一種表征牛糞高溫堆肥過(guò)程中細(xì)菌類群數(shù)量變化的方法
【專利摘要】一種表征牛糞高溫堆肥過(guò)程中細(xì)菌類群數(shù)量變化的方法，以新鮮牛糞和植物秸稈為主要原料進(jìn)行高溫堆肥，采集不同堆肥時(shí)間段的樣品，制備得到堆肥水萃液，測(cè)定堆肥水萃液的水溶性有機(jī)碳(DOC)，并稀釋到DOC＜10mg／L，采集稀釋后水萃液的三維熒光光譜EEM圖譜，在Matlab7.0軟件上對(duì)采集到的三維熒光光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行去除瑞利和拉曼散射，確定激發(fā)／發(fā)射波長(zhǎng)為(250-280nm)／(350-380nm)組分的相對(duì)含量PIV，n，繪制堆肥過(guò)程PIV，n變化曲線，即可用于表征牛糞高溫堆肥過(guò)程中細(xì)菌類群數(shù)量變化。本發(fā)明可以快速、廉價(jià)地監(jiān)測(cè)牛糞高溫堆肥過(guò)程中細(xì)菌種類的演替，而且成本低廉，操作安全。
【專利說(shuō)明】一種表征牛糞高溫堆肥過(guò)程中細(xì)菌類群數(shù)量變化的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及固體廢棄物資源化利用領(lǐng)域，具體為一種表征牛糞高溫堆肥過(guò)程中細(xì) 菌類群數(shù)量變化的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 中國(guó)是一個(gè)農(nóng)業(yè)大國(guó)，每年約產(chǎn)生6000萬(wàn)噸養(yǎng)分資源的固體有機(jī)廢棄物，包括畜 禽糞便和農(nóng)作物秸桿等，如果不得到合理的利用而隨意處置將會(huì)對(duì)對(duì)水體、大氣、土壤和人 類健康造成負(fù)面影響。堆肥化過(guò)程是一種有效地處理農(nóng)業(yè)固體廢棄物的手段。堆肥化過(guò)程 是指將畜禽糞便和其他輔料按一定的比例混合后，利用堆肥物料中固有的微生物聯(lián)合作用 將有機(jī)物逐步降解生成小分子物質(zhì)、C02、H20、無(wú)機(jī)鹽以及高分子物質(zhì)腐殖酸，經(jīng)過(guò)高溫階段 的發(fā)酵，畜禽糞便中的病原菌和雜草種子全部殺滅，并且體積明顯減小，達(dá)到無(wú)害化、減量 化和資源化，是實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)有機(jī)廢棄物資源化的重要手段。
[0003] 微生物尤其是細(xì)菌在堆肥過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用，因?yàn)楫?dāng)堆體溫度高于50°C時(shí)，基本檢測(cè)不到真菌的存在，在低于45°C時(shí)則逐漸恢復(fù)。因此，對(duì)堆肥過(guò)程中細(xì)菌種類演 替的評(píng)估是非常必要的。有助于了解堆肥進(jìn)程，縮短堆肥周期。變性梯度凝膠電泳（DGGE)、 單鏈構(gòu)象多態(tài)性檢測(cè)（SSCP)技術(shù)、16SrRNA基因文庫(kù)技術(shù)、Microarray技術(shù)和454測(cè)序技 術(shù)是常用的分析堆肥過(guò)程中微生物類群演替的方法。由于操作簡(jiǎn)便、可同時(shí)比較多個(gè)樣品、 圖譜直觀明了，DGGE技術(shù)對(duì)于微生物群落結(jié)構(gòu)變化較大且迅速的堆肥快速發(fā)酵過(guò)程尤為合 適，因此被廣泛應(yīng)用。DGGE技術(shù)包括如下步驟：1)堆肥過(guò)程中不同階段堆肥樣品的采集；2) 使用DNA提取試劑盒進(jìn)行堆肥DNA的提取和純化；3)以純化后的堆肥DNA為模板進(jìn)行目的 片段的PCR擴(kuò)增；4)使用DNA純化試劑盒對(duì)擴(kuò)增到的目的片段進(jìn)行純化、回收；5)純化后 的DNA目的片段的變性梯度凝膠電泳分析。但是由于堆肥樣品含有高達(dá)30%-70%的有機(jī) 質(zhì)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于一般的環(huán)境樣品，給DNA的提取帶來(lái)了相當(dāng)?shù)碾y度。另外，由于堆肥化過(guò)程在 一定程度上也是有機(jī)質(zhì)的腐殖化過(guò)程，堆肥后期的樣品含有大量的腐殖酸，而腐殖酸與DNA 具有相似的結(jié)構(gòu)特征，在純化過(guò)程中不易去除，并且會(huì)對(duì)PCR過(guò)程造成一定的影響。然而， 使用DGGE技術(shù)分析堆肥樣品中細(xì)菌種類的變化，DNA的提取和純化以及PCR的擴(kuò)增是關(guān)鍵 步驟，難以避免，因此會(huì)在一定程度上影響微生物的多樣性分析。并且操作過(guò)程復(fù)雜，成本 商。
[0004] 三維突 光光譜(three-dimensional excitation emi ssion matrix fluorescence spectroscopy ;3D_EEM)是20世紀(jì)80年代在突光分析的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的 一種新的分析技術(shù)，相對(duì)于普通的熒光光譜，三維熒光光譜法能同時(shí)獲得熒光強(qiáng)度隨激發(fā) 波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)變化的關(guān)系，并且對(duì)于每一種不同的熒光物質(zhì)，都有其特有的三維熒光光 譜特征信息，所以三維熒光光譜法具有高選擇性，可用于多組分混合物的分析，并且由于三 維熒光光譜具有測(cè)定靈活和無(wú)需化學(xué)試劑的優(yōu)點(diǎn)，因此被廣泛的應(yīng)用于蛋白類物質(zhì)和腐殖 酸類物質(zhì)等的定性和定量分析，以及堆肥腐熟度的評(píng)價(jià)。區(qū)域劃分法則是非常有用的定量 分析EEM圖譜的方法。根據(jù)不同的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)，EEM圖譜可以分為5個(gè)不同的區(qū)域，區(qū) 域I和II在激發(fā)波長(zhǎng)< 250nm，發(fā)射波長(zhǎng)< 350nm的范圍內(nèi)，代表含有芳香族氨基酸殘基 (色氨酸）的多肽類物質(zhì)；區(qū)域III在激發(fā)波長(zhǎng)< 250nm，發(fā)射波長(zhǎng)> 350nm的范圍內(nèi)，代表 了富里酸類物質(zhì)；區(qū)域IV在激發(fā)波長(zhǎng)250280nm，發(fā)射波長(zhǎng)< 380nm的范圍內(nèi)，代表了可溶 性的微生物副產(chǎn)物；區(qū)域V在激發(fā)波長(zhǎng)在> 280nm，發(fā)射波長(zhǎng)在> 380nm的范圍內(nèi)，代表腐 殖酸類化合物。其中，PIV，n表征堆肥樣品中可溶性的微生物代謝副產(chǎn)物的相對(duì)含量，與堆 肥樣品中微生物的種類和數(shù)量息息相關(guān)，這就為使用三維熒光光譜技術(shù)評(píng)價(jià)堆肥過(guò)程中微 生物的多樣性提供了可能性。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所解決的技術(shù)問(wèn)題在于提供一種表征牛糞高溫堆肥過(guò)程中細(xì)菌類群數(shù)量 變化的方法，以解決上述【背景技術(shù)】中提出的問(wèn)題。
[0006] 本發(fā)明所解決的技術(shù)問(wèn)題采用以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)：
[0007] -種表征牛糞高溫堆肥過(guò)程中細(xì)菌類群數(shù)量變化的方法，包括以下步驟：
[0008] (1)原料預(yù)處理：
[0009] 以新鮮牛糞和稻草秸桿為主要原料，按一定的比例混合，使初始堆肥物料的主要 理化性質(zhì)滿足C/N:25-35 ;含水率：55% -60% ;有機(jī)質(zhì)：20% -80%;pH:5. 0-8. 0 ;
[0010] ⑵堆肥：
[0011] 用鏟車進(jìn)行初次翻堆后，用翻拋機(jī)進(jìn)行二次翻堆混勻物料，建成大小為寬X高 =2. 5mXI. 5m，長(zhǎng)度不限的條剁堆體，使用翻拋機(jī)前兩周每天翻堆一次，以后每五天翻堆一 次：
[0012] (3)采集堆肥樣品：
[0013] 按長(zhǎng)度將堆體平均分成三段，前段、中段和后段；在每段中分別選擇一個(gè)剖面，每 個(gè)剖面按高度分成三個(gè)部分：表面5-lOcm;中間50-60cm;底部100-120cm，每個(gè)高度采集 等量的堆肥樣品，然后將三個(gè)剖面所采集的九個(gè)樣品混勻，采用四分法取樣品三次，以保證 樣品的代表性，保存于4 °C冰箱；
[0014] (4)提取堆肥水萃液：
[0015] 堆肥結(jié)束后，稱取不同時(shí)間段的堆肥樣品Ig與IOmL去離子水在搖床上IOOrpm振 蕩24h得到堆肥水萃液，0. 45ym濾膜過(guò)濾去除懸浮物，然后利用總有機(jī)碳分析儀測(cè)定堆肥 水萃液的可溶性有機(jī)碳DOC并稀釋到0 < DOC < IOmg /L;
[0016] (5)測(cè)定三維熒光光譜：
[0017] 稀釋后的堆肥水萃液進(jìn)入三維熒光光譜儀的比色皿，設(shè)定的激發(fā)波長(zhǎng)波長(zhǎng)范圍為 200-500nm，發(fā)射波長(zhǎng)范圍為250-600nm，狹縫寬度為5nm，掃描速度為1200nm/min，運(yùn)行模 式為Scan模式，每隔2nm取一個(gè)點(diǎn)，每個(gè)樣品掃描后獲得三維熒光光譜圖及其對(duì)應(yīng)的三維 熒光光譜數(shù)據(jù)（176行X31列）。所得三維熒光光譜圖中激發(fā)波長(zhǎng)200-220nm的數(shù)據(jù)因儀 器噪音而刪去，刪去數(shù)據(jù)后的位置在數(shù)據(jù)表中顯示為缺值，每個(gè)樣品的三維熒光光譜數(shù)據(jù) 在Excel中的排列格式如下：
[0018]

【權(quán)利要求】
1. 一種表征牛糞高溫堆肥過(guò)程中細(xì)菌類群數(shù)量變化的方法，其特征是，包括以下步 驟： (1) 原料預(yù)處理： 以新鮮牛糞和稻草秸桿為主要原料，按一定的比例混合，使初始堆肥物料的主要理化 性質(zhì)滿足 C / N :25-35 ;含水率：55% -60% ;有機(jī)質(zhì)：20% -80% ;pH :5· 0-8. O ; (2) 堆肥： 用鏟車進(jìn)行初次翻堆后，用翻拋機(jī)進(jìn)行二次翻堆混勻物料，建成大小為寬X高= 2. 5mX I. 5m，長(zhǎng)度不限的條剁堆體，使用翻拋機(jī)前兩周每天翻堆一次，以后每五天翻堆一 次； (3) 采集堆肥樣品： 按長(zhǎng)度將堆體平均分成三段，前段、中段和后段；在每段中分別選擇一個(gè)剖面，每個(gè)剖 面按高度分成三個(gè)部分：表面5-lOcm ;中間50-60cm ;底部100-120cm，每個(gè)高度采集等量 的堆肥樣品，然后將三個(gè)剖面所采集的九個(gè)樣品混勻，采用四分法取樣品三次，以保證樣品 的代表性，保存于4°C冰箱； (4) 提取堆肥水萃液： 堆肥結(jié)束后，稱取不同時(shí)間段的堆肥樣品Ig與IOmL去離子水在搖床上IOOrpm振蕩 24h得到堆肥水萃液，0. 45 μ m濾膜過(guò)濾去除懸浮物，然后利用總有機(jī)碳分析儀測(cè)定堆肥水 萃液的可溶性有機(jī)碳DOC并稀釋到0 < DOC < IOmg / L ; (5) 測(cè)定三維熒光光譜： 稀釋后的堆肥水萃液進(jìn)入三維熒光光譜儀的比色皿，設(shè)定的激發(fā)波長(zhǎng)波長(zhǎng)范圍為 200-500nm，發(fā)射波長(zhǎng)范圍為250-600nm，狹縫寬度為5nm，掃描速度為1200nm / min，運(yùn)行模 式為Scan模式，每隔2nm取一個(gè)點(diǎn)，每個(gè)樣品掃描后獲得三維熒光光譜圖及其對(duì)應(yīng)的三維 熒光光譜數(shù)據(jù)（176行X31列）。所得三維熒光光譜圖中激發(fā)波長(zhǎng)200-220nm的數(shù)據(jù)因儀 器噪音而刪去，刪去數(shù)據(jù)后的位置在數(shù)據(jù)表中顯示為缺值，每個(gè)樣品的三維熒光光譜數(shù)據(jù) 在Excel中的排列格式如下： 樣品 1 2 3 :: 26 27 28 29 30 31 熒光 Al BI Cl :: Zl AAl BBl CCl DDl EEl 數(shù)據(jù) A2 B2 C2 :: Z2 AA2 BB2 CC2 DD2 EE2 A176 B176 C176 :: Z176 AA176 BB176 CC176 DD176 EE176 (6) 三維熒光數(shù)據(jù)的區(qū)域分析： 采集稀釋后水萃液的三維熒光光譜EEM圖譜，Matlab7. 0軟件上對(duì)采集到的三維熒光 光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行去除瑞利和拉曼散射：首先對(duì)樣品掃描后獲得的三維熒光光譜數(shù)據(jù)初一各自 樣品稀釋后獲得的DOC含量，用以減少不同樣品有機(jī)物濃度的差異對(duì)樣品的影響；然后，在 MatlAB7. 0軟件上用DOMFlour工具包去除瑞利和拉曼散射，通過(guò)依次鍵入如下命令實(shí)現(xiàn)： load matrix matrix=zeros(176, 31，' double'） for j=l:176
輸出數(shù)據(jù)即是去除了瑞利和拉曼散射的三維熒光數(shù)據(jù)； (7)繪制堆肥過(guò)程中P門η變化曲線： 使用 Chen et al. (2003) (Fluorescence Excitation-Emission Matrix Regional Integration to Quantify Spectra for Dissolved Organic Matter)介紹的區(qū)域劃分法 計(jì)算不同種類物質(zhì)的相對(duì)含量Pi,";繪制堆肥過(guò)程中？","變化曲線，即可用于表征牛糞高溫 堆肥過(guò)程中細(xì)菌種類數(shù)量的演替。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種表征牛糞高溫堆肥過(guò)程中細(xì)菌類群數(shù)量變化的方法，其 特征是，所述使用PIV,n表征牛糞高溫堆肥過(guò)程中細(xì)菌類群數(shù)量變化是通過(guò)變性梯度凝膠電 泳（DGGE)獲得的堆肥過(guò)程中細(xì)菌類群的數(shù)量變化。
【文檔編號(hào)】G01N21/64GK104515756SQ201310449917
【公開(kāi)日】2015年4月15日 申請(qǐng)日期:2013年9月29日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月29日
【發(fā)明者】田偉, 張振華, 汪貞, 王磊, 李剛 申請(qǐng)人:環(huán)境保護(hù)部南京環(huán)境科學(xué)研究所