一種基于多孔硅非標(biāo)記實(shí)時(shí)在線檢測(cè)霍亂毒素的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種基于多孔硅非標(biāo)記實(shí)時(shí)在線檢測(cè)霍亂毒素的方法。該方法利用多孔硅為傳感基底，在多孔硅表面修飾疏水基團(tuán)后，通過(guò)疏水性相互作用固定脂質(zhì)體和單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂，當(dāng)樣品中含有霍亂毒素時(shí)，單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂(GM1)特異的結(jié)合毒素分子，利用多孔硅的反射干涉光譜，經(jīng)過(guò)傅里葉紅外轉(zhuǎn)化后，實(shí)時(shí)非標(biāo)記檢測(cè)多孔硅有效薄膜的厚度變化，對(duì)霍亂毒素進(jìn)行定量和定性檢測(cè)。該方法可以對(duì)霍亂毒素實(shí)時(shí)在線檢測(cè)，最低檢測(cè)限為1nM，該傳感基底可以重復(fù)使用。
【專利說(shuō)明】一種基于多孔硅非標(biāo)記實(shí)時(shí)在線檢測(cè)霍亂毒素的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明設(shè)計(jì)食品中的霍亂毒素快速、低成本、非標(biāo)記實(shí)時(shí)在線檢測(cè)技術(shù)方法。具體通過(guò)對(duì)多孔硅表面進(jìn)行疏水性修飾，通過(guò)疏水性相互作用將脂質(zhì)體和單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂固定于硅片的表面，利用多孔硅的反射干涉光譜，經(jīng)過(guò)傅里葉紅外轉(zhuǎn)化后，實(shí)時(shí)非標(biāo)記檢測(cè)多孔硅有效薄膜的厚度變化，來(lái)檢測(cè)食品中的霍亂毒素。
【背景技術(shù)】
[0002]霍亂毒素是由霍亂弧菌產(chǎn)生的一種細(xì)胞內(nèi)毒素。一般它由具有催化功能A亞基和具有識(shí)別功能的5個(gè)B亞基組成。人和畜如果食了被霍亂毒素污染的食物或飼料，會(huì)引起中毒，甚至死亡等嚴(yán)重的后果。對(duì)霍亂毒素的快速定量檢測(cè)對(duì)保障食品安全具有重要的意義。其次，霍亂毒素和其受體單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂的結(jié)合動(dòng)力學(xué)是研究許多疾病發(fā)生的原理，藥物作用機(jī)理，炎癥發(fā)生的機(jī)理等中重要的生物模型。然而，直接監(jiān)控霍亂毒素和其受體單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂相互作用的技術(shù)，還受到很大的限制和挑戰(zhàn)。尤其是膜結(jié)合蛋白，純化和分離這些活性蛋白，會(huì)使其失去活性，因此，開(kāi)發(fā)直接檢測(cè)霍亂毒素和其受體單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂相互作用的監(jiān)控技術(shù)方法具有重要意義。
[0003]目前，幾個(gè)技術(shù)和方法用于霍亂毒素和其受體單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂相互作用研究:主要包括蛋白質(zhì)或脂質(zhì)體的標(biāo)記技術(shù)，非標(biāo)記技術(shù)和人工膜技術(shù)。雖然，熒光標(biāo)記蛋白或脂質(zhì)體技術(shù)能夠提供敏感檢測(cè)限，但是，探針的修飾和信號(hào)的檢測(cè)非常麻煩和費(fèi)時(shí)。在云母，硅片，玻璃等界面上構(gòu)建人工磷脂單層或雙層膜技術(shù)也被用于檢測(cè)霍亂毒素和其受體單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂相互作用。傳統(tǒng)的生物膜模型是在平面上支撐磷脂雙層的形成。這些生物膜通常應(yīng)用原子力學(xué)顯微鏡和熒光顯微鏡進(jìn)行控制和觀察。但是，原子力學(xué)顯微鏡常常受到針尖-基底的相互作用影響很難在短時(shí)范圍內(nèi)測(cè)量薄膜特性的變化。光學(xué)非標(biāo)記技術(shù)包括表面等離子共振技術(shù)，壓電晶體共振技術(shù)，橢圓偏振技術(shù)，光學(xué)干涉技術(shù)等也被用于它們研究。但是，大部這些技術(shù)涉及到復(fù)雜的光路系統(tǒng)，溫度控制系統(tǒng)或者金屬增強(qiáng)表面層。
[0004]電化學(xué)刻蝕的多孔硅光學(xué)反射干涉系統(tǒng)已經(jīng)被證實(shí)是一個(gè)靈敏，簡(jiǎn)單，方便的非標(biāo)記技術(shù)，在生物傳感，藥物輸送和疾病診斷等方面具有廣闊的應(yīng)用前景。它具有巨大的表面積，納米孔徑可控制備，表面容易修飾和生物分子兼容性良好等優(yōu)點(diǎn)。我們應(yīng)用多孔硅作為磷脂支撐表面，構(gòu)建了人工單層薄膜，進(jìn)行非標(biāo)記實(shí)時(shí)高靈敏在線檢測(cè)霍亂毒素。這一技術(shù)方法為研究霍亂毒素和其受體單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂相互作用提供了新的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明目的在于開(kāi)發(fā)一種高靈敏度、低成本、實(shí)時(shí)在線檢測(cè)食品中霍亂毒素新技術(shù)，以替代傳統(tǒng)檢測(cè)的方法。
[0006]本發(fā)明的原理如圖1所示，該方法利用多孔硅為傳感基底，在多孔硅表面修飾疏水基團(tuán)后，通過(guò)疏水性相互作用固定脂質(zhì)體和單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂形成恒定光學(xué)厚度的多孔硅薄膜；當(dāng)樣品中含有霍亂毒素時(shí)，單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂特異的結(jié)合毒素分子，從而引起多孔硅光學(xué)反射干涉光譜的紅移(多孔硅薄膜光學(xué)厚度改變)，根據(jù)薄膜的光學(xué)厚度是否發(fā)生紅移以及紅移的量進(jìn)而對(duì)霍亂毒素進(jìn)行定量和定性檢測(cè)。該方法可以對(duì)霍亂毒素實(shí)時(shí)在線檢測(cè)，最低檢測(cè)限為InM，該傳感基底可以重復(fù)使用。
[0007]本發(fā)明所用多孔硅，是通過(guò)電化學(xué)刻蝕技術(shù)制備。脂質(zhì)體微球和單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂通過(guò)擠壓是采用脂質(zhì)體擠壓器，檢測(cè)信號(hào)通過(guò)多孔硅反射干涉光譜儀獲取。
[0008]本發(fā)明所述的一種基于多孔硅非標(biāo)記實(shí)時(shí)在線檢測(cè)霍亂毒素的方法，是利用多孔硅為傳感基底，在多孔硅表面修飾疏水基團(tuán)后，通過(guò)疏水性相互作用固定脂質(zhì)體和單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂，形成恒定光學(xué)厚度的多孔硅薄膜；加入樣品后對(duì)多孔硅薄膜的光學(xué)厚度進(jìn)行監(jiān)控，根據(jù)薄膜的光學(xué)厚度是否發(fā)生紅移以及紅移的量對(duì)樣品中的霍亂毒素進(jìn)行定性和定量檢測(cè)；該方法用于非診斷目的。
[0009]上述方法具體包括以下步驟:
[0010](I)電化學(xué)法制備多孔硅；
[0011](2)多孔硅的的修飾:通過(guò)1H，1H，2H_全氟-1-癸烯在140°C，氮?dú)獗Ｗo(hù)下進(jìn)行硅表面疏水性修飾；
[0012](3)用磷脂擠壓器制備脂質(zhì)體-單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂納米混合物，
[0013](4)脂質(zhì)體和單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂(GMl)的固定:通過(guò)疏水性相互作用在經(jīng)步驟
(2)修飾的多孔硅表面固定脂質(zhì)體-單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂；并通過(guò)光纖光譜儀監(jiān)控固定過(guò)程中多孔硅薄膜光學(xué)厚度的隨時(shí)間變化，直到薄膜光學(xué)厚度達(dá)到恒定；
[0014](5)用磷酸鹽緩沖液，洗滌多余的脂質(zhì)體和單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂；
[0015](6)檢測(cè):將樣品通過(guò)步驟(4)中已固定了脂質(zhì)體和單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂的多孔硅，并監(jiān)控多孔硅薄膜光學(xué)厚度的隨時(shí)間變化，直到薄膜光學(xué)厚度達(dá)到恒定；將監(jiān)控結(jié)果與步驟(4)得到的恒定薄膜光學(xué)厚度比較，對(duì)樣品中霍亂毒素進(jìn)行定性和(或)定量。
[0016]步驟(I)中所述電化學(xué)法的條件為:刻蝕液采用氫佛酸:無(wú)水乙醇，體積比為3:1 ;電流敏度為486mA/cm2，刻蝕時(shí)間為10s。
[0017]步驟(3)中單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂和脂質(zhì)體微球摩爾比例為1:40，擠壓通過(guò)50nm孔徑的聚碳酸酯薄膜21次。
[0018]本發(fā)明采用熱化學(xué)方法在多孔硅表面修飾全氟-1-癸烯疏水性基團(tuán)，通過(guò)疏水性相互作用將脂質(zhì)體體和單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂固定于硅片的表面，利用多孔硅的反射干涉光譜，經(jīng)過(guò)傅里葉紅外轉(zhuǎn)化后，實(shí)時(shí)非標(biāo)記檢測(cè)多孔硅有效薄膜的厚度變化，來(lái)檢測(cè)食品中的霍亂毒素。檢測(cè)靈敏度達(dá)到InM，檢測(cè)時(shí)間5小時(shí)，可以實(shí)時(shí)在線對(duì)霍亂毒素進(jìn)行檢測(cè)，本發(fā)明也可以使用其他細(xì)胞膜基受體和配體的在線非標(biāo)記監(jiān)控和相互作用的研究。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0019]圖1基于多孔硅在線檢測(cè)霍亂毒素原理圖；
[0020]圖2修飾全氟-1-癸烯疏水性基團(tuán)多孔硅的光學(xué)特性；
[0021]圖3修飾全氟-1-癸烯疏水性基團(tuán)多孔硅的光學(xué)穩(wěn)定性；
[0022]圖4在線檢測(cè)脂質(zhì)體微球在疏水性多孔硅的固定和形成(a，薄膜有效光學(xué)厚度隨時(shí)間的變化b)，傅里葉轉(zhuǎn)化后峰的振幅隨時(shí)間的變化；[0023]圖5霍亂毒素的非標(biāo)記在線檢測(cè)；
[0024]圖6在線非標(biāo)記檢測(cè)霍亂毒素特異性檢測(cè)1，(a,整個(gè)在線過(guò)程中薄膜有效光學(xué)厚度隨時(shí)間的變化b)，磷酸鹽緩沖液洗滌后，加入霍亂毒素，再用磷酸鹽緩沖液洗滌后薄膜有效光學(xué)厚度的變化；
[0025]圖7在線非標(biāo)記檢測(cè)霍亂毒素特異性檢測(cè)2，(C，整個(gè)在線過(guò)程中薄膜有效光學(xué)厚度隨時(shí)間的變化d)，磷酸鹽緩沖液洗滌后，加入牛血清蛋白，再用磷酸鹽緩沖液洗滌后薄膜有效光學(xué)厚度的變化；；
[0026]圖8在線非標(biāo)記檢測(cè)不同濃度霍亂毒素響應(yīng)圖。
【具體實(shí)施方式】
[0027]本發(fā)明所用霍亂毒素B亞甲基標(biāo)準(zhǔn)品，牛血清蛋白，1H，1H，2H-全氟_1_癸烯，單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂，購(gòu)自于Sigma公司。大豆磷脂購(gòu)自Avanti Polar Lipids公司。娃片(0.0008-0.0012 Ω-cm, (100)，硼參雜)購(gòu)自于Siltronix公司。磷酸鹽緩沖米諾購(gòu)于上海生工有限公司。
[0028]本發(fā)明所用的儀器主要有:
[0029]NJ320脈沖刻蝕儀，廈門(mén)納精分析儀器有限公司
[0030]控溫馬福爐，南京大學(xué)儀器廠
[0031]臭氧發(fā)生器廣州環(huán)偉環(huán)?？萍加邢薰?br> [0032]Y型光纖，海洋光學(xué)公司
[0033]鎢燈光源，海洋光學(xué)公司
[0034]USB-2000光纖光譜儀，海洋光學(xué)公司
[0035]LSP01-1A微流注射泵河北保定蘭格恒流泵有限公司
[0036]avanti 脂質(zhì)體擠壓器，Avanti Polar Lipids 公司
[0037]QL-866漩渦混合儀海門(mén)麒麟醫(yī)用儀器廠
[0038]SW-CJ-2凈化工作臺(tái)蘇州凈化儀器有限公司
[0039]QL-866漩渦混合儀海門(mén)麒麟醫(yī)用儀器廠
[0040]實(shí)施例1薄膜的疏水性和穩(wěn)定性驗(yàn)證
[0041 ] (I)首先，將硅片通過(guò)電化學(xué)刻蝕法制備多孔硅，刻蝕液為氫佛酸:無(wú)水乙醇(體積比為3:1)，電流敏度為486mA/cm2，刻蝕時(shí)間為10s。
[0042](2)通過(guò)1H，1H，2H-全氟_1_癸烯在140°C，氮?dú)獗Ｗo(hù)下進(jìn)行硅表面疏水性修飾2小時(shí)。得經(jīng)疏水性修飾的硅片。
[0043](3)經(jīng)疏水性修飾的硅片被固定于通過(guò)聚碳酸酯流式槽底部，Y型光纖垂直于流式槽表面，反射干涉光譜通過(guò)光纖獲得，每6秒記錄一個(gè)數(shù)據(jù)，通過(guò)OigorPix)軟件傅里葉轉(zhuǎn)換為一個(gè)反射峰光譜，以時(shí)間為橫坐標(biāo)軸，反射光譜強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，繪制在線檢測(cè)多孔硅薄
膜厚度。
[0044](4)薄膜的疏水特性:通過(guò)微流泵將PH7.4的磷酸鹽緩沖液循環(huán)輸送在聚碳酸酯流式槽，流速每秒0.7mL/min，5分鐘后，切斷緩沖液的供應(yīng)，2-3分鐘后繼續(xù)供應(yīng)，連續(xù)監(jiān)控薄膜光學(xué)厚度的變化，見(jiàn)圖2。
[0045](5)薄膜的穩(wěn)定性:通過(guò)微流泵將PH7.4的磷酸鹽緩沖液循環(huán)輸送在聚碳酸酯流式槽，流速每秒0.7mL/min，連續(xù)240分鐘，連續(xù)監(jiān)控薄膜光學(xué)厚度的變化，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，光學(xué)厚度的變化為縱坐標(biāo)繪制隨時(shí)間變化，薄膜光學(xué)厚度的變化，見(jiàn)圖3。
[0046]薄膜的疏水性和穩(wěn)定性得到驗(yàn)證。
[0047]實(shí)施例2
[0048]步驟(I) - (3)同實(shí)施例1，
[0049](4)用脂質(zhì)體擠壓器制備脂質(zhì)體-單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂納米混合物；單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂和脂質(zhì)體微球摩爾比例為1:40，擠壓通過(guò)50nm孔徑的聚碳酸酯薄膜21次。
[0050](5)脂質(zhì)體和單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂的固定。通過(guò)疏水性相互作用在多孔硅表面固定脂質(zhì)體-單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂。具體是流式槽先經(jīng)過(guò)去離子水洗滌15-20分鐘，再經(jīng)過(guò)pH7.4的磷酸鹽緩沖液洗漆5分鐘，接著，0.lmg/mL的脂質(zhì)體和單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂混合液通過(guò)流式槽，直到薄膜光學(xué)厚度達(dá)到一個(gè)穩(wěn)定值，見(jiàn)圖4。
[0051](6)霍亂毒素的非標(biāo)記在線檢測(cè):通過(guò)pH7.4的磷酸鹽緩沖液洗滌5分鐘試樣(含霍亂毒素溶液)后，InM霍亂毒素溶液的磷酸鹽溶液經(jīng)過(guò)微流泵循環(huán)在流式槽中,直到薄膜的光學(xué)厚度達(dá)到一個(gè)穩(wěn)定值，見(jiàn)圖5。隨著時(shí)間的進(jìn)行，薄膜的光學(xué)厚度增加，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間后，薄膜厚度達(dá)到穩(wěn)定的數(shù)值。
[0052]按照步驟(6)分別將含有不同濃度霍亂毒素溶液的磷酸鹽溶液經(jīng)過(guò)微流泵循環(huán)在流式槽中，直到薄膜的光學(xué)厚度達(dá)到一個(gè)穩(wěn)定值，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，引起的薄膜光學(xué)厚度變化為縱坐標(biāo)繪制實(shí)時(shí)檢測(cè)霍亂毒素的監(jiān)控曲線見(jiàn)圖8。。由圖8可見(jiàn)，隨著時(shí)間的進(jìn)行，不同霍亂毒素分子會(huì)引起薄膜光學(xué)厚度的變化，在5-6小時(shí)后各濃度引起的光學(xué)厚度變化趨于恒定，反應(yīng)結(jié)束，光學(xué)厚度的變化量和霍亂毒素有一定的數(shù)學(xué)關(guān)系，從而，可以進(jìn)行定量檢測(cè)霍亂毒素。
[0053]實(shí)施例3:特異性檢測(cè)
[0054]特異性檢測(cè)1:與實(shí)施例2基本相同，不同之處在于將不含單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂的脂質(zhì)體微球按照固定于經(jīng)疏水性修飾的硅片(多孔硅薄膜)，再按照(6)進(jìn)行檢測(cè)，試樣中含20nM霍亂毒素，見(jiàn)圖6。由圖6可見(jiàn)，20nM霍亂毒素引入后，薄膜的光學(xué)厚度沒(méi)有發(fā)生紅移，這是由于薄膜表面沒(méi)有霍亂毒素的受體，霍亂毒素沒(méi)有結(jié)合到薄膜的表面而引起薄膜折射率的改變。
[0055]特異性檢測(cè)2:與實(shí)施例2基本相同，不同之處在于試樣為含有20nM牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液(不含霍亂毒素)經(jīng)過(guò)微流泵循環(huán)在流式槽中，監(jiān)控薄膜光學(xué)厚度的變化，見(jiàn)圖7。由圖7可見(jiàn)，20nM牛血清白蛋白引入后，薄膜的光學(xué)厚度也沒(méi)有發(fā)生紅移，這是由于牛血清白蛋白沒(méi)有和薄膜表面的霍亂毒素的受體反應(yīng)而引起薄膜折射率的改變。
【權(quán)利要求】
1.一種基于多孔硅非標(biāo)記實(shí)時(shí)在線檢測(cè)霍亂毒素的方法，其特征在于該方法利用多孔硅為傳感基底，在多孔硅表面修飾疏水基團(tuán)后，通過(guò)疏水性相互作用固定脂質(zhì)體和單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂，形成恒定光學(xué)厚度的多孔硅薄膜；加入樣品后對(duì)多孔硅薄膜的光學(xué)厚度進(jìn)行監(jiān)控，根據(jù)薄膜的光學(xué)厚度是否發(fā)生紅移以及紅移的量對(duì)樣品中的霍亂毒素進(jìn)行定性和定量檢測(cè)；該方法用于非診斷目的。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，包括以下步驟: Cl)電化學(xué)法制備多孔硅； (2)多孔硅的的修飾:通過(guò)1H，1H，2H-全氟-1-癸烯在140°C，氮?dú)獗Ｗo(hù)下進(jìn)行硅表面疏水性修飾； (3)用磷脂擠壓器制備脂質(zhì)體-單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂納米混合物， (4)脂質(zhì)體和單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂(GMl)的固定:通過(guò)疏水性相互作用在經(jīng)步驟(2)修飾的多孔硅表面固定脂質(zhì)體-單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂；并通過(guò)光纖光譜儀監(jiān)控固定過(guò)程中多孔硅薄膜光學(xué)厚度的隨時(shí)間變化，直到薄膜光學(xué)厚度達(dá)到恒定； (5)用磷酸鹽緩沖液，洗滌多余的脂質(zhì)體和單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂； (6)檢測(cè):將樣品通過(guò)步驟(4)中已固定了脂質(zhì)體和單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂的多孔硅，并監(jiān)控多孔硅薄膜光學(xué)厚度的隨時(shí)間變化，直到薄膜光學(xué)厚度達(dá)到恒定；將監(jiān)控結(jié)果與步驟(4)得到的恒定薄膜光學(xué)厚度比較，對(duì)樣品中霍亂毒素進(jìn)行定性和/或/定量。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于步驟(I)中所述電化學(xué)法的條件為:刻蝕液采用氫佛酸:無(wú)水乙醇，體積比為3:1 ;電流敏度為486mA/cm2,刻蝕時(shí)間為10s。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在步驟(3)中單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂和脂質(zhì)體摩爾比例為1:40，擠壓通過(guò)50nm孔徑的聚碳酸酯薄膜21次。
【文檔編號(hào)】G01N21/45GK103558184SQ201310446443
【公開(kāi)日】2014年2月5日 申請(qǐng)日期:2013年9月26日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月26日
【發(fā)明者】李建林, 李瑋, 徐坤, 曹斌, 孫越, 徐杰, 蔣云坤, 鄭鐵松 申請(qǐng)人:南京師范大學(xué)