果汁中嗜酸耐熱菌的檢測(cè)方法及其誘導(dǎo)劑、顯色劑的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種果汁中嗜酸耐熱菌的檢測(cè)方法及其誘導(dǎo)劑、顯色劑。涉及的方法包括誘導(dǎo)培養(yǎng)和顯色檢測(cè)，其中誘導(dǎo)培養(yǎng)是利用誘導(dǎo)劑對(duì)待檢測(cè)果汁樣品進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)；顯色檢測(cè)是利用顯色劑與經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)后的待檢測(cè)果汁樣品進(jìn)行顯色反應(yīng)，經(jīng)顯色反應(yīng)后的反應(yīng)體系中出現(xiàn)琥珀色化合物，說明待檢測(cè)果汁樣品中含有嗜酸耐熱菌。涉及的誘導(dǎo)劑包括香草酸和培養(yǎng)基。涉及的顯色劑包括具有辣根過氧化物酶活性催化活性的DNA酶和雙氧水。本發(fā)明提出的基于DNA酶的快速比色檢測(cè)方法，通過構(gòu)建基于DNA酶的生物傳感的技術(shù)，實(shí)現(xiàn)對(duì)該菌現(xiàn)場(chǎng)快速的定性和定量檢測(cè)，具有較高的靈敏性和特異性。
【專利說明】果汁中嗜酸耐熱菌的檢測(cè)方法及其誘導(dǎo)劑、顯色劑
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及果汁中有害微生物的檢測(cè)技術(shù)，具體涉及用于檢測(cè)果汁中嗜酸耐熱菌的誘導(dǎo)劑、顯色劑及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]嗜酸耐熱菌是一種嗜酸、嗜熱、好氧的芽孢桿菌，是耐熱菌中主要的果汁污染菌，其芽孢能夠經(jīng)受酸性果汁加工中的巴氏滅菌而存活，當(dāng)其在條件適宜的時(shí)候，又可大量繁殖，引起果汁感官和品質(zhì)劣變。該菌主要污染蘋果汁、橙汁等濃縮果汁及果汁飲料，產(chǎn)生不良風(fēng)味物質(zhì)，致使果汁腐敗變質(zhì)，可導(dǎo)致生產(chǎn)上的經(jīng)濟(jì)損失。
[0003]目前，果汁中嗜酸耐熱菌檢測(cè)方法主要有利用細(xì)菌培養(yǎng)而達(dá)到不同微生物之間被分離的培養(yǎng)基分離鑒定，根據(jù)不同微生物之間的DNA和RNA序列不同產(chǎn)生的分子生物學(xué)檢測(cè)方法(如PCR技術(shù)、RT-PCR方法)，依據(jù)過氧化物酶催化化學(xué)反應(yīng)帶來的辣根過氧化物酶(HRP)檢測(cè)方法，還有依靠高端儀器檢測(cè)分離技術(shù)的紅外光譜檢測(cè)等。
[0004]在上述現(xiàn)有的嗜酸耐熱菌檢測(cè)技術(shù)中，應(yīng)用較多的是細(xì)菌分離培養(yǎng)和生化鑒定的方法，但該方法存在檢測(cè)指標(biāo)多、操作復(fù)雜、耗時(shí)、檢測(cè)結(jié)果滯后等缺點(diǎn)，導(dǎo)致在果汁生產(chǎn)過程中不能及時(shí)反饋果汁的污染狀況而采取相應(yīng)防措施。
[0005]此外，依靠像紅外光譜檢測(cè)一類的傳統(tǒng)儀器檢測(cè)具有檢測(cè)靈敏高，檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，但是大型儀器設(shè)備昂貴、需要具備相關(guān)知識(shí)的專業(yè)技術(shù)操作人員、存在檢測(cè)成本高昂、檢測(cè)結(jié)果較慢等缺點(diǎn)，極大限制了大型儀器設(shè)備的大規(guī)模應(yīng)用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的之一在于提供一種果汁中嗜酸耐熱菌的檢測(cè)方法，以解決現(xiàn)有的檢測(cè)方法存在的檢測(cè)速率低、特異性差和成本高的問題。
[0007]為此，本發(fā)明提供的果汁中嗜酸耐熱菌的檢測(cè)方法，其特征在于，包括以下步驟:
[0008]誘導(dǎo)培養(yǎng):利用誘導(dǎo)劑對(duì)待檢測(cè)果汁樣品進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)；所述誘導(dǎo)劑包括香草酸和培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基為402培養(yǎng)基、YSG培養(yǎng)基、BSSA培養(yǎng)基、BAT培養(yǎng)基或K氏培養(yǎng)基。
[0009]顯色檢測(cè):利用顯色劑與經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)后的待檢測(cè)果汁樣品進(jìn)行顯色反應(yīng)，經(jīng)顯色反應(yīng)后的反應(yīng)體系中出現(xiàn)琥珀色化合物，說明待檢測(cè)果汁樣品中含有嗜酸耐熱菌；所述顯色劑包括DNA酶和雙氧水。
[0010]所述香草酸和培養(yǎng)基的用量為:1毫升待檢測(cè)果汁樣品需使用0.1?0.17克的香草酸和100毫升培養(yǎng)基。
[0011 ] 所述DNA酶包括單鏈核酸序列5’ -GTGGGTAGGGCGGGTTGG-3’、氯化血紅素、氯化鉀或氯化銨、氯化鈉、PH為5的醋酸鈉-醋酸緩沖液。
[0012]所述雙氧水用量為:4mM雙氧水:50 μ L,
[0013]所述DNA酶的組份為:
[0014]0.3 μ M 單鏈核酸序列 5’-GTGGGTAGGGCGGGTTGG-3’:50μ L ；[0015]I μ M氯化血紅素:50 μ L ;
[0016]20mM 氯化鉀溶液:100 μ L ;
[0017]150mM 氯化鈉溶液:100 μ L ;
[0018]pH為5的醋酸鈉-醋酸緩沖液:600 μ L。
[0019]所述誘導(dǎo)培養(yǎng)的條件為:20?60°C，培養(yǎng)13?15個(gè)小時(shí)。
[0020]所述顯色檢測(cè)的條件為:20?30°C、15?45分鐘。
[0021]所述待檢測(cè)果汁樣品中的糖度為8?12° Brix。
[0022]進(jìn)一步，本發(fā)明提供的果汁中嗜酸耐熱菌的檢測(cè)方法包括以下步驟:
[0023]( I)制作嗜酸耐熱菌濃度與紫外吸收強(qiáng)度之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線:
[0024](2)測(cè)定待檢測(cè)果汁樣品中嗜酸耐熱菌的含量:包括利用上述誘導(dǎo)劑對(duì)待檢測(cè)果汁樣品進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，利用上述顯色劑與經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)后的待檢測(cè)果汁樣品進(jìn)行顯色反應(yīng)，檢測(cè)顯色反應(yīng)體系的紫外吸收值，和，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀取待檢測(cè)果汁樣品中嗜酸耐熱菌的含量。
[0025]本發(fā)明的又一目的在于提供一種用于檢測(cè)果汁中檢測(cè)嗜酸耐熱菌的誘導(dǎo)劑，該誘導(dǎo)劑為上述幾種誘導(dǎo)劑中的一種。
[0026]本發(fā)明的又一目的之一在于提供一種用于檢測(cè)果汁中檢測(cè)嗜酸耐熱菌的顯色劑，該顯色劑為上述幾種顯色劑的一種。
[0027]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果如下:
[0028]本發(fā)明提出的基于DNA酶(DNAzyme)的快速比色檢測(cè)方法，通過構(gòu)建基于DNA酶(DNAzyme)的生物傳感的技術(shù)，實(shí)現(xiàn)對(duì)該菌現(xiàn)場(chǎng)快速的定性和定量檢測(cè)，具有較高的靈敏性和特異性。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0029]圖1為不同菌濃度樣品誘導(dǎo)反應(yīng)時(shí)愈創(chuàng)木酚的代謝曲線；
[0030]圖2為實(shí)施例2中不同菌濃度對(duì)應(yīng)的顯色反應(yīng)結(jié)果；
[0031]圖3為實(shí)施例2中不同菌濃度菌對(duì)應(yīng)的顯色反應(yīng)體系的吸光度圖譜；
[0032]圖4為實(shí)施例2的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0033]本發(fā)明所述的DNA酶是指能夠在酸性條件下，催化過氧化氫氧化愈創(chuàng)木酚產(chǎn)生琥珀色化合物四聚愈創(chuàng)木酚的一種酶。
[0034]本發(fā)明所用的單鏈核酸序列5’ -GTGGGTAGGGCGGGTTGG-3’可以形成G四分體結(jié)構(gòu)，在氯化鉀存在條件下，這種G四分體可以結(jié)合氯化血紅素形成DNA酶(DNAzyme)。該酶可以催化雙氧水和愈創(chuàng)木酚之間的化學(xué)反應(yīng)。
[0035]本發(fā)明所使用的培養(yǎng)基具體可選用402培養(yǎng)基、YSG培養(yǎng)基、BSSA培養(yǎng)基、BAT培養(yǎng)基、K氏培養(yǎng)基等可用于培養(yǎng)嗜酸耐熱菌培養(yǎng)的培養(yǎng)基。其中固體培養(yǎng)基用于菌計(jì)數(shù)，液體培養(yǎng)基則用于菌的培養(yǎng)代謝。其中402培養(yǎng)基的配方如下:二水合氯化鈣0.25g、七水硫酸鎂0.50g、硫酸銨0.20g、磷酸二氫鉀3.00g、酵母浸提物2.00g、葡萄糖5.0Og ;七水硫酸鋅0.10g、四水氯化錳0.03g、硼酸0.30g、六水氯化亞鈷0.20g、二水氯化銅0.01g、六水合氯化鎳0.02g、鑰酸鈉0.03g ;無菌水IOOOmL ；
[0036]已知在添加有香草酸的培養(yǎng)基中，嗜酸耐熱菌可以利用香草酸進(jìn)行自身代謝活動(dòng)，產(chǎn)生愈創(chuàng)木酚。
[0037]酸性條件下，過氧化氫在DNAzyme的催化作用下氧化愈創(chuàng)木酚產(chǎn)生琥珀色化合物四聚愈創(chuàng)木酚。該琥珀色化合物四聚愈創(chuàng)木酚可用肉眼觀察，具體通過與空白對(duì)照管(空白對(duì)照為未添加香草酸導(dǎo)致最終沒有愈創(chuàng)木酚生成)觀察琥珀色。且該琥珀色化合物四聚愈創(chuàng)木酚在波長為420nm處具有較強(qiáng)的紫外可見光吸收峰，且其含量不同紫外吸收強(qiáng)度也不同。
[0038]由此，可通過將含有嗜酸耐熱菌的果汁樣品在適當(dāng)條件下培養(yǎng)后進(jìn)行顯色反應(yīng)，接著判斷反應(yīng)體系是否產(chǎn)生琥珀色化合物來實(shí)現(xiàn)對(duì)嗜酸耐熱菌的定量檢測(cè)。
[0039]發(fā)明人基于到上述機(jī)理，利用DNAzyme技術(shù)對(duì)果汁中的嗜酸耐熱菌進(jìn)行快速檢測(cè)。
[0040]首先，本發(fā)明人考慮如何才能誘導(dǎo)果汁中的嗜酸耐熱菌產(chǎn)生愈創(chuàng)木酚，設(shè)計(jì)了不同添加量的香草酸作為誘導(dǎo)劑，促使果汁中的嗜酸耐熱菌在培養(yǎng)中能夠產(chǎn)生愈創(chuàng)木酚而被DNA酶檢測(cè)。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)當(dāng)香草酸添加量小于0.1克(每100毫升培養(yǎng)基中)時(shí)，嗜酸耐熱菌能生長繁殖但是沒有愈創(chuàng)木酚產(chǎn)生，得出小于0.1克(每100毫升培養(yǎng)基中)的香草酸不能作為誘導(dǎo)劑添加量被使用；當(dāng)香草酸添加量大于0.17克(每100毫升培養(yǎng)基中)時(shí)，嗜酸耐熱菌不能生長繁殖也不能產(chǎn)生愈創(chuàng)木酚，得出大于0.17克(每100毫升培養(yǎng)基中)的香草酸也不能作為誘導(dǎo)劑添加量被使用；當(dāng)香草酸添加量在0.1?0.17克(每100毫升培養(yǎng)基中)時(shí)，嗜酸耐熱菌能正常生長并產(chǎn)生愈創(chuàng)木酚，可以用于DNA酶檢測(cè)。
[0041]為了進(jìn)一步確定具體誘導(dǎo)嗜酸耐熱菌產(chǎn)生愈創(chuàng)木酚的誘導(dǎo)反應(yīng)時(shí)間，無菌操作將嗜酸耐熱菌(DSM3922，保藏于德國菌種保藏中心)接種到液體402培養(yǎng)基中(IOOmL培養(yǎng)基中含0.17克香草酸作為誘導(dǎo)劑),45°C振蕩培養(yǎng)條件下培養(yǎng),培養(yǎng)過程中每間隔2h,無菌操作取ImL液體培養(yǎng)基，5000rpm離心5min，取上清液，測(cè)定在270nm處紫外吸收峰，作出培養(yǎng)時(shí)間與愈創(chuàng)木酚產(chǎn)生量的動(dòng)態(tài)監(jiān)控圖。如圖1所示，在0.17克香草酸作為誘導(dǎo)劑條件下，通過對(duì)培養(yǎng)嗜酸耐熱菌產(chǎn)生愈創(chuàng)木酚整個(gè)動(dòng)態(tài)過程進(jìn)行監(jiān)控，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，當(dāng)嗜酸耐熱菌培養(yǎng)14h后，不同初始菌濃度的嗜酸耐熱菌產(chǎn)生明顯不同量的愈創(chuàng)木酚，且此時(shí)間點(diǎn)(14h)產(chǎn)生的不同量的愈創(chuàng)木酚足以通過顯色反應(yīng)進(jìn)行判斷，為此，可以根據(jù)本發(fā)明提供的顯色方法進(jìn)行不同嗜酸耐熱菌菌濃度的定性定量檢測(cè)。另一方面，能夠保證在較短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)對(duì)嗜酸耐熱菌的快速檢測(cè)，本發(fā)明提供的培養(yǎng)嗜酸耐熱菌14h后檢測(cè)，有利于實(shí)現(xiàn)這種快速檢測(cè)的需求。因此，本發(fā)明選擇13?15h作為監(jiān)測(cè)點(diǎn)。
[0042]本發(fā)明利用顯色劑形成DNA酶的理論依據(jù)(在合適條件下，G富集的DNA堿基序列可以自發(fā)形成G四分體的結(jié)構(gòu)，當(dāng)存在鉀離子的條件下，鉀離子有助于穩(wěn)定這種G四分體結(jié)構(gòu)。一旦加入氯化血紅素，其將和鉀離子穩(wěn)定的G四分體結(jié)合，最終形成氯化血紅素-G-四分體的DNA酶)，通過調(diào)控反應(yīng)緩沖液pH值(如醋酸鈉-醋酸緩沖液)、氯化血紅素和G富集序列的濃度來影響DNAzyme形成和催化反應(yīng)。從而選擇合適的DNAzyme催化調(diào)控愈創(chuàng)木酚-雙氧水反應(yīng)體系，以利用反應(yīng)后產(chǎn)生琥珀色化合物的紫外吸收值，判斷DNAzyme在不同條件下催化愈創(chuàng)木酚-雙氧水反應(yīng)體系的氧化反應(yīng)效果。
[0043]以下是發(fā)明人提供的具體實(shí)施例，以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步解釋說明。[0044]實(shí)施例1:
[0045]該實(shí)施例是對(duì)果汁樣品中嗜酸耐熱菌的定性檢測(cè)。
[0046]該實(shí)施例的待檢測(cè)果汁樣品為夠買于果汁企業(yè)剛加工的糖度為70° Brix濃縮蘋果汁，用無囷水稀釋該果汁至糖度為8-12° Brix。
[0047]誘導(dǎo)劑為:100毫升402培養(yǎng)基+0.17g香草酸。
[0048]誘導(dǎo)培養(yǎng):將I毫升待檢測(cè)果汁樣品加入誘導(dǎo)劑中45°C條件下、搖床振蕩培養(yǎng)14h后，用無菌移液管取細(xì)菌培養(yǎng)液lmL，5000rpm離心5min，取上清液。
[0049]顯色劑為:DNAzyme與50 μ L的4mM的雙氧水。其中DNAzyme是將50 μ L的0.3 μ M單鏈核酸序列(5’ -GTGGGTAGGGCGGGTTGG-3’ )(購買于生工生物工程(上海)股份有限公司)、50 μ L的I μ M氯化血紅素、100 μ L的20mM氯化鉀溶液、100 μ L的150mM氯化鈉溶液添加到600 μ L的25mM醋酸鈉-醋酸緩沖液(pH5.0)中，孵育30min，形成DNAzyme。
[0050]顯色反應(yīng):50μ L獲得的上清液與顯色劑反應(yīng)15min。之后通過肉眼觀察反應(yīng)體系顏色變化，通過與空白對(duì)照管對(duì)比，發(fā)現(xiàn)反應(yīng)體系中有琥珀色化合物生成，說明果汁中含有嗜酸耐熱菌。
[0051]實(shí)施例2:
[0052]該實(shí)施例是對(duì)果汁樣品中嗜酸耐熱菌的定量檢測(cè)。
[0053]該實(shí)施例的待檢測(cè)果汁樣品、誘導(dǎo)劑、顯色劑與實(shí)施例1相同。
[0054]制作嗜酸耐熱菌濃度與紫外吸收強(qiáng)度之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線:
[0055]( I)準(zhǔn)備試驗(yàn)菌種樣品
[0056]無菌操作，將嗜酸耐熱菌(DSM3922，保藏于德國菌種保藏中心)菌株接種到三角瓶中，45°C條件下，上搖床振蕩培養(yǎng)24h，作為試驗(yàn)菌種樣品。
[0057](2)制備初始菌懸液
[0058]無菌操作,將(I)步驟中獲得的試驗(yàn)菌種樣品5000rpm離心5min,棄去上清液后，用IOmL無菌水混勻菌體，作為菌懸液。
[0059]無菌操作,移取菌懸液ImL,放入裝有9mL無菌水的試管中，使菌液充分振蕩混勻，使微生物細(xì)胞分散，靜置20~30s，即成10」稀釋液；再用ImL無菌吸管，吸取KT1稀釋液ImL,移入裝有9mL無菌水的試管中，吹吸3次，讓菌液混合均勻，即成10_2稀釋液；再換一支無菌吸管，吸取10_2稀釋液lmL，移入裝有9mL無菌水的試管中，也吹吸3次，即成10_3稀釋液；以此類推，連續(xù)稀釋，制成lO'lO'lO'lO'lO'lO—9等一系列稀釋菌液。再用三支Iml無菌吸管分別吸取10_4、10_5、和10_6的稀釋菌懸液各1ml，對(duì)號(hào)放入編好號(hào)的無菌平皿中，每個(gè)平皿放0.2ml。最后，將平板倒置于45°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，計(jì)算出菌懸液濃度為108cfu/mL，10_8稀釋菌液為初始菌懸液。
[0060](3)不同菌濃度樣品制備
[0061]無菌操作移取初始菌懸液lmL，放入裝有9mL無菌水的試管中，使菌液充分振蕩混勻，使微生物細(xì)胞分散，靜置20~30s，即成KT1稀釋液；再用ImL無菌吸管，吸取KT1稀釋液lmL，移入裝有9mL無菌水的試管中，吹吸3次，讓菌液混合均勻，即成10_2稀釋液；再換一支無菌吸管，吸取10_2稀釋液lmL，移入裝有9mL無菌水的試管中，也吹吸3次，即成10_3稀釋液；以此類推，連續(xù)稀釋，制成10_4、10_5、10' 10' 10_8、?ο-9等一系列稀釋菌液。得到105cfu/mL、104cfu/mL、103cfu/mL> 102cfu/mL 菌濃度。分別編好號(hào)，備用。[0062](4)誘導(dǎo)反應(yīng)
[0063]用ImL 無菌吸管分別吸取 105cfu/mL、104cfu/mL、103cfu/mL、102cfu/mL 等一系列稀釋菌液各lmL，分別添加到裝有等量誘導(dǎo)劑的三角瓶中，在45°C條件下，進(jìn)行該菌搖床培養(yǎng)，培養(yǎng)14h。
[0064](5)顯色反應(yīng)
[0065]取50 μ L經(jīng)誘導(dǎo)反應(yīng)后的嗜酸酸耐熱菌離心上清液添加到顯色劑中，孵育45min，觀察不同菌濃度樣品的顏色變化。如圖2所示，不同初始濃度的嗜酸耐熱菌最終在DNAzyme反應(yīng)體系中產(chǎn)生明顯區(qū)別于空白對(duì)照的琥珀色，且不同濃度的初始加入菌濃度的嗜酸耐熱菌產(chǎn)生顏色不一樣。
[0066](6)吸光度檢測(cè)
[0067]檢測(cè)不同菌濃度樣品顯色反應(yīng)體系的吸光度值，檢測(cè)結(jié)果如圖3所示。
[0068]以該實(shí)施例步驟(I)中不同濃度的嗜酸耐熱菌為橫坐標(biāo)，其相應(yīng)的顯色反應(yīng)體系紫外吸收值為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖4所示。
[0069]檢測(cè)實(shí)施例1中的顯色反應(yīng)體系的吸光度，利用該吸光度在圖4所示標(biāo)準(zhǔn)曲線上查取待檢測(cè)果汁樣品中菌的含量為112cfu/mL。
[0070]對(duì)比例:
[0071]該對(duì)比例是采用傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)分離方法對(duì)實(shí)施例1中的果汁樣品進(jìn)行檢測(cè)。
[0072](I)初始果汁實(shí)際樣品的液體培養(yǎng)
[0073]在無菌操作條件下，用無菌移液管移取ImL果汁樣品，加入液體402培養(yǎng)基中，在45°C條件下，上搖床振蕩培養(yǎng)18h后，5000rpm離心5min，棄去上清液，此時(shí)用IOmL無菌水稀釋管內(nèi)菌體，制成菌懸液備用。
[0074](2)菌懸液固體培養(yǎng)
[0075]無菌操作移取初始菌懸液lmL，放入裝有9mL無菌水的試管中，使菌液充分振蕩混勻，使微生物細(xì)胞分散，靜置20?30s，即成KT1稀釋液；再用ImL無菌吸管，吸取KT1稀釋液lmL，移入裝有9mL無菌水的試管中，吹吸3次，讓菌液混合均勻，即成10_2稀釋液；再換一支無菌吸管，吸取10_2稀釋液lmL，移入裝有9mL無菌水的試管中，也吹吸3次，即成10_3稀釋液；以此類推，連續(xù)稀釋，制成lO'lO'lO'lO'lO'lO—9等一系列稀釋菌液。再用三支Iml無菌吸管分別吸取10_4、10_5、和10_6的稀釋菌懸液各1ml，對(duì)號(hào)放入編好號(hào)的無菌平皿中，每個(gè)平皿放0.2ml。最后，將平板倒置于45°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，觀察平板中的菌落形態(tài)特征。
[0076](3)結(jié)果判定
[0077]平皿中有單菌落出現(xiàn)且出現(xiàn)菌落較大，邊緣光滑，突起，粘稠，易挑起，呈拉絲狀的菌落特征，判斷出果汁中含有嗜酸耐熱菌，與實(shí)施例1的檢測(cè)結(jié)果一致。
【權(quán)利要求】
1.果汁中嗜酸耐熱菌的檢測(cè)方法，其特征在于，包括以下步驟: 誘導(dǎo)培養(yǎng):利用誘導(dǎo)劑對(duì)待檢測(cè)果汁樣品進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)；所述誘導(dǎo)劑包括香草酸和培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基為402培養(yǎng)基、YSG培養(yǎng)基、BSSA培養(yǎng)基、BAT培養(yǎng)基或K氏培養(yǎng)基。 顯色檢測(cè):利用顯色劑與經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)后的待檢測(cè)果汁樣品進(jìn)行顯色反應(yīng)，當(dāng)反應(yīng)體系中出現(xiàn)琥珀色化合物時(shí)說明待檢測(cè)果汁樣品中含有嗜酸耐熱菌；所述顯色劑包括DNA酶和雙氧水。
2.如權(quán)利要求1所述的果汁中嗜酸耐熱菌的檢測(cè)方法，其特征在于，所述香草酸和培養(yǎng)基的用量為:1毫升待檢測(cè)果汁樣品需使用0.1~0.17克的香草酸和100毫升培養(yǎng)基。
3.如權(quán)利要求1所述的果汁中嗜酸耐熱菌的檢測(cè)方法，其特征在于，所述DNA酶包括單鏈核酸序列5’ -GTGGGTAGGGCGGGTTGG-3’、氯化血紅素、氯化鉀或氯化銨、氯化鈉、pH為5的醋酸鈉-醋酸緩沖液。
4.如權(quán)利要求1所述的果汁中嗜酸耐熱菌的檢測(cè)方法，其特征在于， 所述雙氧水用量為:4mM雙氧水:50μ L， 所述DNA酶的組份為:
0.3 μ M 單鏈核酸序列 5’ -GTGGGTAGGGCGGGTTGG-3’:50μ L ； I μΜ氯化血紅素:50yL ; 20mM氯化鉀溶液:100yL ; 150mM氯化鈉溶液=IOOyL ； pH為5的醋酸鈉-醋酸緩沖液:600 μ L。
5.如權(quán)利要求1所述的果汁中嗜酸耐熱菌的檢測(cè)方法，其特征在于，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)的條件為:20~60°C，培養(yǎng)13~15個(gè)小時(shí)。
6.如權(quán)利要求1所述的果汁中嗜酸耐熱菌的檢測(cè)方法，其特征在于，所述顯色檢測(cè)的條件為:20~30°C、15~45分鐘。
7.如權(quán)利要求1所述的果汁中嗜酸耐熱菌的檢測(cè)方法，其特征在于，所述待檢測(cè)果汁樣品中的糖度為8~12° Brix。
8.果汁中嗜酸耐熱菌的檢測(cè)方法，其特征在于，方法包括以下步驟: (O制作嗜酸耐熱菌濃度與紫外吸收強(qiáng)度之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線: (2)測(cè)定待檢測(cè)果汁樣品中嗜酸耐熱菌的含`量:包括利用權(quán)利要求1或2所述的誘導(dǎo)劑對(duì)待檢測(cè)果汁樣品進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，利用權(quán)利要求1、3或4所述的顯色劑與經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)后的待檢測(cè)果汁樣品進(jìn)行顯色反應(yīng)，檢測(cè)顯色反應(yīng)體系的紫外吸收值，和，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀取待檢測(cè)果汁樣品中嗜酸耐熱菌的含量。
9.一種用于檢測(cè)果汁中檢測(cè)嗜酸耐熱菌的誘導(dǎo)劑，其特征在于，該誘導(dǎo)劑為權(quán)利要求1和2所述誘導(dǎo)劑中的一種。
10.一種用于檢測(cè)果汁中檢測(cè)嗜酸耐熱菌的顯色劑，其特征在于，該顯色劑為權(quán)利要求`1、3和4所述顯色劑中的一種。
【文檔編號(hào)】G01N33/52GK103487571SQ201310456069
【公開日】2014年1月1日 申請(qǐng)日期:2013年9月28日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月28日
【發(fā)明者】王建龍, 劉濤, 岳田利, 袁亞紅, 李忠宏, 張道宏, 劉偉 申請(qǐng)人:西北農(nóng)林科技大學(xué)