一種端粒酶活性檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種端粒酶活性檢測方法，包括如下步驟：第一步，利用CHAPS法提取待測細(xì)胞中的端粒酶；第二步，利用捕獲基底和待測端粒酶進(jìn)行延伸反應(yīng)，延伸反應(yīng)產(chǎn)物與報(bào)告標(biāo)簽溶液進(jìn)行雜交反應(yīng)；所述的捕獲基底為金殼包裹的四氧化三鐵納米粒子表面連接端粒酶底物；所述的報(bào)告標(biāo)簽為球形金納米粒子表面連接端?；パa(bǔ)序列和拉曼分子；第三步，雜交反應(yīng)產(chǎn)物通過比色法觀察顏色或采用SERS技術(shù)雙信號(hào)通道檢測得到SERS信號(hào)。本發(fā)明將比色法和SERS技術(shù)集成到同一端粒酶活性檢測體系中，利用比色法實(shí)現(xiàn)對樣品的快速定性分析，隨后采用SERS技術(shù)對樣品進(jìn)行精確的定量分析，兩種方法的結(jié)合實(shí)現(xiàn)了快速高靈敏的端粒酶活性檢測。
【專利說明】一種端粒酶活性檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及端粒酶活性檢測領(lǐng)域，具體是通過比色法和SERS技術(shù)雙信號(hào)通道檢測端粒酶活性。
【背景技術(shù)】
[0002]真核生物線性染色體末端由被稱作“端粒，，的DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物保護(hù)，避免染色體DNA的降解、末端融合、非正常重組等。由于DNA的末端復(fù)制問題，隨著細(xì)胞分裂，端粒DNA不斷縮短，細(xì)胞逐漸老化、喪失增殖能力并死亡。端粒酶是一種能以自身RNA為模板合成并延伸端粒序列，從而維持端粒長度和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的核糖核蛋白。端粒酶在正常體細(xì)胞中被抑制，只在干細(xì)胞和生殖細(xì)胞中表達(dá)。端粒酶的過度表達(dá)與細(xì)胞的永生化和癌變有著密切的關(guān)系。已有研究表明，85-90%的腫瘤細(xì)胞過度表達(dá)端粒酶。因此，端粒酶的激活在癌細(xì)胞獲得永生性的過程中起到重要作用，而抑制端粒酶的活性將殺死腫瘤細(xì)胞。這使得端粒酶成為一種新的腫瘤標(biāo)志物和抗癌藥物設(shè)計(jì)靶點(diǎn)，端粒酶活性是癌癥診斷和評估抗癌藥物效果的重要指標(biāo)之一。
[0003]基于端粒重復(fù)序列擴(kuò)增的TRAP法及其改進(jìn)版本是最常用的端粒酶活性檢測技術(shù)，它通過PCR擴(kuò)增端粒酶合成的端粒序列，大大提高了檢測靈敏度。但TRAP法費(fèi)時(shí)且要求高，易受諸多因素的制約而造成假陰性的結(jié)果。近年來，人們開發(fā)出了幾種無需PCR反應(yīng)的端粒酶活性測試技術(shù)，包括電化學(xué)法、比色法、化學(xué)發(fā)光法、表面等離子激元共振法、熒光共振能量轉(zhuǎn)移法等。盡管這些方法避開了 PCR反應(yīng)的缺點(diǎn)，卻或多或少依舊面臨著靈敏度低、程序復(fù)雜、成本高等不足。因此，設(shè)計(jì)出靈敏度高、準(zhǔn)確性好、適用性廣泛、可操作性強(qiáng)的端粒酶活性測試方法仍是基于端粒酶的癌癥診療中急需解決的問題。
[0004]比色法快速、簡單，其結(jié)果能直接通過裸眼觀察，是一種有效的檢測手段。然而，比色法一般難以實(shí)現(xiàn)較高的靈敏度。表面增強(qiáng)拉曼散射光譜(surface enhanced Ramanscattering, SERS)技術(shù)作為一種新興的生物標(biāo)記手段，是當(dāng)前國際上備受矚目的研究熱點(diǎn)。SERS —方面繼承了拉曼光譜的諸多優(yōu)點(diǎn)，如光信號(hào)不易漂白、對生物組織損傷小、光譜信息豐富等；另一方面，它彌補(bǔ)了傳統(tǒng)拉曼散射信號(hào)強(qiáng)度弱、不利于檢測的缺點(diǎn)。SERS光譜的“指紋”特性使人們能在復(fù)雜的生物環(huán)境中跟蹤、檢測目標(biāo)分子。此外，SERS效應(yīng)巨大的增強(qiáng)作用使基于SERS的光譜檢測具有超高的靈敏度，甚至可實(shí)現(xiàn)單分子水平的分析研究。SERS效應(yīng)產(chǎn)生在納米尺度粗糙的金屬表面，納米技術(shù)的飛速發(fā)展為構(gòu)筑多功能化的SERS納米探針提供了豐富的技術(shù)途徑。這些基于SERS光譜技術(shù)的納米探針在生物成像、核酸或蛋白檢測、腫瘤識(shí)別、藥物輸運(yùn)等諸多生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域展現(xiàn)出了優(yōu)異的應(yīng)用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種端粒酶活性檢測方法，通過比色法和SERS技術(shù)雙信號(hào)通道反應(yīng)端粒酶活性，一方面通過比色法，能快速定性地區(qū)分端粒酶活性不同的樣品，另一方面，通過SERS技術(shù)對樣品的端粒酶活性進(jìn)行精確的定量分析，解決了現(xiàn)有技術(shù)中端粒酶活性檢測靈敏度低、程序復(fù)雜、成本高等問題。
[0006]為解決上述問題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:
[0007]—種端粒酶活性檢測方法，通過比色法和SERS技術(shù)雙信號(hào)通道檢測端粒酶活性，包括如下步驟:
[0008]第一步，利用CHAPS法提取待測細(xì)胞中的端粒酶，得到待測端粒酶提取物；
[0009]第二步，利用捕獲基底和待測端粒酶進(jìn)行延伸反應(yīng)，延伸反應(yīng)產(chǎn)物與報(bào)告標(biāo)簽溶液進(jìn)行雜交反應(yīng)；所述的捕獲基底為金殼包裹的四氧化三鐵納米粒子表面連接端粒酶底物；所述的報(bào)告標(biāo)簽為球形金納米粒子表面連接端?；パa(bǔ)序列和拉曼分子；
[0010]第三步，雜交反應(yīng)產(chǎn)物通過比色法觀察顏色或采用SERS技術(shù)雙信號(hào)通道檢測得到SERS信號(hào)。
[0011]所述捕獲基底為核殼結(jié)構(gòu)，由內(nèi)核層、中間殼層、外殼層組成，所述內(nèi)核層為四氧化三鐵納米粒子，所述中間殼層為二氧化硅殼層，所述外殼層為金殼層；所述二氧化硅殼層表面修飾氨基，所述金殼層表面連接端粒酶底物。
[0012]所述四氧化三鐵納米粒子采用溶劑熱法制備，所述二氧化硅殼層采用改進(jìn)的Stdbcr法制備，所述金殼層采用種子生長法制備。
[0013]所述端粒酶底物的序列為5’ -SH (CH2) 6TTTTTTTTTTAATCCGTCGAGCAGAGTT-3’，如 SEQID N0.1所示；所述端粒酶底物通過金-硫鍵以共價(jià)方式連接在捕獲基底的金殼層表面。
[0014]所述球形金納米粒子采用檸檬酸鈉還原法制備。
[0015]所述端?；パa(bǔ)序列為5’ -CCCTAACCCTAAAAAA (CH2) 3SH_3’，如 SEQ ID N0.2 所示；所述端?；パa(bǔ)序列通過金-硫鍵以共價(jià)的方式連接在球形金納米粒子表面。
[0016]所述拉曼分子為5，5- 二硫代雙(2-硝基苯甲酸)，通過金-硫鍵以共價(jià)的方式連接在球形金納米粒子表面。
[0017]所述捕獲基底的制備方法，包括如下步驟:
[0018]第一步，采用溶劑熱法制備四氧化三鐵納米粒子；
[0019]第二步、采用改進(jìn)的Stdber法在第一步制備的四氧化三鐵納米粒子表面包裹二氧化娃殼層，再進(jìn)一步將二氧化娃殼層表面修飾氨基；
[0020]第三步、采用種子生長法在第二步制備的表面氨基修飾的二氧化硅殼層包裹的四氧化三鐵納米粒子表面包裹金殼層；
[0021]第四步、在第三步制備的金殼層包裹的四氧化三鐵納米粒子表面連接端粒酶底物，得到捕獲基底。
[0022]所述報(bào)告標(biāo)簽的制備方法，包括如下步驟:
[0023]第一步、采用檸檬酸鈉還原法制備球形金納米粒子；
[0024]第二步、在第一步制備的球形金納米粒子表面連接端粒互補(bǔ)序列和拉曼分子。
[0025]本發(fā)明的有益效果:
[0026]1、本發(fā)明利用具有顏色的球形金納米粒子作為報(bào)告標(biāo)簽，使端粒酶活性檢測結(jié)果裸眼可視，利于實(shí)現(xiàn)高通量的快速定性檢測。
[0027]2、本發(fā)明中，報(bào)告標(biāo)簽?zāi)芴峁㏒ERS信號(hào)，同時(shí)，結(jié)合捕獲基底的磁性富集作用，使該方法能實(shí)現(xiàn)高靈敏的端粒酶活性定量檢測。
[0028]3、本發(fā)明將比色法和SERS技術(shù)集成到同一端粒酶活性檢測體系中，利用比色法實(shí)現(xiàn)對樣品的快速定性分析，隨后采用SERS技術(shù)對樣品進(jìn)行精確的定量分析，兩種方法的結(jié)合實(shí)現(xiàn)了快速高靈敏的端粒酶活性檢測。
[0029]4、本發(fā)明的端粒酶活性檢測方法避免了 PCR反應(yīng)過程，大大簡化了端粒酶活性檢測步驟，同時(shí)也提高了檢測結(jié)果的可靠性。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0030]圖1是本發(fā)明提出的端粒酶活性檢測方法示意圖；
[0031]圖2是實(shí)施例1報(bào)告標(biāo)簽的消光光譜；
[0032]圖3是實(shí)施例1報(bào)告標(biāo)簽的SERS光譜；
[0033]圖4是實(shí)施例1最終磁性收集產(chǎn)物的消光光譜；
[0034]圖5是實(shí)施例1最終磁性收集產(chǎn)物的SERS光譜；
[0035]圖6是實(shí)施例2不同濃度腫瘤細(xì)胞對應(yīng)的最終磁性收集產(chǎn)物的SERS光譜?！揪唧w實(shí)施方式】
[0036]下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對本發(fā)明做更進(jìn)一步的解釋。下列實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，但并不用來限定發(fā)明的實(shí)施范圍。
[0037]一種端粒酶活性檢測方法，如圖1所示，通過比色法和SERS技術(shù)雙信號(hào)通道檢測端粒酶活性，包括如下步驟:
[0038]第一步，利用CHAPS法提取待測細(xì)胞中的端粒酶，得到待測端粒酶提取物；
[0039]第二步，利用捕獲基底和待測端粒酶進(jìn)行延伸反應(yīng)，延伸反應(yīng)產(chǎn)物與報(bào)告標(biāo)簽溶液進(jìn)行雜交反應(yīng)；所述的捕獲基底為磁性納米粒子，所述磁性納米粒子為金殼包裹的四氧化三鐵納米粒子，所述磁性納米粒子表面連接端粒酶底物；所述的報(bào)告標(biāo)簽為球形金納米粒子表面連接端?；パa(bǔ)序列和拉曼分子；
[0040]第三步，雜交反應(yīng)產(chǎn)物通過比色法觀察顏色或采用SERS技術(shù)雙信號(hào)通道檢測得到SERS信號(hào)。
[0041]當(dāng)樣品中有端粒酶時(shí)，端粒酶將在端粒酶底物上合成并延伸出端粒序列，所述端粒序列與球形金納米粒子表面的端?；パa(bǔ)序列雜交，使報(bào)告標(biāo)簽被捕獲基底捕獲。通過外加磁場收集捕獲基底及被其捕獲的報(bào)告標(biāo)簽。此時(shí)磁性產(chǎn)物中由于報(bào)告標(biāo)簽的存在，顏色和SERS信號(hào)將區(qū)別于單獨(dú)的捕獲基底。若樣品中無端粒酶，則捕獲基底上不會(huì)有延伸出的端粒序列，從而無法捕獲報(bào)告標(biāo)簽，磁性產(chǎn)物中只有捕獲基底。因此，通過觀察磁性產(chǎn)物的顏色和檢測磁性產(chǎn)物的SERS信號(hào)，可以實(shí)現(xiàn)端粒酶活性檢測。一方面通過比色法，能快速定性地區(qū)分端粒酶活性不同的樣品；另一方面，能通過SERS對樣品的端粒酶活性進(jìn)行精確的定量分析。
[0042]所述捕獲基底為核殼結(jié)構(gòu)，由內(nèi)核層、中間殼層、外殼層組成，所述內(nèi)核層為四氧化三鐵納米粒子，所述中間殼層為一薄層二氧化硅殼層，所述外殼層為致密的金殼層；所述二氧化硅殼層表面修飾氨基，所述金殼層表面連接端粒酶底物。所述四氧化三鐵納米粒子采用溶劑熱法制備，所述二氧化硅殼層采用改進(jìn)的SiSbcr法制備，所述金殼層采用種子生長法制備。所述端粒酶底物的序列為5’ -SH(CH2) JTTTTTTTTTAATCCGTCGAGCAGAGTT-3’，如SEQ ID N0.1所示；所述端粒酶底物通過金-硫鍵以共價(jià)方式連接在捕獲基底的金殼層表面。
[0043]所述球形金納米粒子采用檸檬酸鈉還原法制備；所述端粒互補(bǔ)序列為5’ -CCCTAACCCTAAAAAA(CH2)3SHUn SEQ ID N0.2所示；所述端粒互補(bǔ)序列通過金-硫鍵以共價(jià)的方式連接在球形金納米粒子表面。所述拉曼分子為DTNB，通過金-硫鍵以共價(jià)的方式連接在球形金納米粒子表面。
[0044]所述捕獲基底的制備方法，包括如下步驟:
[0045]第一步，采用溶劑熱法制備四氧化三鐵納米粒子；
[0046]第二步、采用改進(jìn)的SUiber法在第一步制備的四氧化三鐵納米粒子表面包裹二氧化娃殼層，再進(jìn)一步將二氧化娃殼層表面修飾氨基；
[0047]第三步、采用種子生長法在第二步制備的表面氨基修飾的二氧化硅殼層包裹的四氧化三鐵納米粒子表面包裹金殼層；
[0048]第四步、在第三步制備的金殼層包裹的四氧化三鐵納米粒子表面連接端粒酶底物，得到捕獲基底。
[0049]所述報(bào)告標(biāo)簽的制備方法，包括如下步驟:
[0050]第一步、采用檸檬酸鈉還原法制備球形金納米粒子；
[0051]第二步、在第一步制備的球形金納米粒子表面連接端?；パa(bǔ)序列和拉曼分子。
[0052]實(shí)施例1和2涉及的PBS緩沖液為pH=7.4，濃度為IOmM的PBS緩沖液。
[0053]實(shí)施例1
[0054]以5，5-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB)為拉曼分子，以人子宮頸癌細(xì)胞(HeLa)、人乳腺癌細(xì)胞(SKBR3、MCF7)和正常人胚肺成纖維細(xì)胞(MRC5)為待測細(xì)胞，利用本發(fā)明的方法進(jìn)行端粒酶活性檢測實(shí)驗(yàn)。
[0055]步驟一、制備四氧化三鐵納米粒子
[0056]采用溶劑熱法制備四氧化三鐵納米粒子。在80mL乙二醇中加入2.7g六水合氯化鐵(FeCl3.6Η20)，Ig聚乙二醇(PEG，分子量200)和3.6g醋酸鈉，攪拌半小時(shí)使之充分混合均勻。隨后將該混合溶液裝入聚四氟乙烯反應(yīng)釜中200°C反應(yīng)8小時(shí)。產(chǎn)物用磁性分離并用去離子水反復(fù)清洗，即得到四氧化三鐵納米粒子。將四氧化三鐵納米粒子分散至50mL去離子水中，用氬氣驅(qū)趕溶液中的氧氣后，密封4 °C保存待用。
[0057]步驟二、四氧化三鐵納米粒子表面包裹二氧化硅
[0058]采用改進(jìn)的St5bcr法包裹。取400 μ L步驟一中得到的四氧化三鐵納米粒子溶液，分散至10mL10mg/mL聚丙烯胺鹽酸鹽(ΡΑΗ，分子量15000)水溶液中，超聲Ih后磁性收集包裹了 PAH的四氧化三鐵納米粒子，并將收集的沉淀分散至10mL50mg/mL聚乙烯吡咯烷酮(PVP，分子量8000)水溶液中，將混合液超聲20min后振蕩12h，用磁性收集包裹了 PVP的四氧化三鐵納米粒子，并將其分散至IOmL含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.25%氨水的酒精中，加入10 μ L正硅酸四乙酯(TEOS)后振蕩10h，使二氧化硅逐漸生長至四氧化三鐵表面。用磁性收集包裹了二氧化硅的四氧化三鐵納米粒子，并用酒精反復(fù)清洗，隨后將二氧化硅包裹的四氧化三鐵納米粒子分散至IOmL酒精中，加入400 μ L3-氨丙基三甲氧基硅烷(APTMS)，100 μ L去離子水，振蕩12h后將該混合液置于70°C水浴中加熱2h。用磁性收集反應(yīng)產(chǎn)物即得表面修飾了氨基的二氧化硅包裹的四氧化三鐵納米粒子，最后將該產(chǎn)物分散至2mL酒精中。
[0059]步驟三、在步驟二中得到的氨基修飾的二氧化硅包裹的四氧化三鐵納米粒子表面生長一層致密的金殼,形成金殼包裹的磁性納米粒子
[0060]采用種子生長法包裹金殼。首先制備金種子溶液，在50mL去離子水中加入12 μ L四羥甲基氯化磷(THPC)和500 μ L0.1M NaOH溶液并劇烈攪拌lOmin，隨后加入200 μ L質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的氯金酸(HAuCl4)溶液，混合液的顏色迅速由淺黃色變?yōu)樯钭厣?，表明金種子已生成。得到的金種子溶液4°C保存48h后使用。在金種子溶液中加入ImL步驟二中得到的氨基修飾的二氧化硅包裹的四氧化三鐵納米粒子，振蕩12h后磁性收集即得到表面吸附了金種子的氨基修飾的二氧化硅包裹的四氧化三鐵納米粒子，并將其分散至200 μ L去離子水中。生長金殼之前先制備生長液，在50mL去離子水中加入12.5mg碳酸鉀(K2CO3)和75 μ L質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的HAuCl4溶液，振蕩至溶液呈無色。將200 μ L吸附了金種子的氨基修飾的二氧化硅包裹的四氧化三鐵納米粒子加入生長液中，超聲lmin。隨后在其中迅速加AlOOyL甲醛(HCHO)，混合液振蕩30min使金殼逐漸生長到粒子表面。最后通過磁性收集金殼包裹的四氧化三鐵納米粒子，并將其分散至2mL去離子水中。
[0061]步驟四、在步驟三中得到的金殼包裹的四氧化三鐵納米粒子表面連接端粒酶底物，得到捕獲基底
[0062]端粒酶底物序列如SEQ ID N0.1所示(5’ SH(CH2) 6修飾):
[0063]5’ -SH (CH2) 6TTTTTTTTTTAATCCGTCGAGCAGAGTT-3’
[0064]取800 μ LlO μ M溶解在PBS緩沖液中的端粒酶底物，在其中加入200 μ L步驟三中得到的金殼包裹的四氧化三鐵納米粒子。將該混合液超聲IOs后振蕩12h。隨后每隔Ih加入100 μ L0.6Μ溶解在PBS緩沖液中的NaCl溶液，共加10次。最后通過磁性收集連接了端粒酶底物的金殼包裹的四氧化三鐵納米粒子，即得捕獲基底，并將其分散在200 μ L TRAP緩沖液[20mM Tris-HCl, ρΗ8.3 ；1.5mM MgCl2 ；63mM KCl ;質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 0.005% 的 Tween20 ；lmM乙二醇-雙-(2-氨基乙醚)四乙酸(EGTA);0.lmg/mL牛血清白蛋白(BSA)]中，4°C保存待用。
[0065]步驟五、制備球形金納米粒子
[0066]在200mL去離子水中加入200uL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的HAuCl4溶液，劇烈攪拌并加熱至沸騰。隨后加入8mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的檸檬酸鈉水溶液，繼續(xù)加熱攪拌15min。停止加熱，攪拌至溶液冷卻至室溫，即得到酒紅色的球形金納米粒子溶液。
[0067]步驟六、在步驟五中得到的球形金納米粒子表面連接端?；パa(bǔ)序列和拉曼分子，得到報(bào)告標(biāo)簽
[0068]端粒互補(bǔ)序列如SEQ ID N0.2所示(3，(CH2)3SH修飾):
[0069]5’ -CCCTAACCCTAAAAAA (CH2) 3SH_3’
[0070]在3mL球形金納米粒子溶液中加入300 μ L20 μ M溶解在PBS緩沖液中的端?；パa(bǔ)序列，該混合溶液室溫靜置12h后，每隔Ih加入300 μ L含有0.6Μ NaCl和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%十二烷基硫酸鈉(SDS)的PBS緩沖液，共加10次。隨后加入3 μ LlOmM DTNB溶液，該混合液繼續(xù)靜置12h，隨后用8000rpm，30min離心清洗2次，沉淀分散至200 μ L含有0.6Μ NaCl的PBS緩沖液中，即得到報(bào)告標(biāo)簽溶液，將其4°C保存待用。
[0071]步驟七、端粒酶活性檢測實(shí)驗(yàn)
[0072]首先利用CHAPS法提取細(xì)胞中的端粒酶。IXlO6個(gè)對數(shù)生長期的細(xì)胞(HeLa，SKBR3，MCF7或者M(jìn)RC5)用冰PBS緩沖液離心清洗2次后分散至100 μ L RNA酶抑制劑處理過的冰鎮(zhèn)CHAPS裂解液[IOmM Tris-HCl,pH7.5 ；lmM MgCl2 ；lmM EGTA ；0.1mM苯甲基磺酰氟(PMSF) ;5πιΜβ -巰基乙醇；質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的3_[3_(膽酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸內(nèi)鹽(CHAPS);質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的甘油]中，冰上孵育30min后，將裂解液以12000rpm，20min離心，取出上清即得端粒酶提取物，端粒酶提取物于-75°C保存待用。
[0073]隨后進(jìn)行端粒酶活性檢測實(shí)驗(yàn)，首先進(jìn)行端粒延伸反應(yīng)。取20 μ L步驟四中得到的捕獲基底，與19 μ L TRAP緩沖液(同步驟四)、5 μ LlOmM dNTPsU μ L RNA酶抑制劑、5 μ L步驟七中得到的端粒酶提取物混合(空白對照組中端粒酶提取物用純CHAPS裂解液代替)。該混合液30°C振蕩3h進(jìn)行端粒延伸反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物用磁性收集并分散至50 μ L含有0.6ΜNaCl的PBS緩沖液中。之后進(jìn)行雜交反應(yīng)，取10 μ L步驟六中得到的報(bào)告標(biāo)簽溶液，加入端粒延伸反應(yīng)的產(chǎn)物中，該混合液室溫靜置2h，使報(bào)告標(biāo)簽與捕獲基底充分雜交，雜交產(chǎn)物用磁性收集并分散至10 μ L去離子水中，最后觀察其顏色或檢測其SERS信號(hào)。
[0074]本實(shí)施例步驟六中制備出的報(bào)告標(biāo)簽的消光光譜如圖2所示，其在520nm左右有一明顯的消光峰，這是球形金納米粒子的典型表面等離子體共振峰，這一消光峰的存在使得報(bào)告標(biāo)簽呈酒紅色，也是本發(fā)明中實(shí)現(xiàn)比色法檢測的重要基礎(chǔ)。該實(shí)施例步驟六中制備出的報(bào)告標(biāo)簽的SERS光譜如圖3所示，其SERS信號(hào)強(qiáng)，益于進(jìn)行SERS定量分析。圖4是步驟七中最終磁性收集產(chǎn)物的消光光譜，當(dāng)細(xì)胞提取物中有端粒酶時(shí)，產(chǎn)物在530nm左右產(chǎn)生顯著的消光峰，這一消光峰源自被捕獲基底捕獲的報(bào)告標(biāo)簽。而反應(yīng)體系中不含端粒酶時(shí)，產(chǎn)物消光光譜與捕獲基底的消光光譜吻合，即此時(shí)捕獲基底未能捕獲報(bào)告標(biāo)簽。消光光譜的差異能通過肉眼直接觀察，有端粒酶對應(yīng)的產(chǎn)物偏紅色，而無端粒酶的產(chǎn)物呈墨綠色(捕獲基底的顏色)。圖5是步驟七最終磁性收集產(chǎn)物的SERS光譜，可以看出，對應(yīng)于腫瘤細(xì)胞(HeLa、SKBR3、MCF7)的產(chǎn)物中檢測到了很強(qiáng)的SERS信號(hào)，而對應(yīng)于正常細(xì)胞(MRC5)和空白對照組的產(chǎn)物中未檢測到顯著的SERS信號(hào)。這是因?yàn)檫@三種腫瘤細(xì)胞高度表達(dá)端粒酶，而正常細(xì)胞不表達(dá)端粒酶。這一實(shí)施例表明，本發(fā)明提出的檢測方法能通過比色法和SERS雙通道實(shí)現(xiàn)端粒酶活性檢測。
[0075]實(shí)施例2
[0076]以5，5-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB)分子為拉曼分子，以人乳腺癌細(xì)胞(SKBR3)為待測細(xì)胞，利用本發(fā)明的方法進(jìn)行端粒酶活性定量檢測實(shí)驗(yàn)。
[0077]按照實(shí)施例1中步驟一至六準(zhǔn)備捕獲基底和報(bào)告標(biāo)簽。按照實(shí)施例1中步驟七所述CHAPS法提取SKBR3細(xì)胞中的端粒酶，將端粒酶提取物用RNA酶抑制劑處理過的冰鎮(zhèn)CHAPS裂解液稀釋至對應(yīng)1000個(gè)細(xì)胞/mL, 100個(gè)細(xì)胞/mL，10個(gè)細(xì)胞/mL，I個(gè)細(xì)胞/mL。端粒延伸反應(yīng)，取20 μ L捕獲基底，與19 μ L TRAP緩沖液(同實(shí)施例1步驟四)、5 μ LlOmMdNTPs、l μ L RNA酶抑制劑、不同細(xì)胞濃度的端粒酶提取物混合(空白對照組中端粒酶提取物用純CHAPS裂解液代替)?；旌弦?0°C振蕩3h進(jìn)行端粒延伸反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物用磁性收集并分散至50 μ L含有0.6Μ NaCl的PBS緩沖液中。取10 μ L報(bào)告標(biāo)簽溶液，加入端粒延伸反應(yīng)的產(chǎn)物中，混合液室溫靜置2h，使報(bào)告標(biāo)簽與捕獲基底充分雜交，雜交產(chǎn)物用磁性收集并分散至10 μ L去離子水中，最后觀察其顏色或檢測其SERS信號(hào)。
[0078]圖6是本實(shí)施例中得到的對應(yīng)于不同細(xì)胞濃度的磁性收集產(chǎn)物的SERS光譜，可以看出隨著細(xì)胞濃度增大，產(chǎn)物中的SERS信號(hào)也不斷增強(qiáng)，因此可以利用SERS信號(hào)實(shí)現(xiàn)定量檢測。本實(shí)施例中發(fā)現(xiàn)即使是I個(gè)細(xì)胞/mL的端粒酶活性也能被檢測到，實(shí)現(xiàn)了超高靈敏度的端粒酶活性檢測。另外，用裸眼觀察產(chǎn)物的顏色，發(fā)現(xiàn)對應(yīng)于1000個(gè)細(xì)胞/mL和100個(gè)細(xì)胞/mL的產(chǎn)物明顯偏紅色，而10個(gè)細(xì)胞/mL及其以下濃度對應(yīng)產(chǎn)物的顏色與空白對照組無法用裸眼區(qū)分。因此，該實(shí)施例中比色法的檢測靈敏度為100個(gè)細(xì)胞/mL。在實(shí)際應(yīng)用中，尤其是樣本量較大時(shí)，可以通過比色法快速篩選出端粒酶活性較高的樣品，其余端粒酶活性較低的樣品則可以通過SERS進(jìn)行精確定量檢測。采用這種方式能大大提高樣品檢測速度，利于實(shí)現(xiàn)高通量的生物分析。
【權(quán)利要求】
1.一種端粒酶活性檢測方法，通過比色法和SERS技術(shù)雙信號(hào)通道檢測端粒酶活性，其特征在于，包括如下步驟: 第一步，利用CHAPS法提取待測細(xì)胞中的端粒酶，得到待測端粒酶提取物； 第二步，利用捕獲基底和待測端粒酶進(jìn)行延伸反應(yīng)，延伸反應(yīng)產(chǎn)物與報(bào)告標(biāo)簽溶液進(jìn)行雜交反應(yīng)；所述的捕獲基底為金殼包裹的四氧化三鐵納米粒子表面連接端粒酶底物；所述的報(bào)告標(biāo)簽為球形金納米粒子表面連接端?；パa(bǔ)序列和拉曼分子； 第三步，雜交反應(yīng)產(chǎn)物通過比色法觀察顏色或采用SERS技術(shù)雙信號(hào)通道檢測得到SERS信號(hào)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的端粒酶活性檢測方法，其特征在于，所述捕獲基底為核殼結(jié)構(gòu)，由內(nèi)核層、中間殼層、外殼層組成，所述內(nèi)核層為四氧化三鐵納米粒子，所述中間殼層為二氧化娃殼層，所述外殼層為金殼層；所述二氧化娃殼層表面修飾氨基，所述金殼層表面連接端粒酶底物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的端粒酶活性檢測方法，其特征在于，所述四氧化三鐵納米粒子采用溶劑熱法制備，所述二氧化硅殼層采用改進(jìn)的Stdber法制備，所述金殼層采用種子生長法制備。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的端粒酶活性檢測方法，其特征在于，所述端粒酶底物的序列為 5’ -SH(CH2) 6TTTTTTTTTTAATCCGTCGAGCAGAGTT-3’，如 SEQ ID N0.1 所示；所述端粒酶底物通過金-硫鍵以共價(jià)方式連接在捕獲基底的金殼層表面。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的端粒酶活性檢測方法，其特征在于，所述球形金納米粒子采用檸檬酸鈉還原法制備。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的端粒酶活性檢測方法，其特征在于，所述端粒互補(bǔ)序列為5’ -CCCTAACCCTAAAAAA(CH2)3SHUn SEQ ID N0.2所示；所述端?；パa(bǔ)序列通過金-硫鍵以共價(jià)的方式連接在球形金納米粒子表面。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的端粒酶活性檢測方法，其特征在于，所述拉曼分子為5，5-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)，通過金-硫鍵以共價(jià)的方式連接在球形金納米粒子表面。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的端粒酶活性檢測方法，其特征在于，所述捕獲基底的制備方法，包括如下步驟: 第一步，采用溶劑熱法制備四氧化三鐵納米粒子； 第二步、采用改進(jìn)的St5bcr法在第一步制備的四氧化三鐵納米粒子表面包裹二氧化娃殼層，再進(jìn)一步將二氧化娃殼層表面修飾氨基； 第三步、采用種子生長法在第二步制備的表面氨基修飾的二氧化硅殼層包裹的四氧化三鐵納米粒子表面包裹金殼層； 第四步、在第三步制備的金殼層包裹的四氧化三鐵納米粒子表面連接端粒酶底物，得到捕獲基底。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的端粒酶活性檢測方法，其特征在于，所述報(bào)告標(biāo)簽的制備方法，包括如下步驟: 第一步、采用檸檬酸鈉還原法制備球形金納米粒子； 第二步、在第一步制備的球形金納米粒子表面連接端粒互補(bǔ)序列和拉曼分子。
【文檔編號(hào)】G01N21/78GK103529023SQ201310471824
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2013年10月11日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月11日
【發(fā)明者】王著元, 宗慎飛, 鐘嫄, 崔一平 申請人:東南大學(xué)