切片用固定液的配置方法及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種切片用固定液的配置方法及其應(yīng)用，屬于臨床學(xué)應(yīng)用【技術(shù)領(lǐng)域】。其由甲醇、戊二醛、乙醚混合，用PBS緩沖液稀釋；在上述溶液中溶液添加蔗糖充分混合調(diào)整pH值制備得到。通過前處理、蔗糖放置、包埋、切片和洗滌處理組織。本發(fā)明工作進(jìn)程和步驟簡單，技術(shù)人員的操作工作量減少，整個(gè)過程操作步驟少，所需時(shí)間縮短，未經(jīng)脫水和浸蠟的組織能保持更高的新鮮度，針對免疫組化的抗原保持完整和優(yōu)秀，能提供更為正確的診斷條件，不需使用二甲苯等高度污染的有毒試劑，減輕環(huán)境污染，增強(qiáng)對技術(shù)人員的身體健康的保障。
【專利說明】切片用固定液的配置方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種切片用固定液的配置方法及其應(yīng)用，屬于臨床學(xué)應(yīng)用【技術(shù)領(lǐng)域】?！颈尘凹夹g(shù)】
[0002]病理組織學(xué)檢查已經(jīng)在醫(yī)學(xué)史上有了一百多年的使用歷史，通過病理組織切片檢查，對于許多病情，尤其是腫瘤等病的病情得以最終的確定診斷。但是隨著醫(yī)學(xué)的發(fā)展，在常規(guī)腫瘤病理診斷中，有很多的病例單靠H.E.染色難以作出明確的形態(tài)學(xué)診斷。
[0003]近年來，隨著臨床腫瘤的診斷和治療技術(shù)的發(fā)展，也隨著免疫組織化學(xué)技術(shù)的發(fā)展和各種特異性抗體的出現(xiàn)，使許多疑難腫瘤通過特殊的免疫組化就得到了更為明確的診斷。特別是某些疑難的腫瘤，如果不通過免疫組化技術(shù)就不能獲得正確診斷，或形成嚴(yán)重的誤診。因此免疫組化尤其在腫瘤診斷和鑒別診斷中的實(shí)用價(jià)值受到了普遍的認(rèn)識和重視，其在低分化或未分化腫瘤的鑒別診斷時(shí)，準(zhǔn)確率可達(dá)65%-85%甚至以上。
[0004]免疫組織化學(xué)的臨床應(yīng)用主要包括以下幾方面:
(O惡性腫瘤的診斷與鑒別診斷；
(2)確定轉(zhuǎn)移性惡性腫瘤的原發(fā)部位；
(3)對某類腫瘤進(jìn)行進(jìn)一步的病理分型；
(4)軟組織腫瘤的治療一般需根據(jù)正確的組織學(xué)分類，因其種類多、組織形態(tài)相像，有時(shí)難以區(qū)分其組織來源，應(yīng)用多種標(biāo)志進(jìn)行免疫組化研究對軟組織腫瘤的診斷是不可缺少的；
(5 )發(fā)現(xiàn)微小轉(zhuǎn)移灶,有助于臨床治療方案的確定,包括手術(shù)范圍的確定。
[0005](6)為臨床提供治療方案的選擇。
[0006]免疫組化在以前通常通過在石蠟切片或直接的冰凍切片上進(jìn)行，但由于石蠟切片要通過脫水和脫蠟的相關(guān)過程處理，在這一系列的處理過程中組織中抗原原性損失較大，有些有效的抗原原性甚至全部消失，雖經(jīng)過一些抗原修復(fù)的技術(shù)方法，但還是難以達(dá)到處理以前的水平，這樣使得石蠟切片免疫組化診斷存在巨大缺陷，其診斷結(jié)果常常不能正確體現(xiàn)病情，甚至有時(shí)形成誤導(dǎo)。而常規(guī)直接的冰凍切片，由于冷凍時(shí)組織內(nèi)含水分快速膨脹，形成的冰晶撐破細(xì)胞膜等生物膜性結(jié)構(gòu)，使得切片難以保持良好的形態(tài)，如此情況也會(huì)使得診斷的定位失去意義，甚至出現(xiàn)假陽性的可能。
[0007]本發(fā)明所切出的組織切片既能保證形態(tài)的完整性，基本上能夠達(dá)到與石蠟切片同等的效果，同時(shí)又保證抗原性的基本不丟失。
[0008]與石蠟切片比較，還能體現(xiàn)出技術(shù)簡單，整個(gè)操作的步驟少，工作量降低。
[0009]無乙醇，二甲苯等毒性較大的溶液使用，改善技術(shù)操作人員的工作環(huán)境，也無周圍空氣污染等特出的優(yōu)點(diǎn)。
[0010]有關(guān)這種切片新技術(shù)和材料，以及在免疫組化上的實(shí)際應(yīng)用，在江蘇省人民醫(yī)院的臨床病理實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行過試用，并得以證實(shí)。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0011]本發(fā)明的目的是克服上述不足之處，提供一種切片用固定液的配置方法及其應(yīng)用，其時(shí)間短，步驟簡單，工作量減少，無毒性試劑污染等優(yōu)點(diǎn)。
[0012]按照本發(fā)明提供的技術(shù)方案，是一種切片用固定液的配置方法，配方比例按重量份計(jì)步驟如下:甲醇10-20份，戊二醛10-25份，乙醚5-15份，用質(zhì)量濃度為5%的PBS緩沖液稀釋上述物質(zhì)至100份，形成溶液；在上述溶液中每IL溶液添加蔗糖300-500g，充分混合，形成混合液；再在混合液中用lmol/L的氫氧化鈉或lmol/L的鹽酸調(diào)整pH值最終至
8.0-9.3 ο
[0013]所述切片用固定液的應(yīng)用，具體步驟如下:
(1)前處理:組織取材后直接放置于固定液內(nèi)浸泡過夜固定，每ImL固定液浸泡一個(gè)組織標(biāo)本；組織標(biāo)本為l*lcm大小，1-2mm厚；
(2)蔗糖放置:將步驟(I)所得組織固定標(biāo)本從固定液中取出，置于質(zhì)量濃度為30%-50%的蔗糖水溶液中放置l_12h ；
(3)包埋:將步驟(2)所得組織浸入冰凍切片包埋劑OCT中浸透，放置l_24h；
(4)切片:步驟(3)所得組織冰凍切片機(jī)直接切片，并直接在冰凍切片機(jī)上沾片；
(5)洗滌:將切片后的組織經(jīng)質(zhì)量濃度為0.05%-0.10%，pH為7.4-8.6的標(biāo)準(zhǔn)磷酸緩沖液內(nèi)沖洗一次，隨即可以進(jìn)行染色或免疫組化試驗(yàn)。
[0014]所述固定液的成分中:甲醇和戊二醛增強(qiáng)固定效果，乙醚加強(qiáng)滲透和穿透性，蔗糖增強(qiáng)組織透明度，PBS緩沖液保持溶液的酸堿度穩(wěn)定，氫氧化鈉和鹽調(diào)配酸堿度。
[0015]本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明使用這種固定液就能將待檢的病理組織不經(jīng)脫水浸蠟，直接在水溶解的條件下進(jìn)行冰凍病理組織切片。這比較傳統(tǒng)的石蠟切片方法有如下優(yōu)點(diǎn):工作進(jìn)程和步驟簡單，技術(shù)人員的操作工作量減少，整個(gè)過程操作步驟少，所需時(shí)間縮短，未經(jīng)脫水和浸蠟的組織能保持更高的新鮮度，針對免疫組化的抗原保持完整和優(yōu)秀，能提供更為正確的診斷條件，不需使用二甲苯等高度污染的有毒試劑，減輕環(huán)境污染，增強(qiáng)對技術(shù)人員的身體健康的保障。
【具體實(shí)施方式】
[0016]實(shí)施例1，一種切片用固定液的配置方法，配方比例按重量份計(jì)步驟如下:
甲醇10份，戊二醛10份，乙醚5份，用質(zhì)量濃度為5%的PBS緩沖液稀釋上述物質(zhì)至100份；在上述溶液中每IL溶液添加蔗糖300g，充分混合；充分混合后用lmol/L的氫氧化鈉或lmol/L的鹽酸調(diào)整pH值最終至8.0。
[0017]實(shí)施例2，一種切片用固定液的配置方法，配方比例按重量份計(jì)步驟如下:
甲醇20份，戊二醛25份，乙醚15份，用質(zhì)量濃度為5%的PBS緩沖液稀釋上述物質(zhì)至100份；在上述溶液中每IL溶液添加蔗糖500g，充分混合；充分混合后用lmol/L的氫氧化鈉或lmol/L的鹽酸調(diào)整pH值最終至9.3。
[0018]實(shí)施例3，一種切片用固定液的配置方法，配方比例按重量份計(jì)步驟如下:
甲醇15份，戊二醛20份，乙醚10份，用質(zhì)量濃度為5%的PBS緩沖液稀釋上述物質(zhì)至100份；在上述溶液中每IL溶液添加蔗糖400g，充分混合；充分混合后用lmol/L的氫氧化鈉或lmol/L的鹽酸調(diào)整pH值最終至9。[0019]應(yīng)用實(shí)施例1，所述切片用固定液的應(yīng)用，具體步驟如下:
(1)前處理:對肺癌腫瘤組織取材后直接放置于固定液內(nèi)浸泡過夜固定，每ImL固定液浸泡一個(gè)組織標(biāo)本；組織標(biāo)本為l*lcm大小，Imm厚；
(2)蔗糖放置:將步驟(I)所得組織固定標(biāo)本從固定液中取出，置于質(zhì)量濃度為30%的蔗糖水溶液中放置Ih ；
(3)包埋:將步驟(2)所得組織浸入冰凍切片包埋劑OCT中浸透，放置12h；
(4)切片:步驟(3)所得組織冰凍切片機(jī)直接切片，并直接在冰凍切片機(jī)上沾片；
(5)洗滌:將切片后的組織經(jīng)質(zhì)量濃度為0.10%,pH為7.4的標(biāo)準(zhǔn)磷酸緩沖液內(nèi)沖洗一次，隨即可以進(jìn)行染色或免疫組化試驗(yàn)。
[0020]使用本固定液的新方法，可以通過具有不同抗體針對性的免疫組化技術(shù)，對各種肺癌的組織分型和腫瘤來源進(jìn)行鑒定和區(qū)分。例如:非小細(xì)胞肺癌的來源是支氣管上皮的鱗狀上皮細(xì)胞，為鱗狀上皮癌的組織分型。小細(xì)胞肺癌來自于淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原的陽性反應(yīng)，為淋巴瘤來源的惡性腫瘤類型。肺泡腺癌的來源在于腺上皮細(xì)胞和粘液性細(xì)胞，為腺上皮或粘液腺癌的類型細(xì)胞。有一種惡性程度比較高的“燕麥”樣細(xì)胞肺癌，通過免疫組化可以發(fā)現(xiàn)是體現(xiàn)出一種惡黑樣細(xì)胞的抗原陽性，可以確定來源于皮膚上的惡性黑色素細(xì)胞瘤的轉(zhuǎn)移或誘發(fā)。有些肺部腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)間皮瘤抗原表現(xiàn)，這是典型的結(jié)締組織來源的間質(zhì)腫瘤。某些邊緣型肺癌呈現(xiàn)纖維細(xì)胞的抗原表型，可以確定為來自肺包膜，即胸膜腫瘤的情況。
[0021]各種肺癌發(fā)生來源確定對病情的判斷和預(yù)后，以及今后的治療方案確定具有重大的關(guān)聯(lián)，而明確的肺癌類型診斷也是目前胸腔外科臨床病理的一個(gè)重大難題。而本發(fā)明所述應(yīng)用和免疫診斷技術(shù)也就是為肺癌診斷進(jìn)行了一些巨大的改進(jìn)，對肺癌的臨床診斷和治療具有很大的推進(jìn)作用，對肺癌的臨床診斷和治療現(xiàn)狀具有很大的實(shí)際意義。
[0022]應(yīng)用實(shí)施例2，所述切片使用的固定液的應(yīng)用，具體步驟如下:
(1)前處理:對乳房癌腫瘤組織取材后直接放置于固定液內(nèi)浸泡過夜固定，每ImL固定液浸泡一個(gè)組織標(biāo)本；組織標(biāo)本為l*lcm大小，2mm厚；
(2)蔗糖放置:將步驟(I)所得組織固定標(biāo)本從固定液中取出，置于質(zhì)量濃度為40%的蔗糖水溶液中放置5h ；
(3)包埋:將步驟(2)所得組織浸入冰凍切片包埋劑OCT中浸透，放置IOh；
(4)切片:步驟(3)所得組織冰凍切片機(jī)直接切片，并直接在冰凍切片機(jī)上沾片；
(5)洗滌:將切片后的組織經(jīng)質(zhì)量濃度為0.05%%，pH為8的標(biāo)準(zhǔn)磷酸緩沖液內(nèi)沖洗一次，隨即可以進(jìn)行染色或免疫組化試驗(yàn)。
[0023]乳房癌的診斷也涉及到很多的免疫組化問題。主要的是三種抗原，雌激素受體，孕激素受體，以及HER2抗原。前兩者一般抗原性強(qiáng)，在石蠟切片上就進(jìn)行了廣泛使用。但是還是存在著很多的假陽性和假陰性。后者則抗原反應(yīng)不是很強(qiáng)，一般情況下目前臨床只是作為診斷的參考指標(biāo)。使用本發(fā)明所述應(yīng)用和免疫組化診斷后，雌激素受體和孕激素受體的反應(yīng)可以進(jìn)一步增強(qiáng)和提高，免疫組化的水平可以說基本上能夠杜絕假陽性和假陰性的干擾。而HER2的免疫組化，就能將原來不可確定的水平標(biāo)準(zhǔn)提高到基本能夠確定做診斷的標(biāo)準(zhǔn)。這個(gè)抗原其實(shí)對乳房癌的發(fā)生發(fā)展和組織來源的確定其科學(xué)意義很大，只是以前不能充分地檢測確定，所以其意義沒有更多地被認(rèn)識到和運(yùn)用到。[0024]應(yīng)用實(shí)施例3，所述切片使用的固定液的應(yīng)用，具體步驟如下:
(1)前處理:對淋巴組織取材后直接放置于固定液內(nèi)浸泡過夜固定，每ImL固定液浸泡一個(gè)組織標(biāo)本；組織標(biāo)本為l*lcm大小，1.5mm厚；
(2)蔗糖放置:將步驟(I)所得組織固定標(biāo)本從固定液中取出，置于質(zhì)量濃度為40%的蔗糖水溶液中放置12h ；
(3)包埋:將步驟(2)所得組織浸入冰凍切片包埋劑OCT中浸透，放置24h；
(4)切片:步驟(3)所得組織冰凍切片機(jī)直接切片，并直接在冰凍切片機(jī)上沾片；
(5)洗滌:將切片后的組織經(jīng)質(zhì)量濃度為0.8%，pH為8的標(biāo)準(zhǔn)磷酸緩沖液內(nèi)沖洗一次，隨即可以進(jìn)行染色或免疫組化試驗(yàn)。
[0025]對淋巴瘤和白血病的認(rèn)識。由于人體血液內(nèi)各種功能性的細(xì)胞很多，不同的類型細(xì)胞都有其不同的功能，也攜帶多種細(xì)胞的不同抗原。即便到形成造血免疫系統(tǒng)的惡性腫瘤，也會(huì)形成對不同類型細(xì)胞來源的腫瘤需要進(jìn)行鑒別的要求。但是以前對于淋巴瘤和白血病腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞學(xué)鑒別診斷技術(shù)上一直存在技術(shù)手段的缺陷，使得對是否是淋巴造血系統(tǒng)惡性腫瘤，以及是那種淋巴造血系統(tǒng)惡性腫瘤，很多在具體針對性的病理細(xì)胞學(xué)診斷上不能正確地確定。這實(shí)際上也影響了這些腫瘤的正確治療。
[0026]使用本發(fā)明所述應(yīng)用，能夠?qū)κ欠袷橇馨驮煅到y(tǒng)惡性腫瘤，是哪個(gè)類型的淋巴造血系統(tǒng)惡性腫瘤，可以說有一個(gè)診斷上的明確的鑒別和鑒定。這對今后對這類疾病的診斷和治療能起到很直接和巨大的幫助作用，而且對今后新型的治療腫瘤的特效性藥物的發(fā)現(xiàn)和研發(fā)，以及今后的臨床實(shí)際使用，都可以說是意義非凡。
【權(quán)利要求】
1.一種切片用固定液的配置方法，其特征是配方比例按重量份計(jì)步驟如下: 甲醇10-20份，戊二醛10-25份，乙醚5-15份，用質(zhì)量濃度為5%的PBS緩沖液稀釋上述物質(zhì)至100份，形成溶液；在上述溶液中每IL溶液添加蔗糖300-500g，充分混合，形成混合液；再在混合液中用lmol/L的氫氧化鈉或lmol/L的鹽酸調(diào)整pH值最終至8.0-9.3。
2.權(quán)利要求1所述切片用固定液的應(yīng)用，其特征是具體步驟如下: (1)前處理:組織取材后直接放置于固定液內(nèi)浸泡過夜固定，每ImL固定液浸泡一個(gè)組織標(biāo)本；組織標(biāo)本為l*lcm大小，1-2mm厚； (2)蔗糖放置:將步驟(I)所得組織固定標(biāo)本從固定液中取出，置于質(zhì)量濃度為30%-50%的蔗糖水溶液中放置l_12h ； (3)包埋:將步驟(2)所得組織浸入冰凍切片包埋劑OCT中浸透，放置l_24h； (4)切片:步驟(3)所得組織冰凍切片機(jī)直接切片，并直接在冰凍切片機(jī)上沾片； (5)洗滌:將切片后的組織經(jīng)質(zhì)量濃度為0.05%-0.10%，pH為7.4-8.6的標(biāo)準(zhǔn)磷酸緩沖液內(nèi)沖洗一次，隨即可以進(jìn)行染色或免疫組化試驗(yàn)。
【文檔編號】G01N1/36GK103471903SQ201310453621
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年9月29日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月29日
【發(fā)明者】吳天驥 申請人:吳天驥