一種檢測桃蚜抗藥性的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種檢測桃蚜抗藥性的方法，在藥劑的診斷劑量下制作診斷玻璃管，快速檢測桃蚜田間種群對藥劑的抗性水平，所述藥劑為抗蚜威、聯(lián)苯菊酯、吡蟲啉或啶蟲脒；藥劑的診斷劑量：抗蚜威為10086.30ng/cm2，聯(lián)苯菊酯為2159.00ng/cm2，吡蟲啉為47.86ng/cm2，啶蟲脒為196.58ng/cm2。本發(fā)明方法使用簡便，結(jié)果直觀明了，適用于田間快速檢測桃蚜抗性水平，克服了傳統(tǒng)生測方法用樣本數(shù)量大、操作繁瑣、費(fèi)時(shí)等缺點(diǎn)，可用于快速檢測桃蚜田間種群抗性水平。
【專利說明】一種檢測桃蚜抗藥性的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種對農(nóng)業(yè)害蟲抗藥性進(jìn)行監(jiān)測的測定技術(shù)方法，具體地說，是以本發(fā)明的診斷劑量檢測桃蚜對四種殺蟲藥劑(抗蚜威，聯(lián)苯菊酯、吡蟲啉和啶蟲脒)抗藥性的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]桃蚜是世界上分布最廣最為重要的害蟲之一，可以在50多個(gè)科400多種植物上取食，不僅能夠直接刺吸植物營養(yǎng)，造成植物嚴(yán)重失水和營養(yǎng)不良，還可以傳播病毒，對植物造成更大的間接傷害，對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。長期以來，對桃蚜的防治主要以化學(xué)防治為主，由于化學(xué)殺蟲劑的大量、持續(xù)及不合理使用，致使許多國家和地區(qū)的桃蚜對常用殺蟲劑產(chǎn)生了不同程度的抗藥性。
[0003]桃蚜抗藥性的形成和發(fā)展給化學(xué)防治造成了很大困難，如何快速、準(zhǔn)確的檢測桃蚜抗藥性水平是非常重要的。現(xiàn)在用于抗藥性監(jiān)測的方法主要包括傳統(tǒng)的生物測定、生化檢測法、免疫學(xué)方法以及分子生物學(xué)方法。通常情況下，生物測定是最直接、最接近田間檢測的方法。
[0004]由于各種藥劑作用機(jī)理的不同，短時(shí)間內(nèi)昆蟲的中毒反應(yīng)也各不相同，因此利用這個(gè)特點(diǎn)發(fā)展的玻璃管藥膜診斷劑量，能夠快速檢測田間種群的抗性水平，這一應(yīng)用也是田間快速檢測抗性的重要手段。
[0005]毒力測定是室內(nèi)了解害蟲抗藥性常用的方法，但傳統(tǒng)的浸液法和點(diǎn)滴法進(jìn)行毒力測定，操作繁瑣，要設(shè)定若干濃度和重復(fù)，以保證結(jié)果的可信度。玻璃管藥膜法是新出現(xiàn)的一種快速檢測害蟲抗藥性的方法，由于其作用效果明顯，縮短了檢查結(jié)果的時(shí)間，但對于濃度和重復(fù)問題上仍然與傳統(tǒng)方法一樣，沒有改進(jìn)。利用本發(fā)明的診斷劑量，輔以玻璃管藥膜法，不僅利用了玻璃管藥膜法的快速檢測特點(diǎn)，而且在診斷劑量下可快速了解害蟲抗性，解決的傳統(tǒng)毒力測定實(shí)驗(yàn)繁瑣的程序，提高了效率，并可用于田間害蟲抗藥性的快速檢測。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種檢測桃蚜抗藥性的方法，在藥劑的診斷劑量下制作診斷玻璃管，檢測桃蚜田間種群對藥劑的抗性水平，所述藥劑為抗蚜威、聯(lián)苯菊酯、吡蟲啉和啶蟲脒；藥劑的診斷劑量:抗姆威為10086.30ng/cm2,聯(lián)苯菊酯為2159.00ng/cm2,卩比蟲啉為47.86ng/cm2, P定蟲脈為 196.58ng/cm2。
[0007]混合種群是各地采集桃蚜種群，混合后飼養(yǎng)多代，因此該種群中含有各抗性水平的桃蚜個(gè)體，在生測、酶活及分子水平上都表現(xiàn)有不同抗性，以該種群作為本發(fā)明實(shí)驗(yàn)種群，更接近田間種群，實(shí)驗(yàn)結(jié)果更可靠、更準(zhǔn)確。
[0008]其中，藥劑的診斷劑量是通過不同濃度的藥劑采用玻璃管藥膜法對室內(nèi)飼養(yǎng)混合種群進(jìn)行藥劑毒力測定，計(jì)算LC99作為藥劑的診斷劑量。
[0009]上述室內(nèi)飼養(yǎng)混合種群為采集各地桃蚜田間種群，混合后，室內(nèi)飼養(yǎng)多代得到。[0010]進(jìn)一步地，藥劑的診斷劑量是通過如下步驟確定的:
[0011](I)桃蚜田間種群的室內(nèi)飼養(yǎng):采集各地桃蚜田間種群，混合飼養(yǎng)多代，獲得室內(nèi)飼養(yǎng)混合種群；
[0012](2)丙酮稀釋四種殺蟲藥劑為不同的濃度梯度作為毒力測定濃度；
[0013](3)玻璃管藥膜的制作:用步驟(2)中丙酮稀釋的各梯度藥劑制作毒力測定所用的玻璃管藥膜，每管加入220 u L各濃度藥液，滾動(dòng)玻璃管至藥液均勻吸附在玻璃管內(nèi)壁，直至丙酮完全揮發(fā)；
[0014](4)毒力測定:用步驟(3)中制備的玻璃管進(jìn)行桃蚜的毒力測定，至少進(jìn)行三次生物學(xué)重復(fù)；
[0015](5)結(jié)果及診斷劑量:對步驟(4)的結(jié)果做毒力回歸曲線，并計(jì)算LC99得出各個(gè)藥劑的診斷劑量。
[0016]其中，步驟(2)中所用的殺蟲藥劑均為95%以上的原藥，并且用丙酮溶解，稀釋至5?7個(gè)濃度梯度。
[0017]其中，步驟(4)中每次毒力測定實(shí)驗(yàn)做三次簡單獨(dú)立重復(fù)。
[0018]其中，步驟(5)用POLO軟件計(jì)算結(jié)果及診斷劑量。
[0019]本發(fā)明的有益效果在于:
[0020]本發(fā)明方法使用簡便，結(jié)果直觀明了，適用于田間快速檢測桃蚜抗性水平，克服了傳統(tǒng)生測方法用樣本數(shù)量大、操作繁瑣、費(fèi)時(shí)等缺點(diǎn)，可用于快速檢測桃蚜田間種群抗性水平。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0021]圖1為實(shí)驗(yàn)所用玻璃管。
[0022]圖2為實(shí)驗(yàn)選用的無翅成蚜。
[0023]圖3為產(chǎn)生中毒癥狀的桃蚜。
【具體實(shí)施方式】
[0024]以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
[0025]實(shí)施例1診斷劑量的獲得
[0026]1.研究對象
[0027]本發(fā)明的研究對象為實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)多代的各地桃蚜混合種群。
[0028]2.方法
[0029]供試藥劑抗蚜威、聯(lián)苯菊酯、吡蟲啉和啶蟲脒，用玻璃管藥膜法，進(jìn)行毒力測定。
[0030]2.1原藥母液的配置及稀釋
[0031]將原藥溶解于丙酮中，定容后裝于藥劑瓶中，封口膜封口，保存于4°C冰箱中。
[0032]毒力測定前，用丙酮將原藥母液稀釋到各濃度，備用。
[0033]2.2玻璃管藥膜的制作
[0034]實(shí)驗(yàn)所用玻璃管(如圖1所示)必須經(jīng)過嚴(yán)格的洗滌，確保沒有任何藥物殘留。從稀釋好的藥液中吸取220 u L加入到直徑1.7cm,高7.5cm的玻璃管(內(nèi)表面積40cm2)中，滾動(dòng)玻璃管至藥液均勻吸附在玻璃管內(nèi)壁，直至丙酮完全揮發(fā)，對照單獨(dú)用丙酮處理，制作好的玻璃管藥膜室溫下過夜使用。
[0035]2.3毒力測定供試蚜蟲的選擇
[0036]選用室內(nèi)飼養(yǎng)的桃蚜種群，挑取健康一致的無翅成蚜(如圖2所示)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，每個(gè)制備好的藥膜管放置20頭蚜蟲，在室內(nèi)正常飼養(yǎng)條件下(溫度20?25°C，相對濕度50%?75%，光照 16L:8D)。
[0037]2.4檢查結(jié)果及死亡標(biāo)準(zhǔn)的判斷
[0038]3h后檢查結(jié)果，其中只有一條腿動(dòng)或者完全不動(dòng)的記為死(如圖3所示)，以對照死亡率小于10%為有效測定，并用對照死亡率進(jìn)行校正。每個(gè)藥劑6?7個(gè)濃度，每個(gè)濃度3次重復(fù)，數(shù)據(jù)處理采用POLO分析軟件，計(jì)算LC99,即診斷劑量，該診斷劑量可用于快速檢測桃蟲牙田間種群對抗蚜威、聯(lián)苯菊酯、吡蟲啉和啶蟲脒的抗性水平。
[0039]藥劑的診斷劑量為抗姆威10086.3ng/cm2,聯(lián)苯菊酯2159.0ng/cm2,卩比蟲啉47.9ng/cm2,卩定蟲月米 196.6ng/cm2。
[0040]實(shí)施例2診斷劑量對桃蚜抗藥性檢測
[0041]1.研究對象
[0042]本實(shí)例研究對象為田間待測種群。
[0043]2.方法
[0044]供試藥劑抗蚜威、聯(lián)苯菊酯、吡蟲啉和啶蟲脒，利用本發(fā)明診斷劑量制作玻璃管藥膜，田間進(jìn)行桃蚜抗性水平的檢測。
[0045]2.1原藥母液的配置及稀釋
[0046]將原藥溶解于丙酮中，用丙酮將原藥母液稀釋實(shí)例I得到的診斷劑量，備用。
[0047]2.2玻璃管藥膜的制作
[0048]實(shí)驗(yàn)所用玻璃管(如圖1所示)必須經(jīng)過嚴(yán)格的洗滌，確保沒有任何藥物殘留。從稀釋好的藥液中吸取220 μ L加入到直徑1.7cm,高7.5cm的玻璃管(內(nèi)表面積40cm2)中，滾動(dòng)玻璃管至藥液均勻吸附在玻璃管內(nèi)壁，直至丙酮完全揮發(fā)，，對照單獨(dú)用丙酮處理，制作好的玻璃管藥膜室溫下過夜使用。
[0049]2.3田間抗性診斷
[0050]田間挑選大小一致的無翅成蚜置于2.2制作玻璃管中，每管20頭，3h后觀察死亡率,死亡率低于99%的種群為抗性種群。
[0051]利用本發(fā)明的診斷劑量進(jìn)行田間抗性診斷，不但大大減少了傳統(tǒng)毒力測定的繁瑣步驟，而且用于田間的快速檢測也方便可靠，解決了傳統(tǒng)毒力測定方法用蟲量大的問題，也解決了田間操作問題，簡單易操作。用于田間實(shí)時(shí)檢測抗性，了解抗性水平，進(jìn)而指導(dǎo)田間用藥。
[0052]實(shí)施例3傳統(tǒng)玻璃管藥膜法對田間桃蚜進(jìn)行抗藥性的測定。
[0053]1.研究對象
[0054]本實(shí)例研究對象為田間待測種群。
[0055]2.方法
[0056]供試藥劑抗姆威、聯(lián)苯菊酯、批蟲啉和唳蟲脒,用玻璃管藥膜法,進(jìn)行毒力測定。
[0057]2.1原藥母液的配置及稀釋
[0058]將原藥溶解于丙酮中，定容后裝于藥劑瓶中，封口膜封口，保存于4°C冰箱中。[0059]毒力測定前，用丙酮將原藥母液稀釋到各濃度，備用。
[0060]2.2玻璃管藥膜的制作
[0061]實(shí)驗(yàn)所用玻璃管(如圖1所示)必須經(jīng)過嚴(yán)格的洗滌，確保沒有任何藥物殘留。從稀釋好的藥液中吸取220 u L加入到直徑1.7cm,高7.5cm的玻璃管(內(nèi)表面積40cm2)中，滾動(dòng)玻璃管至藥液均勻吸附在玻璃管內(nèi)壁，直至丙酮完全揮發(fā)，對照單獨(dú)用丙酮處理，制作好的玻璃管藥膜室溫下過夜使用。
[0062]2.3毒力測定供試蚜蟲的選擇
[0063]選用室內(nèi)飼養(yǎng)的桃蚜種群，挑取健康一致的無翅成蚜(如圖2所示)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，每個(gè)制備好的藥膜管放置20頭蚜蟲，在室內(nèi)正常飼養(yǎng)條件下(溫度20?25°C，相對濕度50%?75%，光照 16L:8D)。
[0064]2.4檢查結(jié)果及死亡標(biāo)準(zhǔn)的判斷
[0065]3h后檢查結(jié)果，其中只有一條腿動(dòng)或者完全不動(dòng)的記為死(如圖3所示)，以對照死亡率小于10%為有效測定，并用對照死亡率進(jìn)行校正。每個(gè)藥劑6?7個(gè)濃度，每個(gè)濃度
3次重復(fù)，數(shù)據(jù)處理采用POLO分析軟件。
[0066]傳統(tǒng)玻璃管藥膜生測方法，操作步驟繁瑣，每次生測重復(fù)操作步驟，且用蟲量大，不適合用于田間實(shí)時(shí)檢測。采用本發(fā)明的診斷劑量，制作玻璃管，可帶到田間進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測，快速了解田間種群抗性。
[0067]采用傳統(tǒng)玻璃管藥膜法對田間采集桃蚜種群進(jìn)行毒力測定，被測種群為:遼寧大連、河北廊坊、上海閔行。傳統(tǒng)方法測定得到三個(gè)被測種群對四種藥劑的LC5tl，見如下表格。同時(shí)采用本發(fā)明玻璃管診斷劑量對三個(gè)被測種群進(jìn)行以上四種藥劑的抗性診斷，操作方法如實(shí)施例2，各種群對診斷藥劑的死亡率，結(jié)果見表I。
[0068]由表格數(shù)據(jù)可以看出，玻璃管藥膜診斷劑量法計(jì)算的死亡率與傳統(tǒng)毒力測定方法得到的抗性水平具有明顯的相關(guān)性，即表示用該專利的診斷劑量也可檢測田間種群抗性水平，但該方法克服了傳統(tǒng)生測方法樣本數(shù)量大、操作繁瑣、費(fèi)時(shí)等缺點(diǎn)，更適用于田間檢測。
[0069]表I四種藥劑玻璃管診斷劑量的抗性診斷
[0070]
【權(quán)利要求】
1.一種檢測桃蚜抗藥性的方法，在藥劑的診斷劑量下制作診斷玻璃管，檢測桃蚜田間種群個(gè)體對藥劑的抗性水平，其特征在于，所述藥劑為抗蚜威、聯(lián)苯菊酯、吡蟲啉或啶蟲脒；藥劑的診斷劑量:抗姆威為10086.30ng/cm2,聯(lián)苯菊酯為2159.00ng/cm2,卩比蟲啉為47.86ng/cm2, P定蟲脈為 196.58ng/cm2。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，藥劑的診斷劑量是通過不同濃度的藥劑采用玻璃管藥膜法對室內(nèi)飼養(yǎng)混合種群進(jìn)行藥劑毒力測定，計(jì)算LC99作為藥劑的診斷劑量。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述室內(nèi)飼養(yǎng)混合種群為采集各地桃蚜田間種群，混合后，室內(nèi)飼養(yǎng)多代得到。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，藥劑的診斷劑量是通過如下步驟確定的: (1)桃蚜田間種群的室內(nèi)飼養(yǎng):采集各地桃蚜田間種群，混合飼養(yǎng)多代，獲得室內(nèi)飼養(yǎng)混合種群； (2)丙酮稀釋四種殺蟲藥劑至不同濃度梯度作為毒力測定濃度； (3)玻璃管藥膜的制作:用步驟(2)中丙酮稀釋的各梯度藥劑制作毒力測定所用的玻璃管藥膜，每管加入220 u L各濃度藥液，滾動(dòng)玻璃管直至丙酮完全揮發(fā)，使藥液均勻分布在玻璃管內(nèi)壁上； (4)毒力測定:用步驟(3)中制備的玻璃管進(jìn)行桃蚜的毒力測定，至少進(jìn)行三次生物學(xué)重復(fù)； (5)結(jié)果及診斷劑量:對步驟(4)的結(jié)果做毒力回歸曲線，并計(jì)算LC99得出各個(gè)藥劑的診斷劑量。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，步驟(2)中所用的殺蟲藥劑均為95%以上的原藥，并且用丙酮溶解，稀釋至5?7個(gè)濃度梯度。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，步驟(4)中每次毒力測定實(shí)驗(yàn)做三次簡單獨(dú)立重復(fù)。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，步驟(5)用POLO軟件計(jì)算結(jié)果及診斷劑量。
【文檔編號】G01N33/15GK103529194SQ201310477050
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2013年10月12日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月12日
【發(fā)明者】高希武, 劉曉嵐, 湯秋玲, 李永丹, 梁沛 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)