中蜂囊狀幼蟲病毒抗體的elisa檢測方法
【專利摘要】一種中蜂囊狀幼蟲病毒抗體的ELISA檢測方法，用碳酸鹽緩沖液作為包被液將純化的中蜂囊狀幼蟲病毒抗原稀釋至工作濃度，加入酶標(biāo)板的酶標(biāo)孔內(nèi)，溫育，密封培養(yǎng)過夜；棄掉上層液體，洗滌；向酶標(biāo)孔內(nèi)加入封閉液，密封溫育或密封培養(yǎng)過夜，洗滌；將待檢卵黃抗體進(jìn)行倍比稀釋，棄掉上層液體，洗滌；加入標(biāo)記的兔抗雞IgG進(jìn)行反應(yīng)；棄掉上層液體，洗滌；加入底物顯色液，加入終止液，終止反應(yīng)；用酶標(biāo)儀在490nm～599nm下測定OD值，確定抗體效價(jià)。該檢測方法具有使用簡便、敏感性高、檢測成本低、生物安全度高的特點(diǎn)，可以評價(jià)制備的中蜂囊狀幼蟲病毒抗體的效價(jià)，確保臨床上用量的準(zhǔn)確性，達(dá)到預(yù)期治療效果，避免藥物浪費(fèi)或用量不足。
【專利說明】中蜂囊狀幼蟲病毒抗體的ELISA檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種中蜂囊狀幼蟲病毒抗體的ELISA檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002]中華蜜蜂，又稱中華蜂、中蜂、土蜂，其抗寒抗敵害能力強(qiáng)，在寒冷的冬季也可以給植物授粉，因此，中蜂對保持我國植物生態(tài)系統(tǒng)特別是冬季開花的植物具有不可替代的作用，研究表明，如果中蜂滅絕，我國有30%的植物將要隨之滅絕。
[0003]目前，為了加強(qiáng)中蜂產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，在全國建立了中蜂保護(hù)區(qū)。然而，中蜂囊狀幼蟲病具有蔓延快的特點(diǎn)，一旦中蜂囊狀幼蟲病發(fā)生，就會(huì)迅速蔓延，給中蜂種群造成了毀滅性的打擊，使中蜂損失嚴(yán)重。
[0004]CN102504023A公開了一種卵黃抗體的制備方法,該卵黃抗體能用于制備防治中蜂囊狀幼蟲病的藥物，但對抗中蜂囊狀幼蟲病病毒抗體的效價(jià)評估，還沒有相應(yīng)的檢測方法，抗中蜂囊狀幼蟲病病毒抗體的效價(jià)評估不準(zhǔn)確，導(dǎo)致卵黃抗體使用過量而浪費(fèi)或卵黃抗體用量不足致使治療效果不能達(dá)到預(yù)期，直接制約了中蜂囊狀幼蟲病病毒抗體(卵黃抗體)的應(yīng)用和研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種中蜂囊狀幼蟲病毒抗體的ELISA檢測方法，可評價(jià)制備的中蜂囊狀幼蟲病毒抗體的效價(jià)，以確定給藥量，達(dá)到預(yù)期治療效果，避免藥物浪費(fèi)。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)解決方案是:
一種中蜂囊狀幼蟲病毒抗體的ELISA檢測方法，其具體步驟如下:
1.1、用碳酸鹽緩沖液作為包被液將純化的中蜂囊狀幼蟲病毒抗原稀釋至工作濃度，加入酶標(biāo)板的酶標(biāo)孔內(nèi)，酶標(biāo)孔每孔加入量為50μl~100μl，抗原含量為55ng/孔~65ng/孔，溫育，密封培養(yǎng)過夜，上層為液體，包被抗原吸附在酶標(biāo)板上；
1.2.棄掉上層液體，用PBST緩沖液洗滌包被抗原，重復(fù)洗滌3次~5次，吸干水分；
1.3、向酶標(biāo)孔內(nèi)加入封閉液,每孔加入量為50μl~100μl,密封溫育或密封培養(yǎng)過夜，用PBST緩沖液洗滌包被抗原，重復(fù)洗滌3次~5次，吸干水分；
1.4、將待檢卵黃抗體按2的倍數(shù)進(jìn)行倍比稀釋，并依次加入酶標(biāo)孔，同時(shí)設(shè)陰性對照卵黃抗體、陽性對照卵黃抗體，每孔加入量為50μl~100μl，在36.5°C~37.5°C下反應(yīng)2h~3h，上層為液體，包被抗原與抗體復(fù)合物吸附在酶標(biāo)板上；
1.5、棄掉步驟1.4的上層液體，用PBST緩沖液洗滌被抗原與抗體復(fù)合物，重復(fù)洗滌3次~5次，吸干水分；
1.6、向酶標(biāo)孔內(nèi)加入稀釋的辣根過氧化酶標(biāo)記的兔抗雞1gG，每孔加入量為50μl，在36.5°C~37.5°C下反應(yīng)1h~1.5h后；棄掉上層液體，用PBST緩沖液進(jìn)行洗滌，重復(fù)洗滌3次~5次，吸干水分；1.7、向酶標(biāo)孔內(nèi)加入底物顯色液，每孔加入量為50μ?~?οομ?，在室溫下避光顯色I(xiàn)Omin~15min,加入終止液,每孔加入量為5μ?~ΙΟμ?,終止反應(yīng)；
1.8、用酶標(biāo)儀在490nm~599nm下測定OD值，OD值≤1.7854為陽性，OD值< 1.7854為陰性，步驟1.4中倍比稀釋測定OD值是陽性的最大稀釋倍數(shù)為抗體效價(jià)。
[0007]本發(fā)明的有益效果:
該檢測方法具有使用簡便，敏感性高，檢測成本低，生物安全度高等特點(diǎn)，可以評價(jià)制備的中蜂囊狀幼蟲病毒抗體的效價(jià)，確保臨床上用量的準(zhǔn)確性，達(dá)到預(yù)期治療效果，避免藥物浪費(fèi)或用量不足。
【具體實(shí)施方式】
[0008]實(shí)施例1
1.1、配制包被液(碳酸鹽緩沖液):碳酸鈉1.59g，碳酸氫鈉2.93g,加蒸餾水稀釋定容至 1000 mL，調(diào) PH 至 9.6 ;
用包被液將純化的中蜂囊狀幼蟲病毒抗原稀釋至工作濃度，加入酶標(biāo)板的酶標(biāo)孔內(nèi)，酶標(biāo)孔每孔加入量為50μ?,抗原含量為55ng/孔,在37°C下溫育Ih后,在4°C下密封培養(yǎng)過夜，上層為液體，包被抗原吸附在酶標(biāo)板上；
1.2.配制PBST緩沖液:氯化鈉8g，氯化鈉:0.2g,磷酸二氫鉀0.2g,磷酸氫二鈉(12個(gè)結(jié)晶水)2.9g，Tween-20 0.5 mL,加蒸餾水稀釋定容至1000 mL,調(diào)PH至7.4 ;
棄掉上層液體，用PBST緩沖液洗滌包被抗原，重復(fù)洗滌3次，吸干水分；
1.3、配制封閉液:5克脂奶粉用PBST溶解，定溶至100ml;
向酶標(biāo)孔內(nèi)加入封閉液，每孔加入量為50μ?，在37°C下密封溫育lh，用PBST緩沖液洗滌包被抗原，重復(fù)洗滌3次，吸干水分；
1.4、將待檢卵黃抗體按2的倍數(shù)進(jìn)行倍比稀釋，并依次加入酶標(biāo)孔，同時(shí)設(shè)陰性對照卵黃抗體、陽性對照卵黃抗體，每孔加入量為50μ?，在36.5°C下反應(yīng)3h，上層為液體，包被抗原與抗體復(fù)合物吸附在酶標(biāo)板上；
1.5、棄掉步驟1.4的上層液體，用PBST緩沖液洗滌被抗原與抗體復(fù)合物，重復(fù)洗滌3次，吸干水分；
1.6、向酶標(biāo)孔內(nèi)加入稀釋的辣根過氧化酶標(biāo)記的兔抗雞IgG，每孔加入量為50μ?，在
36.5°C下反應(yīng)1.5h后；棄掉上層液體，用PBST緩沖液進(jìn)行洗滌，重復(fù)洗滌3次，吸干水分；1.7、配制底物顯色液-M.lmol/L檸檬酸2.43mL, 0.2mol/L磷酸氫二鈉2.57mL,鄰苯二胺(OPD) 4mg,蒸懼水5mL, 30%過氧化氫IyL;
配制終止液(2mol/L硫酸):98%濃硫酸22.2 mL，緩慢加入蒸餾水177.8 mL ；
向酶標(biāo)孔內(nèi)加入底物顯色液，每孔加入量為50μ?，在室溫下避光顯色lOmin，加入終止液，每孔加入量為5μ?,終止反應(yīng)；
1.8、用酶標(biāo)儀在490nm~599nm下測定OD值，OD值≤1.7854為陽性，OD值< 1.7854為陰性，測定OD值是陽性的步驟1.4中倍比稀釋最大稀釋倍數(shù)為抗體效價(jià)。
[0009]實(shí)施例2
配制包被液、PBST緩沖液、封閉液、底物顯色液、終止液的方法及用量同實(shí)施例1 ;
1.1、用碳酸鹽緩沖液作為包被液將純化的中蜂囊狀幼蟲病毒抗原稀釋至工作濃度，加入酶標(biāo)板的酶標(biāo)孔內(nèi)，酶標(biāo)孔每孔加入量為１００μｌ，抗原含量為65ng/孔，在37°C下溫育Ih后,在4°C下密封培養(yǎng)過夜,上層為液體,包被抗原吸附在酶標(biāo)板上；
1.2.棄掉上層液體，用PBST緩沖液洗滌包被抗原，重復(fù)洗滌5次，吸干水分；
1.3、向酶標(biāo)孔內(nèi)加入封閉液，每孔加入量為１００μｌ，在4°C下密封培養(yǎng)過夜，用PBST緩沖液洗滌包被抗原，重復(fù)洗滌5次，吸干水分；
1.4、將待檢卵黃抗體按2的倍數(shù)進(jìn)行倍比稀釋，并依次加入酶標(biāo)孔，同時(shí)設(shè)陰性對照卵黃抗體、陽性對照卵黃抗體，每孔加入量為１００μｌ，在37.5°C下反應(yīng)2h，上層為液體，包被抗原與抗體復(fù)合物吸附在酶標(biāo)板上；
1.5、棄掉步驟1.4的上層液體，用PBST緩沖液洗滌被抗原與抗體復(fù)合物，重復(fù)洗滌5次，吸干水分；
1.6、向酶標(biāo)孔內(nèi)加入稀釋的辣根過氧化酶標(biāo)記的兔抗雞IgG，每孔加入量為50μ?，在
37.5°C下反應(yīng)Ih后；棄掉上層液體，用PBST緩沖液進(jìn)行洗滌，重復(fù)洗滌5次，吸干水分；
1.7、向酶標(biāo)孔內(nèi)加入底物顯色液，每孔加入量為１００μｌ，在室溫下避光顯色15min，加入終止液，每孔加入量為１０μｌ,終止反應(yīng)；
1.8、用酶標(biāo)儀在490nm~599nm下測定OD值，OD值≥1.7854為陽性，OD值< 1.7854為陰性，測定OD值是陽性的步驟1.4中倍比稀釋最大稀釋倍數(shù)為抗體效價(jià)。
[0010]實(shí)施例3
配制包被液、PBST緩沖液、封閉液、底物顯色液、終止液的方法及用量同實(shí)施例1 ;
1.1、用碳酸鹽緩沖液作為包被液將純化的中蜂囊狀幼蟲病毒抗原稀釋至工作濃度，加入酶標(biāo)板的酶標(biāo)孔內(nèi)，酶標(biāo)孔每孔加入量為80μ?，抗原含量為60ng/孔，在37°C下溫育Ih后,在4°C下密封培養(yǎng)過夜,上層為液體,包被抗原吸附在酶標(biāo)板上；
1.2.棄掉上層液體，用PBST緩沖液洗滌包被抗原，重復(fù)洗滌4次，吸干水分；
1.3、向酶標(biāo)孔內(nèi)加入封閉液，每孔加入量為80μｌ，在4°C下密封培養(yǎng)過夜，用PBST緩沖液洗滌包被抗原，重復(fù)洗滌4次，吸干水分；
1.4、將待檢卵黃抗體按2的倍數(shù)進(jìn)行倍比稀釋，并依次加入酶標(biāo)孔，同時(shí)設(shè)陰性對照卵黃抗體、陽性對照卵黃抗體，每孔加入量為80μ?，在37°C下反應(yīng)2.5h，上層為液體，包被抗原與抗體復(fù)合物吸附在酶標(biāo)板上；
1.5、棄掉步驟1.4的上層液體，用PBST緩沖液洗滌被抗原與抗體復(fù)合物，重復(fù)洗滌4次，吸干水分；
1.6、向酶標(biāo)孔內(nèi)加入稀釋的辣根過氧化酶標(biāo)記的兔抗雞IgG，每孔加入量為50μ?，在37°C下反應(yīng)Ih后；棄掉上層液體，用PBST緩沖液進(jìn)行洗滌，重復(fù)洗滌4次，吸干水分；
1.7、向酶標(biāo)孔內(nèi)加入底物顯色液，每孔加入量為80μｌ，在室溫下避光顯色12min，加入終止液，每孔加入量為58μｌ,終止反應(yīng)；
1.8、用酶標(biāo)儀在490nm~599nm下測定OD值，OD值≥1.7854為陽性，OD值< 1.7854為陰性，測定OD值是陽性的步驟1.4中倍比稀釋最大稀釋倍數(shù)為抗體效價(jià)。
[0011]一、敏感性試驗(yàn)
將中蜂囊狀幼蟲病毒(CSBV)標(biāo)準(zhǔn)陽性卵黃抗體做1:100~1:12800倍比稀釋，其余條件按最佳反應(yīng)條件進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果當(dāng)抗原按最佳包被濃度和條件進(jìn)行包被時(shí)，將CSBV陽性卵黃抗體分別做1:100~1:1280倍比稀釋，其余條件按最適反應(yīng)條件進(jìn)行間接ELISA。結(jié)果顯示，當(dāng)1:6400稀釋后仍可檢測為陽性，而1:12800稀釋的陽性卵黃抗體檢測結(jié)果低于
1.7854。
[0012]二、中蜂囊狀幼蟲病毒的ELISA檢測方法實(shí)際應(yīng)用
制備卵黃抗體時(shí)，分別在首次免疫后28天、35天和其他免疫前7天按10%比例隨機(jī)選取雞蛋，對每批雞蛋進(jìn)行效價(jià)測定，當(dāng)有效抗體效價(jià)在28以上后，收集所有雞蛋用水合法提取卵黃抗體IgY，并對提取的卵黃抗體IgY抗體按照實(shí)施例3進(jìn)行最終效價(jià)測定,根據(jù)測定的效價(jià)給出臨床上使用量。
[0013]三、間接ELISA陰性和陽性臨界值的確定
按上述建立的間接ELISA方法，對實(shí)驗(yàn)室保存的20份卵黃抗體進(jìn)行檢測，每份樣品重
復(fù)2孔，結(jié)果取其平均值，如表1所示，計(jì)算樣本OD值的平均值(i )和標(biāo)準(zhǔn)方差(OD)，
根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)的原則，陰陽性臨界值=平均數(shù)+3X標(biāo)準(zhǔn)方差，可以在99.9%的水平上判定為陽性。結(jié)果實(shí)驗(yàn)臨界值為1.7854，即待測樣品的OD值大于或者等于1.7854時(shí)為陽性，小于1.7854則為陰性。
[0014]表1.20份卵黃抗體OD值檢測結(jié)果
【權(quán)利要求】
1.一種中蜂囊狀幼蟲病毒抗體的ELISA檢測方法，其特征是: 具體步驟如下: 1.1、用碳酸鹽緩沖液作為包被液將純化的中蜂囊狀幼蟲病毒抗原稀釋至工作濃度，加入酶標(biāo)板的酶標(biāo)孔內(nèi)，酶標(biāo)孔每孔加入量為50μl~100μl，抗原含量為55ng/孔~65ng/孔，溫育，密封培養(yǎng)過夜，上層為液體，包被抗原吸附在酶標(biāo)板上； 1.2、棄掉上層液體，用PBST緩沖液洗滌包被抗原，重復(fù)洗滌3次~5次，吸干水分； 1.3、向酶標(biāo)孔內(nèi)加入封閉液,每孔加入量為5θμl~100μl,密封溫育或密封培養(yǎng)過夜，用PBST緩沖液洗滌包被抗原，重復(fù)洗滌3次~5次，吸干水分； 1.4、將待檢卵黃抗體按2的倍數(shù)進(jìn)行倍比稀釋，并依次加入酶標(biāo)孔，同時(shí)設(shè)陰性對照卵黃抗體、陽性對照卵黃抗體，每孔加入量為50μ?~ΙΟΟμ?，在36.5°C~37.5°C下反應(yīng)2h~3h，上層為液體，包被抗原與抗體復(fù)合物吸附在酶標(biāo)板上； 1.5、棄掉步驟1.4的上層液體，用PBST緩沖液洗滌被抗原與抗體復(fù)合物，重復(fù)洗滌3次~5次，吸干水分； 1.6、向酶標(biāo)孔內(nèi)加入稀釋的辣根過氧化酶標(biāo)記的兔抗雞IgG，每孔加入量為50μ?，在36.5°C~37.5°C下反應(yīng)Ih~1.5h后；棄掉上層液體，用PBST緩沖液進(jìn)行洗滌，重復(fù)洗滌3次~5次，吸干水分； 1.7、向酶標(biāo)孔內(nèi)加入底物顯色液，每孔加入量為50μl~100μl，在室溫下避光顯色1Omin~15min,加入終止液,每孔加入量為5μl~10μl,終止反應(yīng)； 1.8、用酶標(biāo)儀在490nm~599nm下測定OD值，OD值≥1.7854為陽性，OD值< 1.7854為陰性，測定OD值是陽性的步驟1.4中倍比稀釋最大稀釋倍數(shù)為抗體效價(jià)。
【文檔編號(hào)】G01N33/569GK103760344SQ201310457342
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2013年9月30日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月30日
【發(fā)明者】馬鳴瀟, 張大利, 韓喜斌, 袁小波, 樊瓊, 鄭洪玲, 鄭林, 李慧 申請人:遼寧醫(yī)學(xué)院