評(píng)估肝細(xì)胞癌預(yù)后的試劑盒及rffl的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種評(píng)估肝細(xì)胞癌預(yù)后的試劑盒及RFFL的應(yīng)用，該試劑盒包括用于特異性檢測(cè)RFFL表達(dá)水平或表達(dá)模式的試劑。應(yīng)用本發(fā)明的技術(shù)方案，通過(guò)應(yīng)用本試劑盒對(duì)肝癌患者的組織標(biāo)本中RFFL的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)可以有效地對(duì)肝癌患者的生存預(yù)后情況進(jìn)行準(zhǔn)確評(píng)估。
【專利說(shuō)明】評(píng)估肝細(xì)胞癌預(yù)后的試劑盒及RFFL的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】，具體而言，涉及一種評(píng)估肝細(xì)胞癌預(yù)后的試劑盒及RFFL的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]肝細(xì)胞癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)是全球最常見的惡性腫瘤之一,發(fā)病率居惡性腫瘤第五位，為第二大腫瘤死因。而據(jù)統(tǒng)計(jì)我國(guó)肝癌死亡人數(shù)約占全球因肝癌死亡人數(shù)的50%。目前以肝切除術(shù)為代表的外科治療仍然是肝癌的首選治療方法，但術(shù)后5年的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率達(dá)60%，甚至更高。隨著肝臟外科技術(shù)、麻醉和圍手術(shù)期處理水平的不斷改善，使肝癌手術(shù)切除率得到了顯著的提高，肝癌手術(shù)死亡率也不斷下降。盡管如此，肝癌患者的整體治療水平仍無(wú)顯著改善，其關(guān)鍵原因是肝癌切除術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率仍居高不下。
[0003]肝癌的預(yù)后是指預(yù)見患有肝癌的患者的各種情況，例如從肝癌中全面康復(fù)的可能性，經(jīng)治療后復(fù)發(fā)的可能性，肝癌診斷后患者生存的可能性等等。這可以根據(jù)疾病的嚴(yán)重性、診斷時(shí)間、治療進(jìn)展等各種情況而變化。只有根據(jù)其預(yù)后適當(dāng)?shù)貞?yīng)用各種治療方法時(shí)，肝癌才能夠得到有效的治療。例如，對(duì)于被評(píng)估為有良好的預(yù)后的患者，有必要避免可能對(duì)患者引起嚴(yán)重副作用的危險(xiǎn)的治療方法，例如激進(jìn)的化療或手術(shù)、放療等，而選擇那些相對(duì)溫和、保守和安全的治療方法。另一方面，對(duì)于被評(píng)估為有較差的預(yù)后的患者，應(yīng)當(dāng)積極地進(jìn)行化療或手術(shù)，例如放療等治療方法以力圖增加生存期或生存率。 [0004]根據(jù)迄今為止進(jìn)行的研究，已經(jīng)發(fā)展的肝癌的預(yù)后非常糟糕，顯示了自診斷起6個(gè)月內(nèi)死亡的高致死率，剩余僅四個(gè)月的平均壽命長(zhǎng)度。但是，大小小于3厘米的肝癌有良好的預(yù)后，且已知無(wú)需任何特別治療，一年的生存率為90%,且手術(shù)后5年的生存率為約40~50%。然而，根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)很難精確地評(píng)估肝癌患者的預(yù)后。為了精確評(píng)估預(yù)后，需要一種把患者劃分為各風(fēng)險(xiǎn)組群的分析方法。然而，迄今為止，僅僅依靠在診斷和初次手術(shù)治療時(shí)的臨床病理肝癌階段來(lái)確定預(yù)后，而沒(méi)有一種用于精確評(píng)估肝癌的方法。
[0005]因此，深入研究探討肝癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移相關(guān)的分子標(biāo)志物，不僅為肝癌患者的治療和預(yù)后評(píng)估帶來(lái)益處，也可為開發(fā)新的靶向治療藥物提供依據(jù)。因此，尋找評(píng)估肝癌預(yù)后的新的分子標(biāo)志物，具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明旨在提供一種評(píng)估肝細(xì)胞癌預(yù)后的試劑盒及RFFL的應(yīng)用，以解決現(xiàn)有技術(shù)中對(duì)肝細(xì)胞癌預(yù)后評(píng)估缺少有效的生物學(xué)分子標(biāo)志物的技術(shù)問(wèn)題。
[0007]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種評(píng)估肝細(xì)胞癌預(yù)后的試劑盒。該試劑盒包括用于特異性檢測(cè)RFFL表達(dá)水平或表達(dá)模式的試劑。
[0008]進(jìn)一步地，試劑包括用于特異性檢測(cè)RFFL mRNA表達(dá)水平或表達(dá)模式的RT-PCR引物。
[0009]進(jìn)一步地，RT-PCR引物的序列為 SEQ ID NO:1 和 SEQ ID NO:2。[0010]進(jìn)一步地，試劑用于特異性檢測(cè)RFFL所編碼的蛋白的表達(dá)水平或表達(dá)模式。
[0011]進(jìn)一步地，試劑包括:用于肝癌組織標(biāo)本石蠟包埋和切片的試劑，用于肝癌組織標(biāo)本石蠟切片的脫蠟和水化的試劑，用于抗原修復(fù)的檸檬酸抗原修復(fù)液，用于滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的雙氧水，用于封閉的封閉血清，山羊抗人RFFL蛋白多克隆抗體、辣根酶標(biāo)記的兔抗山羊IgG抗體，用于顯色的DAB顯色劑和蘇木素，以及用于脫水、透明和封片的試劑。
[0012]進(jìn)一步地，用于肝癌組織標(biāo)本石蠟切片的脫蠟和水化的試劑包括二甲苯、乙醇及蒸餾水。
[0013]進(jìn)一步地，用于脫水、透明和封片的試劑包括乙醇、二甲苯及顯微鏡封片用中性樹脂。
[0014]根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供一種RFFL作為分子標(biāo)志物在制備評(píng)估肝細(xì)胞癌預(yù)后的試劑盒中的應(yīng)用。
[0015]進(jìn)一步地，試劑盒包括用于肝癌組織標(biāo)本石蠟包埋和切片的試劑，用于肝癌組織標(biāo)本石蠟切片的脫蠟和水化的試劑，用于抗原修復(fù)的檸檬酸抗原修復(fù)液，用于滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的雙氧水，用于封閉的封閉血清，山羊抗人RFFL蛋白多克隆抗體、辣根酶標(biāo)記的兔抗山羊IgG抗體，用于顯色的DAB顯色劑和蘇木素，以及用于脫水、透明和封片的試劑。
[0016]根據(jù)本發(fā)明的再一個(gè)方面，提供一種RFFL作為分子標(biāo)志物在體外評(píng)估肝細(xì)胞癌預(yù)后中的應(yīng)用。
[0017]應(yīng)用本發(fā)明的技術(shù)方案，通過(guò)應(yīng)用本試劑盒對(duì)肝癌患者的組織標(biāo)本中RFFL的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)可以有效地對(duì)肝癌患者的生存預(yù)后情況進(jìn)行準(zhǔn)確評(píng)估。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0018]構(gòu)成本申請(qǐng)的一部分的說(shuō)明書附圖用來(lái)提供對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步理解，本發(fā)明的示意性實(shí)施例及其說(shuō)明用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的不當(dāng)限定。在附圖中:
圖1示出了 RFFL mRNA和蛋白在肝癌組織和肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平:
圖2示出了 RFFL蛋白在肝癌組織中的表達(dá)水平；
圖3示出了 RFFL高表達(dá)與肝癌患者差的生存結(jié)局的相關(guān)；以及 圖4示出了本發(fā)明在實(shí)施中例I中的應(yīng)用情況及其效果。
【具體實(shí)施方式】
[0019]需要說(shuō)明的是，在不沖突的情況下，本申請(qǐng)中的實(shí)施例及實(shí)施例中的特征可以相互組合。下面將參考附圖并結(jié)合實(shí)施例來(lái)詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明。
[0020]RFFL (E3 ubi quit in-protein ligase rif ifylin)基因定位 17ql2 染色體,編碼的蛋白含有363個(gè)氨基酸，大小為40KDa。截至目前，未發(fā)現(xiàn)有RFFL在肝癌中的作用的研究報(bào)道。
本發(fā)明的發(fā)明人首先采用Real-time qPCR、RT-PCR和Western-blot技術(shù)在新鮮肝癌組織及其鄰近非瘤肝組織中檢測(cè)RFFL的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RFFL在肝癌組織中的表達(dá)水平明顯高于其鄰近非瘤肝組織。同時(shí)發(fā)明人還采用Real-time qPCR和Western_blot技術(shù)檢測(cè)RFFL在正常肝細(xì)胞系L02及其它4種肝癌細(xì)胞系(H印G2、MHCC97-L、MHCC97-H和HCCLM3)中的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RFFL在4種肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平也明顯高于正常肝細(xì)胞系。
[0021]發(fā)明人進(jìn)一步采用免疫組織化學(xué)方法，對(duì)70例原發(fā)性肝細(xì)胞癌患者組織標(biāo)本中RFFL的表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)，并分析了 RFFL表達(dá)水平與肝癌臨床病理特征的相關(guān)性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RFFL蛋白在肝癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率和表達(dá)水平均明顯高于其鄰近非瘤肝組織。為了探討RFFL的表達(dá)與肝癌患者生存預(yù)后之間的關(guān)系，發(fā)明人對(duì)前述的70例肝癌患者進(jìn)行了臨床隨訪研究，獲得了肝癌患者手術(shù)后的生存時(shí)間及復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的資料。根據(jù)RFFL的免疫組化Michio Shimizu評(píng)分的結(jié)果，將70例肝癌標(biāo)本分為RFFL高表達(dá)組(陽(yáng)性表達(dá)組)和RFFL低表達(dá)組(陰性表達(dá)組)。采用Kaplan-Meier生存曲線法計(jì)算分析RFFL高表達(dá)組和低表達(dá)組患者手術(shù)后的生存情況，并以Log-rank法分別比較和檢驗(yàn)兩組之間總體生存率和無(wú)瘤生存率的差異。結(jié)果顯示，RFFL高表達(dá)組肝癌患者的總體生存率和無(wú)瘤生存率均明顯低于RFFL低表達(dá)組。
[0022]接著發(fā)明人運(yùn)用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型對(duì)與肝癌預(yù)后相關(guān)的臨床病理參數(shù)進(jìn)行分析。發(fā)現(xiàn)不管單因素回歸還是多因素回歸分析都顯示RFFL高表達(dá)代表著更差的總體生存時(shí)間和無(wú)瘤生存時(shí)間，RFFL高表達(dá)是影響肝癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。這提示RFFL的高表達(dá)與肝癌患者的不良預(yù)后密切相關(guān)，可作為肝癌重要的預(yù)后標(biāo)志物。
[0023]RFFL蛋白在肝癌組織和多種肝癌細(xì)胞系中均呈顯著性高表達(dá)；RFFL高表達(dá)是影響肝癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素；RFFL可作為評(píng)估肝癌患者預(yù)后的新的標(biāo)志物以及針對(duì)肝癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的分子干預(yù)治療的潛在作用靶點(diǎn)。
[0024]發(fā)明人的上述發(fā)現(xiàn)是基于下述實(shí)驗(yàn)手段完成的，本發(fā)明中采用的樣本及實(shí)驗(yàn)手段描述如下，如下文中沒(méi)有詳細(xì)提及的生物學(xué)手段或試劑均采用本領(lǐng)域常規(guī)的技術(shù)實(shí)現(xiàn):
1.病理標(biāo)本均來(lái)自于手術(shù)切除并經(jīng)病理組織學(xué)確診的肝細(xì)胞癌標(biāo)本。
[0025]2.臨床隨訪資料的收集。根據(jù)患者出院后復(fù)查B超、選擇性血管造影、CT(Computed Tomography,計(jì)算機(jī)斷層掃描技術(shù))、MRI (Magnetic Resonance Imaging,磁共振成像)、血清AFP(Alpha_fetoprotein,甲胎蛋白)水平或再次手術(shù)等確定有無(wú)臨床復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。通過(guò)門診、電話、實(shí)地訪視等方式進(jìn)行隨訪，獲得患者的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移或死亡時(shí)間資料。自患者手術(shù)當(dāng)天開始計(jì)算患者總體生存時(shí)間和無(wú)瘤生存時(shí)間?；颊咝g(shù)后出現(xiàn)肝癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移或因肝癌導(dǎo)致的死亡，即為隨訪終止點(diǎn)。若至隨訪截止日期時(shí)仍未觀察到患者出現(xiàn)肝癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移和因肝癌導(dǎo)致的死亡，或者已出現(xiàn)其他原因?qū)е碌乃劳?，即為刪失數(shù)據(jù)。隨訪時(shí)間為手術(shù)當(dāng)天至隨訪終止點(diǎn)，其中刪失數(shù)據(jù)的隨訪時(shí)間為手術(shù)當(dāng)天至隨訪截止日期。以患者手術(shù)當(dāng)天至患者死亡的時(shí)間定義為生存時(shí)間，以患者手術(shù)當(dāng)天至發(fā)生復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的時(shí)間定義為無(wú)瘤生存時(shí)間。
[0026]3.L02、H印G2、MHCC97-L、MHCC97-H和HCCLM3細(xì)胞培養(yǎng)除特別說(shuō)明外，均采用含 10% 胎牛血清(Fetal Bovine Serum, FBS) (GIBC0，CA，USA)的高糖 DMEM (Dulbecco，smodified Eagle’s medium)培養(yǎng)基(GIBC0，CA，USA)，且均置于 37°C 恒溫和 5% CO2 濃度的二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱 Forma Series II Water Jacketed C02 Incubator (ThermoScientific, OH, USA)中培養(yǎng)。所有操作均在超凈工作臺(tái)(AIR TECH, Shanghai, China)中進(jìn)行。
[0027]4.總RNA的提取:取新鮮組織5(T100 mg，以眼科剪剪碎后放入預(yù)冷后的研缽(經(jīng)180°C高溫滅活RNA酶)，再倒入約5 ml液氮，仔細(xì)研磨粉碎組織，再轉(zhuǎn)移至一無(wú)RNA酶(RNase)的1.5 ml離心管中(對(duì)于細(xì)胞:取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，去除細(xì)胞培養(yǎng)基，加入2^3 mlPBS溶液洗滌細(xì)胞，棄去PBS (Phosphate Buffered Saline)溶液，放置于冰上。在培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶里加入胰蛋白酶(Solarbio，Beijing, China)消化細(xì)胞，培基(GIBCO，CA，USA)中和滅活胰蛋白酶，細(xì)胞計(jì)數(shù)，800 g離心5 min，去除上清，I ml PBS溶液洗滌2次，離心收集細(xì)胞)，加入 500 V-1 裂解液(Lysis/Binding Solution, Ambion, TX, USA),劇烈震蕩混勻。接著加入50 u I勻衆(zhòng)添加劑(Homogenate Additive, Ambion, TX, USA),冰上孵育10分鐘(min)。加入 500 U I 的橫酸-苯酌?氯仿(Acid-Phenol Chloroform, Ambion, TX, USA),潤(rùn)旋 30~60 秒(s),于離心機(jī)(Eppendorf,Hamburg,Germany)中室溫下 10000 g 離心 5 min 分層。小心吸取上層水相轉(zhuǎn)移至一新的無(wú)RNA酶的1.5 ml離心管中，并記錄吸取的上清的體積。再加入上述上清液體積的1.25倍體積的100%乙醇?；靹蚝蠹尤脒^(guò)濾器(Ambion，TX,USA)上室(每次最多加700 iil，超過(guò)700 則分次加入)，室溫下10000 g離心15秒，使混合液濾過(guò)過(guò)濾柱，棄去濾過(guò)液。重復(fù)上述步驟直至所有的混合液都經(jīng)過(guò)濾器過(guò)濾。在過(guò)濾器上室加入700 u I的洗滌液I (Wash Solution 1，Ambion, TX, USA)，快速離心5~10秒，棄去濾過(guò)液。再在過(guò)濾器上室加入500 yl的洗漆液2/3 (Wash Solution 2/3, Ambion,TX, USA)，快速離心5~10秒，棄去濾過(guò)液，重復(fù)該步驟I次。接著再次室溫下10000 g離心I min，去除剩余液體。將過(guò)濾柱取出，換入新的收集管，加入95°C預(yù)熱的無(wú)RNA酶水，10000g離心20~30秒，收集含有總RNA的濾過(guò)液，分裝，保存于_20°C或_80°C備用。
[0028]5.RNA的定量及質(zhì)量檢測(cè):取I Ul的總RNA提取溶液，加入49 U I的無(wú)RNA酶水，混勻，使用DU-800紫外分光光度儀(BECKMAN COULTER, CA，USA)測(cè)定波長(zhǎng)為260 nm和280 nm時(shí)的吸光度值A(chǔ)260和A280，計(jì)算A260/A280比值，檢測(cè)其濃度及純度。正式檢測(cè)前需預(yù)熱紫外分光光度儀，并用50 ill無(wú)RNA酶水調(diào)零。每例總RNA樣本的A260和A280均測(cè)3次，取其平均值?？俁NA純度以A260/A280比值評(píng)估，A260/A280比值介于1.8^2.1之間即可認(rèn)為總RNA純度合格。使用以下公式計(jì)算總RNA濃度:總RNA濃度=40XA260X50/1000(U g/ U I) o
[0029]6.逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(Reverse Transcription, RT):采用 Invitrogen 公司的用于qRT-PCR的M-MLV第一鏈合成系統(tǒng)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Invitrogen，CA，USA)，建立20 yl的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系。首先在無(wú)RNase的微量離心管中加入以下組分:10 mM的dNTP混合物，I U I ；500 u g/ml 的 Oligo (dT)12 ~18，I U I ;總 RNA，I Ul ;無(wú) RNA 酶水，9 U I?；旌衔镌?PCR儀(Biometra,Goettingen,Germany)中65°C加熱5 min后，立即置于冰上。瞬時(shí)離心后，加入以下組分:0.1 M的DTT，2 yl;40單位/iil的RNaseOUTTM核酸酶抑制劑(Invitrogen，CA,USA), I u I ；5X第一鏈合成緩沖液，4 U I。輕輕混勻后在37°C下孵育2 min。接著在室溫下加入M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶I iil(200單位)，輕輕地吹打混勻。然后于37°C下孵育50分鐘。再70°C加熱15分鐘以終止反應(yīng)。逆轉(zhuǎn)錄后所得cDNA產(chǎn)物于-20°C下保存。
[0030]7.熒光實(shí)時(shí)定量Real-time PCR反應(yīng):熒光實(shí)時(shí)定量Real-time PCR引物設(shè)計(jì)方法同RT-PCR，由上海生工生物工程有限公司合成。引物設(shè)計(jì)如下:RFFL基因的上游引物序列為SEQ ID NO:1 (5’-caccttgtccccagactttc-3’)，RFFL基因的下游引物序列為SEQ ID NO:2 (5，-gcctgctgattctcctgaac-3’)，產(chǎn)物大小為 147bp。以 GAPDH 基因作為內(nèi)參，與RFFL基因在相同條件下進(jìn)行Real-time PCR反應(yīng)。GAPDH的上游引物序列為SEQID NO:3 (5’-AGGTCGGAGTCAACGGATTTG-3’)，GAPDH 基因的下游引物序列為 SEQ ID NO:4(5’ -GTGATGGCATGGACTGTGGT-3’)，產(chǎn)物大小為532 bp。以上引物均加入無(wú)RNase水配成濃度為 100 U M 的忙存液備用。按照 Roche 公司的 FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)試劑盒(Roche, Mannheim, Germany)說(shuō)明書，在 96 孔 Real-time PCR 板(AppliedBiosystems，CA，USA)中建立20 ul反應(yīng)體系:上游引物(100 uM),0.06 yl ;下游引物(100 li M), 0.06 U I ；FastStart Universal SYBR Green Master (ROX), 10 U I ;無(wú) RNase水，7.88 u I ;cDNA 模板(≤ 10 ng/u 1),2 u 10 加完各試劑后，在 96 孔 Real-time PCR 板上貼好膜。以上各步均需在冰上操作。Real-time PCR反應(yīng)過(guò)程在7300 Real Time PCRSystemCApplied Biosystems, CA, USA)中進(jìn)行。反應(yīng)條件設(shè)定為:95°C預(yù)變性10分鐘；95°C變性15秒，60°C延伸I分鐘，共40個(gè)循環(huán)；并進(jìn)行定量和融解曲線分析。運(yùn)行Real-timePCR反應(yīng)，并統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果。分別計(jì)算RFFL和GAPDH的Ct(Cycle threshold,循環(huán)閾值)值，以GAPDH mRNA的表達(dá)量作為內(nèi)參，RFFL的mRNA的相對(duì)表達(dá)水平表示為2_Aet，其中A Ct=Ct(EFFL) - Ct (MPm0;而2_A ACt表示RFFL在肝癌組織(A)中的mRNA表達(dá)水平相較其在相鄰非瘤肝組織(P)中的表達(dá)水平的倍數(shù)，其中 2_AAtt = (Ct (A,EFFL)- Ct (A,GAPDH)) - (Ct (P,EFFL)- Ct
(P’GAPDH))。
[0031]8.總蛋白的提取:取新鮮組織100 mg，以眼科剪剪碎后放入預(yù)冷后的研缽(經(jīng)180°C高溫滅菌)，倒入5~10 ml液氮，仔細(xì)研磨粉碎組織，碾碎后的組織轉(zhuǎn)移至1.5 ml離心管中(對(duì)于細(xì)胞:去除培養(yǎng)皿中的培基，以冰PBS液輕柔沖洗2次。吸盡PBS液，加入0.5 M的EDTA溶液(GIBC0，CA，USA) 0.5 ml，促進(jìn)細(xì)胞脫落。用細(xì)胞刮匙刮取細(xì)胞，放入1.5 mlEP管中，800 g常溫下離心5 min，棄去上清。)，再加入I ml RIPA裂解液(碧云天，上海，中國(guó))。渦旋震蕩后，置冰上孵育30 min，每4~5 min渦旋一次。于4°C下12000 g離心15分鐘，吸取上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中。重復(fù)一次，取上清即為總蛋白。將總蛋白分裝保存于-80。。。
[0032]9.SDS-PAGE電泳及蛋白質(zhì)免疫印跡:配置12%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠分離膠和5%的濃縮膠。準(zhǔn)備蛋白樣品。在提取的蛋白中加入5X SDS-PAGE Loading Buffer (碧云天，上海，中國(guó))(稀釋至終濃度I X ),平時(shí)于-80°C保存。將加好Loading Buffer的蛋白樣品置于開水中水浴10 min變性。蛋白樣品稍冷卻后，12000 rpm離心5~10 min,用特制的細(xì)長(zhǎng)TIP頭取上清上樣，采用Min1-PROTEAN Tetra System小型垂直電泳系統(tǒng)(B10-RAD，CA, USA)進(jìn)行電泳，之后使用 TE77 ECL Sem1-Dry Transfer Unit 半干轉(zhuǎn)膜儀(AmershamBiosciences, NY, USA)將蛋白樣品轉(zhuǎn)移至 PVDF Western Blotting Membranes (Roche,Mannheim,Germany)上。PVDF[PoIy (vinylidene fluoride),聚偏氟乙烯]膜用甲醇預(yù)處理5 s成半透明狀后，放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中；濾紙用轉(zhuǎn)膜緩沖液泡著。去除小玻片，切除積層膠，蓋上PVDF膜，防止氣泡產(chǎn)生，蓋濾紙，再去除大玻片，制成“夾心餅”樣(從上往下，依次為:濾紙、膠、PVDF膜、濾紙)。電壓12 V下半干轉(zhuǎn)約80 min。轉(zhuǎn)膜完成后，用PBS液將PVDF膜漂洗3~5 min，去除轉(zhuǎn)膜緩沖液。再將膜放入5%的脫脂牛奶(用PBS溶液溶解)中封閉45 min。之后用PBS-T溶液(PBS溶液中加入終濃度為0.1%的吐溫-20)洗滌3次，每次5min。接著將膜放入用PBS溶液適當(dāng)稀釋的疒10 ml的一抗中，于4°C搖床過(guò)夜。次日，將膜放入PBS-T液中輕搖5 min，共3次。再將膜放入用PBS溶液適當(dāng)稀釋的二抗中，室溫下輕搖20~30 min。接著用PBS-T液洗滌15 min，共3次。將膜用顯像試劑WesternBrightTMECL-spray Western blotting detection system (ADVANSTA, CA, USA)浸泡 I min,再將膜和膠片貼在一起后放入暗盒，壓緊暗盒，約I min，再邊顯邊看。當(dāng)條帶顯影而背景未顯影時(shí)，將膠片放入定影液中漂洗，定影，攝片。采用Bio-Rad Molecular Imager Gel DocTMXR+ Imaging System凝膠成像系統(tǒng)(BIO-RAD, CA, USA)掃描保存，并使用 Gel-Pro analyzer
4軟件對(duì)Western-blot條帶圖像的灰度值進(jìn)行半定量分析，并采用方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。每個(gè)樣本重復(fù)檢測(cè)3次，結(jié)果取平均值。使用的一抗包括:兔抗人RFFL多克隆抗體(abeam,Massachusetts,USA);兔抗人 0 -Actin 蛋白多克隆抗體(Santa Cruz,CA,USA)等。以兔抗人P-Actin蛋白多克隆抗體檢測(cè)P-Actin蛋白作為內(nèi)參照。使用的二抗包括:HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體(Santa Cru z, CA, USA);辣根酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體(中杉金橋，北京，中國(guó))等。
[0033]11.免疫組化檢測(cè)方法如下:免疫組織化學(xué)檢測(cè)采用非生物素-辣根酶標(biāo)記的超敏二步法。使用的主要試劑為PV-9003山羊超敏二步法免疫組化檢測(cè)試劑盒(中杉金橋，北京，中國(guó))。
[0034](I)切片:本研究使用的所有的肝細(xì)胞癌的石蠟組織標(biāo)本以33 Pm厚度行連續(xù)切片。
[0035](2)烤片:將石蠟切片放在銅架上，置60°C~70°C烤箱烤30~60 min。
[0036](3)脫蠟:切片從烤箱中取出后，立即置于二甲苯(100%)中，浸泡15 min后換到第二缸二甲苯，再浸泡15 min。
[0037](4)水化:切片從二甲苯取出后依次置于無(wú)水乙醇、95%乙醇、70%乙醇和50%乙醇中浸泡3~10 min ;再用自來(lái)水沖洗5 min (先裝一盆水放在水龍頭下，調(diào)整水龍頭使水量適中，再將切片架放在水盆中沖洗)；蒸餾水過(guò)一下。
[0038](5)抗原修復(fù)(微波熱修復(fù)):13.5 ml檸檬酸修復(fù)液A液加上61.5 ml B液，再加去離子水至750 ml，配成檸檬酸抗原修復(fù)液；切片正面朝上放在修復(fù)液中，在微波爐中煮至沸騰，避免煮干，10 minX2次；修復(fù)結(jié)束后，切片自然冷卻至室溫；PBS浸泡，5 minX2次(保證第一次浸泡的是新配的PBS)。
[0039](6)滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶(HRP酶):從PBS中取出切片，在蒸餾水中過(guò)一下；3%H2O2室溫孵育30 min ;蒸餾水沖洗(直接用蒸餾水沖洗切片架上的切片，或者將切片放在蒸餾水中浸泡3~5 min) ；PBS浸泡5 min。
[0040](7)封閉:滴加封閉血清(相應(yīng)二抗的封閉血清原液，用PBS稀釋至10%，可再加1%BSA)后室溫或37°C孵育15~30 min。
[0041](8)孵育一抗:滴加1:300稀釋的兔抗人RFFL多克隆抗體(abcam，Massachusetts, USA)，37°C預(yù)孵育30 min后再置于4°C過(guò)夜；第二天先將切片在37°C復(fù)溫30 min，再泡 PBS，3 minX 3 次。
[0042](9)孵育二抗:切片滴加聚合物輔助劑(PV-9003試劑盒中試劑1)，37°C孵育15~20min ;PBS浸泡，3 minX 3次；切片滴加二抗(PV-9003試劑盒中試劑2)，37°C孵育15~20min ;PBS 浸泡，3 minX 3 次。
[0043](10)顯色劑顯色:使用DAB顯色試劑盒(中杉金橋，北京，中國(guó))配制顯色劑，取一干凈EP管裝I ml DAB底物液,再加入50 y I濃縮DAB(二氨基聯(lián)苯胺,Diaminobenzidine)溶液(20X)，混勻即可(DAB配好后需避光放置，30 min內(nèi)使用)；滴加適當(dāng)顯色劑于切片上，鏡下控色，記錄時(shí)間并保證各切片的顯色時(shí)間一致；染色完成后，切片置自來(lái)水中沖洗5min。
[0044](11)蘇木素復(fù)染:滴加適當(dāng)蘇木素(碧云天，上海，中國(guó))于切片上，復(fù)染時(shí)間約為0.5~3 min ；自來(lái)水沖洗5~10 min。
[0045](12)返藍(lán)、脫水、透明:若復(fù)染后過(guò)藍(lán)，可將切片置于1%鹽酸酒精中過(guò)一下；再依次于自來(lái)水、50%乙醇、70%乙醇、95%乙醇和無(wú)水乙醇中浸泡:T5 min ;最后將切片置于二甲苯中3 min。
[0046](13)封片:滴加適當(dāng)?shù)姆馄瑒?中性樹脂)(碧云天，上海，中國(guó))于切片上，將蓋玻片附著于封片劑上，讓封片劑擴(kuò)散至全部組織切片(避免產(chǎn)生氣泡)；再將封好的切片水平置于37°C烤箱中適當(dāng)烤干即可。
[0047](14)鏡下閱片:首先在ECLIPSE 80i顯微鏡(Nikon，Tokyo, Japan)的低倍鏡(100X)下觀察大體結(jié)果；找到感興趣的區(qū)域后，轉(zhuǎn)至高倍鏡(400X)觀察，并進(jìn)行照相和RFFL染色結(jié)果的評(píng)價(jià)。
[0048]12.免疫組化的染色評(píng)估方法如下:參考Michio Shimizu等(M.Shimizu, Y.Saitoh and H.1toh, Immunohistochemical staining of Ha-ras oncogene productin normal, benign, and malignant human pancreatic tissues.Hum Pathol, 1990.21 (6): 607飛12)報(bào)告的方法，在所有標(biāo)本的每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)視野，首先按照細(xì)胞染色強(qiáng)度計(jì)分:無(wú)染色記為0分，顯著的深度染色記為2分，染色程度居中的淺染色記為I分。其次按陽(yáng)性染色細(xì)胞所占的比例計(jì)分:無(wú)染色記為0分，1/3以下的局部染色記為I分，1/3以上至2/3以下的多個(gè)部位染色記為2分，2/3以上的絕大部分細(xì)胞彌漫性染色則記為3分。最后將兩者的評(píng)分相加，0分為(一),2分為(±),3分為(+),4分為( + +),5分為(+ + + )。定乂(一)和(土)為陰性表達(dá)(或低表達(dá))，(+)、( + + )和( + + + )為陽(yáng)性表達(dá)(或高表達(dá))。
[0049]13.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法:全部數(shù)據(jù)均使用IBM SPSS Statistics Version 19.0.0for Windows統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用配對(duì)樣本或者獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用X 2檢驗(yàn)。采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析RFFL的表達(dá)水平與肝癌臨床病理特征之間的相關(guān)性。采用Kaplan-Meier生存分析法計(jì)算肝癌患者手術(shù)后的總體生存率(Overall Survival)和無(wú)瘤生存率(Disease-free Survival)。采用Log-rank法比較各組間無(wú)瘤生存率和總體生存率的差異。采用逐步回歸法建立Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型，使用單因素和多因素法分析肝癌患者的臨床病理特征以及RFFL表達(dá)水平等因素對(duì)其手術(shù)后預(yù)后的影響；并確定影響肝癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，分別以P〈0.05和P>0.10作為引入和剔除影響因素的篩選界值。本研究中所有數(shù)據(jù)分析的檢驗(yàn)均為雙側(cè)檢驗(yàn)，且均以P〈0.05作為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性意義的檢驗(yàn)界值。
[0050]采用上述實(shí)驗(yàn)手段，具體地，發(fā)明人得到了如下結(jié)果:
RFFL mRNA在肝癌組織中的表達(dá)水平要顯著高于相應(yīng)的癌旁肝組織，通過(guò)Real-timePCR檢測(cè)25對(duì)肝癌組織及相應(yīng)的癌旁組織，引物設(shè)計(jì)如下=RFFL基因的上游引物序列為 SEQ ID NO:1 (5，-caccttgtccccagactttc-3’)，RFFL 基因的下游引物序列為 SEQ IDNO:2 (5，-gcctgctgattctcctgaac-3')，產(chǎn)物大小為 147bp。以 GAPDH 基因作為內(nèi)參，與RFFL基因在相同條件下進(jìn)行Real-time PCR反應(yīng)。GAPDH的上游引物序列為SEQ IDNO:3 (5’ -AGGTCGGAGTCAACGGAITTG-3’)，GAPDH 基因的下游引物序列為 SEQ ID NO:4(5’-GTGATGGCATGGACTGTGGT-3’)，產(chǎn)物大小為532 bp，所有引物均按100 y M濃度稀釋備用。按TOYOBO公司PCR試劑盒說(shuō)明書，建立50 u I PCR反應(yīng)體系如下:SYBR? GreenRealtime PCR MasterMix-Plus-25 u I ；Plus Solution 5 u I ;上游引物(lOuM) 2 u I ；下游引物(10 ii M) 2 u I ;所檢測(cè)樣品cDNA溶液5 u I ；dH20 Ilu 10 PCR反應(yīng)過(guò)程在ABIPrism 7300 Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)上完成。反應(yīng)條件為 95°C預(yù)變性 60 sec ；95°C 15 sec, 60 °C 15 sec, 72 °C 45 sec (樣本編號(hào)分別為 N81、N110、N78、N105、N66、N31、N18、N79、N60、N100、N21、N38、N43、N52、N121、N132、N107、N104、N109、N163、Nil、N30、N51、N93、N70)中 RFFL mRNA 水平(圖 1A);通過(guò)western-blot檢測(cè)肝癌組織及相應(yīng)的癌旁肝組織中RFFL蛋白表達(dá)水平,結(jié)果顯示RFFL蛋白在肝癌組織中的表達(dá)水平要顯著高于相應(yīng)的癌旁肝組織(圖1B);同時(shí)，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)RFFLmRNA和蛋白在肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平亦明顯高于正常肝細(xì)胞系(圖1C，D)。發(fā)明人進(jìn)一步采用免疫組織化學(xué)方法，對(duì)70例原發(fā)性肝細(xì)胞癌患者組織標(biāo)本中RFFL的表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)，并分析了 RFFL表達(dá)水平與肝癌臨床病理特征的相關(guān)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)RFFL表達(dá)水平與腫瘤血管浸潤(rùn)以及ncc分期密切相關(guān)0°〈0.05)，而腫瘤血管浸潤(rùn)和ncc分期是公認(rèn)的影響肝癌預(yù)后的指標(biāo)(表1)。免疫組織化學(xué)結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，RFFL蛋白在肝癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率和表達(dá)水平均明顯高于其鄰近非瘤肝組織。為了探討RFFL的表達(dá)與肝癌患者生存預(yù)后之間的關(guān)系，發(fā)明人對(duì)前述的70例肝癌患者進(jìn)行了臨床隨訪研究，獲得了肝癌患者手術(shù)后的生存時(shí)間及復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的資料。根據(jù)RFFL的免疫組化Michio Shimizu評(píng)分的結(jié)果，將70例肝癌標(biāo)本分為RFFL高表達(dá)組(陽(yáng)性表達(dá)組)和RFFL低表達(dá)組(陰性表達(dá)組)。采用Kaplan-Meier生存曲線法計(jì)算分析RFFL高表達(dá)組和低表達(dá)組患者手術(shù)后的生存情況，并以Log-rank法分別比較和檢驗(yàn)兩組之間總體生存率和無(wú)瘤生存率的差異。結(jié)果顯示，RFFL高表達(dá)組肝癌患者的總體生存率和無(wú)瘤生存率均明顯低于RFFL低表達(dá)組(圖2，3)。
[0051]表 I`
【權(quán)利要求】
1.一種評(píng)估肝細(xì)胞癌預(yù)后的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括用于特異性檢測(cè)RFFL表達(dá)水平或表達(dá)模式的試劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑包括用于特異性檢測(cè)RFFLmRNA表達(dá)水平或表達(dá)模式的RT-PCR引物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述RT-PCR引物的序列為SEQID NO:I 和 SEQ ID NO:2。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑用于特異性檢測(cè)RFFL所編碼的蛋白的表達(dá)水平或表達(dá)模式。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑包括:用于肝癌組織標(biāo)本石蠟包埋和切片的試劑，用于肝癌組織標(biāo)本石蠟切片的脫蠟和水化的試劑，用于抗原修復(fù)的檸檬酸抗原修復(fù)液，用于滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的雙氧水，用于封閉的封閉血清，山羊抗人RFFL蛋白多克隆抗體 、辣根酶標(biāo)記的兔抗山羊IgG抗體，用于顯色的DAB顯色劑和蘇木素，以及用于脫水、透明和封片的試劑。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述用于肝癌組織標(biāo)本石蠟切片的脫蠟和水化的試劑包括二甲苯、乙醇及蒸餾水。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述用于脫水、透明和封片的試劑包括乙醇、二甲苯及顯微鏡封片用中性樹脂。
8.RFFL作為分子標(biāo)志物在制備評(píng)估肝細(xì)胞癌預(yù)后的試劑盒中的應(yīng)用。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，所述試劑盒包括用于肝癌組織標(biāo)本石蠟包埋和切片的試劑，用于肝癌組織標(biāo)本石蠟切片的脫蠟和水化的試劑，用于抗原修復(fù)的檸檬酸抗原修復(fù)液，用于滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的雙氧水，用于封閉的封閉血清，山羊抗人RFFL蛋白多克隆抗體、辣根酶標(biāo)記的兔抗山羊IgG抗體，用于顯色的DAB顯色劑和蘇木素，以及用于脫水、透明和封片的試劑。
10.RFFL作為分子標(biāo)志物在體外評(píng)估肝細(xì)胞癌預(yù)后中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】G01N33/574GK103525916SQ201310449227
【公開日】2014年1月22日 申請(qǐng)日期:2013年9月24日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月24日
【發(fā)明者】徐江鋒, 劉細(xì)玉 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬義烏醫(yī)院