOmM HBS緩沖液配制EDTA溶液，將Cu2+標準儲備液稀釋成Ong / mL、3.906ng / mL、7.812ng / mL、15.625ng / mL、31.25ng / mL、62.5ng / mL、125ng / mL、250ng / mL、500ng / mL、1000ng /mL的濃度梯度，用NaOH調(diào)節(jié)pH值為6.0,室溫搖床反應(yīng)24小時，即形成Cu2+-EDTA鰲合物溶液。將100 μ g / mL的Cu2+標準儲備液用2%的硝酸稀釋成O μ g / mL、0.25 μ g / mL、0.5 μ g / mL>l μ g / mL>2 μ g / mL>4 μ g / mL的濃度梯度,儀器軟件自動繪制標準曲線，并得出線性回歸方程；樣品溶液50倍稀釋，用226nm波長在最佳優(yōu)化實驗條件下進行測定，儀器軟件自動分析結(jié)果。
[0042](3)銅離子檢測酶聯(lián)免疫試劑盒的組裝銅離子殘留與含量的酶聯(lián)免疫試劑盒，標準配置包括Cl號液(最佳工作濃度的Cu2+mAb)，C2號液(最佳工作濃度的RaMIgG-HRP)，C3號液(底物顯色劑A)，C4號液(底物顯色劑B)，Cu2+-1TCBE-OVA包被并封閉好的8X12 (96孔)或酶8 X 12 (48孔)酶標板，C5號液(終止液)，Cu2+標準品稀釋液I~9，洗液(PBST)。洗液為0.01mol / L、PH7.4的磷酸鹽緩沖液含0.05% Tween-20 (PBST)，底物顯色劑A為過氧化脲，底物顯色劑B為四甲基聯(lián)苯胺(TMB)，終止液為2mol / L的硫酸溶液。
[0043]見表1。
[0044]表1銅離子酶聯(lián)免疫試劑盒的標準配置
[0045]
【權(quán)利要求】
1.一種用于檢測食品、飲料、茶葉、土壤、動物組織等樣品中的銅離子含量的酶聯(lián)免疫試劑盒。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述用于檢測銅離子的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于:包括包被Cu2+-1TCBE-OVA 或 Cu2+-1TCBE-BSA 并封閉好的 96 孔或 48 孔酶標板，以 Cu2+-1TCBE-OVA 或Cu2+-1TCBE-BSA為抗原制備的銅離子多克隆或單克隆抗體Cu2+mAb或pAb，酶標二抗為兔抗鼠或羊抗鼠抗體標記辣根過氧化物酶RaMIgG-HRP或GaMIgG-HRP，Cu2+螯合物配置的標準品稀釋液，洗液為0.01mol / L、pH7.4的磷酸鹽緩沖液含0.05% Tween-20 (PBST)，底物顯色劑A為過氧化脲，底物顯色劑B為四甲基聯(lián)苯胺(TMB)，終止液為2mol / L的硫酸溶液。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述用于檢測銅離子的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于以Cu2+-1TCBE-OVA或Cu2+-1TCBE-BSA為抗原制備的銅離子多克隆或單克隆抗體Cu2+mAb或pAb通過包括以下步驟在內(nèi)的制備方法制備得到: (1)銅離子螯合物的合成:通過雙功能螯合劑1-(4-異硫氰根苯基)_乙二胺四乙酸(ITCBE)，對氨基苯基-二乙三胺五乙酸(P-NH2-Bn-DTpA)，2-(4_異硫氰根苯基_1，4，7，10-四氮環(huán)十二烷四鹽酸鹽(P-SCN-Bn-DOTA)將銅離子螯合鏈接在載體蛋白； (2)采用了血藍蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)兩種載體蛋白分別制備了相應(yīng)的人工抗原，采用異硫氰酸酷法將金屬雙功能鰲合劑1-(4-異硫氰根苯基)_乙二胺四乙酸(ITCBE)與載體蛋白偶聯(lián)再與銅離子結(jié)合得到相應(yīng)的人工抗原Cu-1TCBE-KLH、Cu-1TCBE-BsA 和 Cu-1TCBE-OVA ； (3)免疫動物:以Balb/ c小鼠和新西蘭大白兔作為實驗動物，背部皮下多點注射，首免用弗氏完全佐劑(CFA)，加強免疫用弗氏不完全佐劑(CFA)，共免疫5次。用兔血清做多克隆抗體，以小鼠用于單克隆抗體的制作； (4)用Cu-1TCBE-KLH和Cu-1TCBE-BsA免疫6周雌性BALB/ C小鼠5只，劑量為.20yg/0.2mL /只，背部皮下分點注射。采用細胞融合技術(shù)無菌取脾臟制備脾細胞，在聚乙二醇-1500作用下與NSO骨髓瘤細胞進行融合；用間接ELISA法和阻斷ELISA法進行陽性孔篩選，選擇強陽性、抑制率高、細胞生長旺盛的孔進行有限稀釋克隆化，擴大培養(yǎng)、凍存并鑒定，獲得一株雜交瘤細胞株:之后采用體內(nèi)誘生腹水法制備抗銅離子螯合物的mAb。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述用于檢測銅離子的酶聯(lián)免疫試劑盒，所述的酶聯(lián)免疫試劑盒由以下步驟制備: (1)包被:酶標板上用Cu2+-DTPA-BSA包被； (2)封閉；采用濃度為0.05%的豬血清進行封閉； (3)單克隆抗體的制備:用Cu2+-1TCBE-KLH和Cu2+-1TCBE-BSA免疫6周齡雌性BALB/C小鼠。采用細胞融合技術(shù)，在聚乙二醇-1500作用下與NSO骨髓瘤細胞進行融合，用間接ELISA法和阻斷ELISA法進行陽性孔篩 選，選擇強陽性、抑制率高、細胞生長旺盛的孔進行有限稀釋克隆化，擴大培養(yǎng)，獲得一株雜交瘤細胞株；采用體內(nèi)誘生腹水法制備抗銅離子螯合物的mAb ； (4)EDTA反應(yīng)液的配制:稱取IOmg EDTA溶于IOmM HBS緩沖液配制成濃度為.34.2mmoL / L EDTA 溶液； (5)Cu2+標準溶液的配制:稱取76.7mg硝酸銅溶于100 μ L濃硝酸，充分溶解后加超純水使終體積為lmL，形成濃度為409mmoL / L銅溶液。與EDTA溶液混勻后，用NaOH調(diào)節(jié)pH值為6.0，室溫搖床反應(yīng)24小時，即形成Cu2+-EDTA鰲合物溶液； 將100 μ g / mL的Cu2+標準儲備液用2 %的硝酸稀釋成Oyg/ mL、0.25 μ g / mL、.0.5 μ g / mL>l μ g / mL>2 μ g / mL>4 μ g / mL的濃度梯度,用226nm波長在最佳優(yōu)化實驗條件下進行測定，儀器軟件自動分析結(jié)果；計算出所螯合物種的銅離子含量； (6)二抗的配制:酶標二抗RaMIgG-HRP或GaMIgG-HRP按照1:1000的工作濃度用洗液稀釋分裝； (7)底物、顯色液與洗液的配制:底物、顯色液與洗液分裝配制。洗液為0.01mol / L、ρΗ7.4 的磷酸鹽緩沖液含 0.05% Tween-20 (PBST)； (8)終止液為2mol/ L的硫酸溶液。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述用于檢測銅離子的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于:所述的檢測抗原為Cu2+-1TCBE-OVA或Cu2+-1TCBE-BSA,抗原的制備方法包括如下步驟: (1)稱取76.7mg硝酸銅溶于濃硝酸，溶解后加超純水使終體積為lmL，形成濃度為.409mmoL / L 銅溶液； (2)分別稱取20mg載體蛋白溶于ImL濃度為IOmmoL/ L HBS中形成蛋白溶液； (3)稱取IOmg金屬鰲合劑1-(4-異硫氰基苯基)-乙二胺四乙酸(ITCBE)溶于ImL二甲基亞颯(DMSO)中形成23nmoL / L金屬鰲合劑溶液； (4)取160uLITCBE溶液，逐滴滴加到(2)中，用NaOH調(diào)節(jié)pH值，室溫反應(yīng)24h，形成蛋白金屬鰲合劑； (5)取16μ L銅溶液滴加到(4)中，用NaOH調(diào)節(jié)pH值，室溫反應(yīng)24h，透析后為純化的銅離子鰲合后的人工抗原；Cu2+-1TCBE-Proten,用蛋白核酸分析儀在280nm波長下測定人工抗原中的蛋白濃度。
6.權(quán)利要求1-5任意一項所述的檢測銅離子的酶聯(lián)免疫試劑盒在檢測銅離子濃度中的應(yīng)用，優(yōu)選用于檢測食品、飲料、茶葉、土壤、動物組織中銅離子的濃度。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其檢測操作包括以下步驟: Al、樣品前處理方法:用0.1mol / L EDTA溶液處理樣品，離心取上清液用于檢測； A2、檢測步驟:第一步除第一排最后兩孔分別為陰性對照和空白對照外，每孔加入.50 μ L工作濃度的Cl號液Gu2+mAb，同時加入等體積銅離子標準液，其他孔根據(jù)檢測要求加Λ 50 μ L已處理的待檢樣品和等體積工作濃度的Cl號液Cu2+mAb，混勻后37°C溫育15min，反應(yīng)后用PBST洗板；第二步每孔加入5(^1^工作濃度的1^1?186-!11^，371:溫育25min，PBST洗板；第三步每孔加入100 μ L的酶底物Α、B混合液顯色，室溫反應(yīng)5min，每孔加入100 μ L終止液，用酶標儀讀A45tl值，記錄結(jié)果； A3、分析檢測結(jié)果:將獲得的OD值放入標準曲線的回歸方程式中進行計算得出待測樣品中銅離子的含量。
【文檔編號】G01N33/566GK103558387SQ201310445839
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年9月27日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月27日
【發(fā)明者】范國英, 王自良, 王愛萍, 張海棠, 姜金慶, 王順崗 申請人:河南科技學(xué)院