高效毛細管電泳－激光誘導熒光檢測設備及診斷的試劑盒在乳腺癌癥早期診斷的應用的制作方法
【專利摘要】高效毛細管電泳－激光誘導熒光檢測設備及診斷的試劑盒在乳腺癌癥早期診斷的應用，高效毛細管電泳-激光誘導熒光的檢測設備包括365納米波帶濾波片、1厘米聚焦鏡頭、樣品檢測窗、樣品池、濾光片、信號放大器、光電信號電壓轉換器、數(shù)字信號轉換器、顯示器,及樣品處理方法和配套的試劑盒來快速檢測人體尿樣中乳腺癌癥標記物的濃度,并使用該方法篩選了多個乳腺癌癥患者和健康人體的樣品，有益效果：成本降低,靈敏度大大提升,無需昂貴儀器的支持,儀器維護費用降低,所需要的溶劑量減少,需要的樣品量較小,且樣品處理過程簡化.整個測試時間減少。
【專利說明】高效毛細管電泳一激光誘導熒光檢測設備及診斷的試劑盒在乳腺癌癥早期診斷的應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一組癌癥標記物分子及其檢測設備，屬于生物醫(yī)藥【技術領域】，具體涉及癌癥早期分子診斷領域。
【背景技術】
[0002]癌癥是全球死亡的第二大原因，也是全世界所有死亡的13%左右的原因。癌癥死亡率每年類型的癌癥是肺癌(140萬例/年)，胃癌(866，000例/年)，肝癌(653，000例/年)，結腸癌(677，000例/年)，和乳腺癌(548，000例/年)。全世界癌癥死亡人數(shù)預計將繼續(xù)上升，估計2030年有1200萬人死于癌癥。這些統(tǒng)計數(shù)據(jù)充分表明了在全球范圍癌癥發(fā)生的密度和強度.許多研究機構和科學家專注于癌癥研究，因為它是現(xiàn)代世界的最嚴重的健康問題之一。
[0003]癌癥發(fā)生時，在身體的一部分細胞開始生長失控。正常的細胞分裂和生長在一種有序的方式，但癌細胞沒有，他們排擠正常細胞。雖然有許多種癌癥，都有著共同的特點。癌癥發(fā)展迅速，早期診斷和治療的機會大大提高，病人將生存和生活的積極和富有成效的生活。此外，如果在早期階段癌癥診斷，病人將有一個更大的機會成功的治療和更多的治療選擇。目前，在過去的幾十年中，癌癥的診斷主要依據(jù)影像學評估，如乳房X光檢查，X射線計算機斷層掃描(CT)，磁共振成像(MRI )，正電子發(fā)射斷層掃描(PET)和腫瘤的病理形態(tài)學檢查活檢標本。但這種方法有顯著的局限性，不能為早期診斷和預測腫瘤的潛在的進展提供相對應治療的反應。
[0004]肺癌是發(fā)病率和死亡率增長最快，對人群健康和生命威脅最大的惡性腫瘤之一。近50年來許多國家都報道肺癌的發(fā)病率和死亡率均明顯增高，男性肺癌發(fā)病率和死亡率均占所有惡性腫瘤的第一位，女性發(fā)病率占第二位，死亡率占第二位。肺癌的病因至今尚不完全明確，大量資料表明，長期大量吸煙與肺癌的發(fā)生有非常密切的關系。已有的研究證明:長期大量吸煙者患肺癌的概率是不吸煙者的10?20倍，開始吸煙的年齡越小，患肺癌的幾率越高。此外，吸煙不僅直接影響本人的身體健康，還對周圍人群的健康產(chǎn)生不良影響，導致被動吸煙者肺癌患病率明顯增加。
[0005]和其他許多癌癥類似，肺癌的發(fā)生源于癌基因的激活，或抑癌基因的喪失活性。癌基因指的是那些使人容易得癌癥的基因。通常認為原癌基因在遇到致癌物以后會變成癌基因。大鼠肉瘤蛋白(RAS)原癌基因的基因突變大約造10-30%肺腺癌。表皮生長因子受體(EGFR)控制著細胞的分裂，凋零，抑制血管生成，和腫瘤侵蝕EGFR基因突變和擴增在非小細胞肺癌中很常見，因此才有采用EGFR抑制劑的治療基礎。但Her2/neu蛋白很少受影響。染色體損傷會導致基因雜合缺失。這可造成抑癌基因喪失活性。在小細胞肺癌中，經(jīng)常見到3p，5q，13q，和17p染色體損傷。60_75%的病例在17p染色體上p53抑癌基因受影響。其他經(jīng)常發(fā)生突變和擴增的基因有c-MET，NKX2-1, LKBI, PIK3CA,和BRAF多種基因多態(tài)性和肺癌有關，包括白細胞介素-1，細胞色素P450,細胞凋亡的促進因子(比如caspase-8),和DNA修復分子(比如XRCC1)。有這些基因多態(tài)性的人在接觸致癌物質(zhì)后更容易得肺癌。
[0006]目前對肺癌的診斷主要是通過影像學的應用，例如X線檢查，通過X線檢查可以了解肺癌的部位和大小，可能看到由于支氣管阻塞引起的局部肺氣腫、肺不張或病灶鄰近部位的浸潤性病變或肺部炎變。支氣管鏡檢查，通過支氣管鏡可直接窺察支氣管內(nèi)膜及管腔的病變情況。可采取腫瘤組織供病理檢查，或吸取支氣管分泌物作細胞學檢查，以明確診斷和判定組織學類型。細胞學檢查痰細胞學檢查是肺癌普查和診斷的一種簡便有效的方法，原發(fā)性肺癌病人多數(shù)在痰液中可找到脫落的癌細胞。中央型肺癌痰細胞學檢查的陽性率可達70%?90%，周圍型肺癌痰檢的陽性率則僅約50%。剖胸探查術，肺部腫塊經(jīng)多種檢查和短期診斷性治療仍未能明確病變性質(zhì)，肺癌的可能性又不能除外者，應作剖胸探查術。這樣可避免延誤病情致使肺癌患者失去早期治療的機會。ECT檢，ECT骨顯像可以較早地發(fā)現(xiàn)骨轉移灶。X線片與骨顯像都有陽性發(fā)現(xiàn)，如病灶部成骨反應靜止，代謝不活躍，則骨顯像為陰性，X線片為陽性，二者互補，可以提高診斷率。需要注意的是ECT骨顯像診斷肺癌骨轉移的假陽性率可達20%?30%，因此ECT骨顯像陽性者需要作陽性區(qū)域骨的MRI掃描?？v隔鏡檢查，縱隔鏡檢查主要用于伴有縱隔淋巴結轉移，不適合于外科手術治療，而其他方法又不能獲得病理診斷的病人?？v隔鏡檢查需在全麻下進行。在胸骨上凹部做橫切口，鈍性分離頸前軟組織到達氣管前間隙，鈍性游離出氣管前通道，置入觀察鏡緩慢通過無名動脈之后方，觀察氣管旁、氣管支氣管角及隆突下等部位的腫大淋巴結，用特制活檢鉗解剖剝離取得淋巴結組織送病理學檢查。
[0007]而通常情況下，病人由于害怕在疾病的診斷過程中給樣品會損害他們的器官和組織。他們也可能是不愿意給血液診斷測試。因此，早期癌癥篩查的非侵入性診斷技術的發(fā)展是非常重要的，所有的人群。非侵入性診斷涉及到程序不穿透人體的機械，也不會刺破皮膚或涉及穿透體腔內(nèi)。它不要求進入人體或切除生物組織的切口。目前，許多研究人員都專注于通過分析癌癥生物標志物在尿，這樣更容易比組織或血液樣本收集非侵入性的方式來診斷癌癥。
[0008]而在癌癥檢測中利用生物標志物，是良好的潛在的早期診斷工具。能對癌癥早期診斷和預測腫瘤的潛在的進展提供更好的治療反應。
[0009]在這些生物和生理指標可包括范圍廣泛的的生化實體，如核酸，蛋白質(zhì)，糖類，脂類，和小的代謝物，以及全細胞，在任一特定的組織或流通。今天，循環(huán)腫瘤細胞正在成為一個強大的工具，在“微觀”癌癥篩查。檢測的生物標志物，單獨或作為較大的數(shù)據(jù)集或圖案，可以通過各種各樣的方法，包括從血液或組織樣品的生化分析，生物醫(yī)學成像。
[0010]蝶啶癌癥篩選研究在過去的二十年中成為焦點，因為目標蝶啶水平已被證明反映不同的的癌癥患者代謝產(chǎn)物中。這些蝶啶分布在生物體。蝶啶及其衍生物的某些維生素的合成中起重要作用，它們是細胞代謝過程中的重要輔助因子。蝶啶人尿中排出體外，它們可以作為潛在生物標志物在臨床診斷。通過分析從癌癥患者尿樣中異黃蝶呤和比較它們從健康受試者沒有癌癥的證據(jù)。蝶啶水平要顯著升高時，細胞免疫系統(tǒng)被激活的某些疾病，如癌癥，病毒感染，和腎臟病已報告。在腫瘤相關的疾病中不同的蝶啶衍生物可以扮演各種角色。每種類型的腫瘤很可能會導致不同模式的蝶啶濃度的變化。高性能液相色譜(HPLC)的方法已被用于蝶啶分析。但是，它費時昂貴，并導致了不能令人滿意的分離，尤其是對真實的尿液樣本，從而影響檢測的準確率和靈敏度。另一方面，高效毛細管電泳法(HPCE)是快速而有效的，只需要一個小的樣本大小。此專利開發(fā)并優(yōu)化了高效毛細管電泳-激光誘導熒光的檢測方法來定量分析尿樣中的異黃蝶呤。
[0011]目前針對蝶呤類分子檢測的手段多使用高性能液相色譜(HPLC)和高性能液相色譜連用質(zhì)譜(LC-MS).無論是HPLC或者LC-MS，有以下缺點
[0012]I)昂貴的儀器作為支持，平均HPLC體系需要20萬人民幣，LC-MS聞達百萬人民幣。
[0013]2)儀器維護費用高，每年儀器維護費用高到儀器價格的10-15%。
[0014]3)所需要的溶劑量巨大，給環(huán)境帶來很大污染.分析同樣一個樣品。
[0015]4)需要的樣品量較大。
[0016]5)因為需要液相色譜的分離，所以要求相對簡單的樣品，也就是說需要預處理樣品，把樣品中的其他雜質(zhì)在分析前除去，這就加大了樣品準備的難度，增加了分析時間和成本，因為需要額外的工具和耗材來處理樣品。
[0017]6)靈敏度偏低。
[0018]7)每個樣品的分析時間偏長。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0019]發(fā)明目的:解決蝶呤類分子檢測儀器造價高，檢測過程過程中污染大，需樣大，時間長，長本高，檢測結果靈敏底偏底等問題。
[0020]技術方案:一種高效毛細管電泳一激光誘導熒光檢測設備，本發(fā)明將MillesGriot Omnichrome系列的365納米波段激發(fā)的激光器(35微瓦)作為激發(fā)光源固定在設備底部，此激光器是提供激發(fā)樣品中所需能量的特殊波段光源.在激光通過的方向間隔一定距離固定一個365納米的濾波器(Ealing, Holliston, MA;model UG-1I),其距離最佳為離光源10厘米處；此處濾波器的作用是為了降低雜散光和散射光的干擾，提升有效波段激光的強度.繼續(xù)在激光方向距離濾波器5厘米處固定一個一厘米直徑的聚焦鏡片，將毛細管中部的樣品視窗正放在激光對焦點，毛細管長度為50厘米長；內(nèi)直徑50微米，材質(zhì)為二氧化硅。此處需要精細調(diào)節(jié)，確保激光距焦在樣品視窗，此處聚焦鏡片的作用是聚焦光源激光，使其強度最大化.然后將毛細管兩端固定在樣品池中，樣品池固定在光路的兩側.毛細管中段距離陽極25厘米設有一個I平方厘米的視窗。在毛細管樣品視窗的上方大概I厘米的位置，垂直于激光光路的方向固定一個400 - 539nm的濾波器(Ealing，model35-532).此處濾波器的作用也是為了降低雜散光和散射光的干擾，提升靈敏度.繼續(xù)在垂直的方向固定一個聚焦鏡頭，此處需要精細調(diào)節(jié)鏡頭的位置，確保從樣品發(fā)出的發(fā)射激光在鏡頭處聚焦最大化.此處聚焦鏡頭的作用是接受樣品中收到激發(fā)的分子所發(fā)射出來的發(fā)射光，也就是目標物的光信號.然后在距焦鏡頭的垂直方向的焦點處固定一個光電倍增管的接收器(使用的是 R982Hamamatsu photomultiplier tube, Bridgewater),調(diào)節(jié)其位置確保接收到最大的光信號.然后將光電倍增管接收器用電纜連接電壓信號轉換器，電壓信號轉換器固定在遠離激光光源的方向，此時光信號已被放大并轉換成電壓信號，再將一個模擬信號轉化器通過AVI數(shù)據(jù)線連接到電壓信號轉換器(VerniersSoftware andTechnology, Beaverton, OR),電壓信號轉換器和模擬信號轉化器都可以固定在遠離激光源的一端，節(jié)省空間！再將模擬信號轉化器連接到普通顯示器即可.[0021]一種檢測早期癌癥的試劑盒，包括以下組分:
[0022]試劑A:質(zhì)量/體積為低于15%碘化鉀(KI)和低于15%的碘(12)；
[0023]試劑B:1摩爾每升的氫氧化鈉和I摩爾每升的氯化鈉；
[0024]試劑C:40微摩爾每升的磷酸氫鈉(Na2HP04)和磷酸的混合物，PH值為弱堿性劑D:500微升去離子純凈水；
[0025]試劑E:500微升低于5摩爾每升的氯化氫；
[0026]試劑F:500微升0.1摩爾每升Tris, 0.1摩爾每升borate,低于5摩爾每升EDTA。
[0027]試劑盒制備方法:試劑A:制備及保存具體過程如下:首先溶解碘化鉀在I升電離水中，充分攪拌至全部溶解，再將碘加入到溶液，在37攝氏度下中速攪拌45分鐘.最終溶液需分裝在放鋁箔紙包裹的2毫升樣品罐中，每個2毫升樣品罐中存有500微升處理試劑.試劑需放置在4攝氏度冰箱中；試劑B:組成為I摩爾每升的氫氧化鈉和I摩爾每升的氯化鈉，儲存形式為200微升每2毫升樣品罐中；試劑C:40微摩爾每升的磷酸氫鈉(Na2HP04)和磷酸的混合物，PH值為7.5，300微升每2毫升樣品罐中存放；試劑D:500微升去離子純凈水，同樣存于2毫升樣品罐中；試劑E:500微升I摩爾每升的氯化氫，同樣存于2毫升樣品罐中；試劑F:500微升0.1摩爾每升Tris，0.1摩爾每升borate，2摩爾每升EDTA同樣存于2毫升樣品罐中。
[0028]利用上述設備與試劑盒來檢測病人尿樣蝶呤類物質(zhì)的含量，比如異黃蝶呤或黃蝶呤，從含量判定早期癌癥情況。
[0029]檢測病人尿樣過程中對尿樣的處理，樣品拿到后迅速放置-80攝氏度冰箱中保存；將尿樣轉移至試劑A的2毫升樣品罐中，輕搖并靜至5分鐘，再將試劑B的200微升加入該2毫升樣品罐中，充分混合然后放置4度冰箱15分鐘，完成后在8000轉冷凍離心機下離心10分鐘；轉移100微升上清液到試劑C的2毫升樣品罐中，充分混合后等待進樣。
[0030]進樣品前，用預處理毛細管，用試劑C和試劑D分別進樣3分鐘.緊接著進樣試劑E和試劑D3分鐘，最有用試劑F進樣10分鐘，樣品進樣保持20秒，具體電泳參數(shù)如下:保持電壓18千伏9分鐘.每一個樣品結束后需要重復預處理步驟:用試劑C和試劑D分別進樣3分鐘.緊接著進樣試劑E和試劑D3分鐘，最后用試劑F進樣10分鐘.異黃蝶呤或黃蝶呤的特征峰在6.5分鐘的時候出現(xiàn).在完成所有樣品后，再進樣標準溶液I 一5從而得到標準曲線。標準液為蝶呤類物質(zhì)溶于磷酸氫鈉(Na2HP04)和磷酸的混合物。
[0031]標準溶液I — 5如下:
[0032]標準溶液I為0.01克每升的蝶呤類物質(zhì)溶于40微摩爾每升的磷酸氫鈉(Na2HP04)和磷酸的混合物；
[0033]標準溶液2為1x10-3克每升的蝶呤類物質(zhì)溶于40微摩爾每升的磷酸氫鈉(Na2HP04)和磷酸的混合物；
[0034]標準溶液3為1x10-4克每升的蝶呤類物質(zhì)溶于40微摩爾每升的磷酸氫鈉(Na2HP04)和磷酸的混合物；
[0035]標準溶液4為1x10-5克每升的蝶呤類物質(zhì)溶于40微摩爾每升的磷酸氫鈉(Na2HP04)和磷酸的混合物；
[0036]標準溶液5為1x10-6克每升的蝶呤類物質(zhì)溶于40微摩爾每升的磷酸氫鈉(Na2HP04)和磷酸的混合物。
[0037]有益效果:成本降低，靈敏度大大提升，無需昂貴儀器的支持，儀器維護費用降低，所需要的溶劑量減少，需要的樣品量較小，且樣品處理過程簡化.整個測試時間減少。
[0038]說明書附圖
[0039]圖1高效毛細管電泳一激光誘導熒光檢測設備結構圖；
[0040]圖2異黃蝶呤標準樣品的電泳圖；
[0041]圖3患者與健康人尿樣中異黃蝶呤含量圖。
[0042]圖4黃蝶呤標準樣品的電泳圖；
[0043]圖5患者與健康人尿樣中黃蝶呤含量圖。
【具體實施方式】
[0044]一種高效毛細管電泳一激光誘導熒光檢測設備，如圖1所示。365納米波帶濾波片、聚焦鏡頭、樣品檢測窗、樣品池、濾光片、信號放大器、光電信號電壓轉換器、數(shù)字信號轉換器、顯示器，365納米波帶濾波片后按順序間隔一定距離設置I厘米聚焦鏡頭、樣品檢測窗、濾光片、聚焦鏡頭、信號放大器，樣品池通過毛細管連接于樣品檢測窗上，毛細管長50厘米，內(nèi)直徑50微米，材質(zhì)為二氧化硅。毛細管中段距離陽極25厘米設有一個I平方厘米的視窗。信號放大器后按順序連接光電信號電壓轉換器、數(shù)字信號轉換器、顯示器。為了降低雜散光和散射光的干擾，提升有效波段激光的強度，我們使用了一個365納米的濾波器.然后激光信號通過一個I厘米的聚焦鏡頭聚焦在毛細管的樣品檢測窗口，樣品中的異黃蝶呤受到激發(fā)后會發(fā)射特殊發(fā)射波，光波通過一個慮波片和聚焦鏡頭聚焦在光電倍增管的接收器上，光信號被放大并通過光電倍增管的電流所產(chǎn)生的輸出轉換到電壓信號，然后該模擬信號被數(shù)字化，并呈現(xiàn)在顯示儀器界面。
[0045]一種檢測早期乳腺癌的試劑盒，包括以下組分:
[0046]試劑A:質(zhì)量/體積為低于15%碘化鉀(KI)和低于15%的碘(12)；
[0047]試劑B:1摩爾每升的氫氧化鈉和I摩爾每升的氯化鈉；
[0048]試劑C:40微摩爾每升的磷酸氫鈉(Na2HP04)和磷酸的混合物，PH值為弱堿性劑D:500微升去離子純凈水；
[0049]試劑E:500微升低于5摩爾每升的氯化氫；
[0050]試劑F:500微升0.1摩爾每升Tris, 0.1摩爾每升borate,低于5摩爾每升EDTA。
[0051]試劑盒制備方法:試劑A:制備及保存具體過程如下:首先溶解30.04克碘化鉀在I升電離水中，充分攪拌至全部溶解，再將30.25克碘加入到溶液，在37攝氏度下中速攪拌45分鐘.最終溶液需分裝在放鋁箔紙包裹的2毫升樣品罐中，每個2毫升樣品罐中存有500微升處理試劑.試劑需放置在4攝氏度冰箱中；試劑B:組成為I摩爾每升的氫氧化鈉和I摩爾每升的氯化鈉，儲存形式為200微升每2毫升樣品罐中；試劑C:40微摩爾每升的磷酸氫鈉(Na2HP04)和磷酸的混合物，PH值為7.5，300微升每2毫升樣品罐中存放；試劑D:500微升去離子純凈水，同樣存于2毫升樣品罐中；試劑E:500微升I摩爾每升的氯化氫，同樣存于2毫升樣品罐中；試劑F:500微升0.1摩爾每升Tris，0.1摩爾每升borate, 2摩爾每升EDTA同樣存于2毫升樣品罐中。
[0052]利用上述設備與試劑盒來檢測病人尿樣蝶呤類物質(zhì)的含量，從含量判定早期癌癥情況。
[0053]檢測病人尿樣過程中對尿樣的處理，樣品拿到后迅速放置-80攝氏度冰箱中保存；將尿樣轉移至試劑A的2毫升樣品罐中，輕搖并靜至5分鐘，再將試劑B的200微升加入該2毫升樣品罐中，充分混合然后放置4度冰箱15分鐘，完成后在8000轉冷凍離心機下離心10分鐘；轉移100微升上清液到試劑C的2毫升樣品罐中，充分混合后等待進樣。
[0054]進樣品前，用預處理毛細管，用試劑C和試劑D分別進樣3分鐘.緊接著進樣試劑E和試劑D3分鐘，最有用試劑F進樣10分鐘，樣品進樣保持20秒，具體電泳參數(shù)如下:保持電壓18千伏9分鐘.每一個樣品結束后需要重復預處理步驟:用試劑C和試劑D分別進樣3分鐘.緊接著進樣試劑E和試劑D3分鐘，最后用試劑F進樣10分鐘.蝶呤類物質(zhì)的特征峰在6.5分鐘的時候出現(xiàn).在完成所有樣品后，再進樣標準溶液I 一 5從而得到標準曲線。如圖2、圖4所示。異黃蝶呤檢測限達到1x10-10克每毫升，標準曲線從1x10-9克每毫升到1x10-5克每毫升的R2達到0.9763。黃蝶呤檢測限達到2x10-10克每毫升，標準曲線從5x10-9克每毫升到5x10-5克每毫升的R2達到0.9865
[0055]標準溶液I — 5如下:
[0056]標準溶液I為0.01克每升的蝶呤類物質(zhì)溶于40微摩爾每升的磷酸氫鈉(Na2HP04)和磷酸的混合物；
[0057]標準溶液2為1x10-3克每升的蝶呤類物質(zhì)溶于40微摩爾每升的磷酸氫鈉(Na2HP04)和磷酸的混合物；
[0058]標準溶液3為1x10-4克每升的蝶呤類物質(zhì)溶于40微摩爾每升的磷酸氫鈉(Na2HP04)和磷酸的混合物；
[0059]標準溶液4為1x10-5克每升的蝶呤類物質(zhì)溶于40微摩爾每升的磷酸氫鈉(Na2HP04)和磷酸的混合物；
[0060]標準溶液5為1x10-6克每升的蝶呤類物質(zhì)溶于40微摩爾每升的磷酸氫鈉(Na2HP04)和磷酸的混合物。
[0061]實驗室人員將消過毒的容器交給患者和參與試驗的健康人體，自行取尿樣，取樣后試驗人員用放有干冰的冷凍盒把樣品轉移至-80冰柜.第二天將樣品取出，按照本發(fā)明的樣品處理步驟，將I毫升尿樣轉移至試劑A的2毫升樣品罐中，輕搖并靜至5分鐘，再將試劑B的200微升加入該2毫升樣品罐中，充分混合然后放置4度冰箱15分鐘，完成后在8000轉冷凍離心機下離心10分鐘；轉移100微升上清液到試劑C的2毫升樣品罐中，充分混合后等待進樣。樣品分析后，將數(shù)據(jù)移至分析處理電腦進行數(shù)據(jù)處理.方法驗證的結果是標準樣品的偏差小于(CV〈15%，N=4)，保證了數(shù)據(jù)的準確，并對于兩種癌癥分別進行和健康人體數(shù)據(jù)的對比，P值均遠遠小于0.05，可以結論病患和健康人體尿樣中蝶呤類物質(zhì)含量有重大差別.[0062]人體尿樣結果:乳腺癌患者的10個人體尿樣來自于Ellis Fischel CancerCenter, Columbia MO USA,患者均未接受過化學或者放射治療的，患者的地域分布為美國密蘇里州，年齡在26-70歲之間，期間沒有對患者的飲食和運動有任何限制.18個健康人體的尿液樣本來自于美國密蘇里大學的在校學生志愿者，沒有采取任何藥物包括維生素補充劑，年齡范圍在22-45歲。如圖3所示。[0063]肺癌癌患者的9個人體尿樣來自于Ellis Fischel Cancer Center, Columbia MOUSA,患者均未接受過化學或者放射治療的，患者的地域分布為美國密蘇里州，年齡在26-70歲之間，期間沒有對患者的飲食和運動有任何限制.10個健康人體的尿液樣本來自于美國密蘇里大學的在校學生志愿者，沒有采取任何藥物包括維生素補充劑，年齡范圍在22-45歲.如圖5所示。
【權利要求】
1.一種高效毛細管電泳一激光誘導熒光檢測設備，其特征在于，包括365納米波帶濾波片、I厘米聚焦鏡頭、樣品檢測窗、樣品池、濾光片、信號放大器、光電信號電壓轉換器、數(shù)字信號轉換器、顯示器，365納米波帶濾波片后按順序間隔一定距離設置I厘米聚焦鏡頭，I厘米在聚焦鏡頭的焦點處設置樣品檢測窗，其后間隔一定距離設置濾光片、聚焦鏡頭，確保從樣品發(fā)出的發(fā)射激光在鏡頭處聚焦最大化，樣品池通過毛細管連接于樣品檢測窗上，在聚焦鏡頭的焦點處設置信號放大器，信號放大器后按順序連接光電信號電壓轉換器、數(shù)字信號轉換器、顯不器。
2.根據(jù)權利要求1所述的高效毛細管電泳一激光誘導熒光檢測設備，其特征在于，毛細管長50厘米，內(nèi)直徑50微米，材質(zhì)為二氧化硅。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的高效毛細管電泳一激光誘導熒光檢測設備，其特征在于，毛細管中段距離陽極25厘米設有一個I平方厘米的視窗。
4.一種檢測早期癌癌的試劑盒，其特征在于，包括以下組分： 試劑A :質(zhì)量/體積為3%碘化鉀（KI)和3%的碘（12)； 試劑B ：1摩爾每升的氫氧化鈉和I摩爾每升的氯化鈉； 試劑C ：40微摩爾每升的磷酸氫鈉（Na2HP04)和磷酸的混合物，PH值為7. 5 ; 試劑D ：500微升去離子純凈水； 試劑E :500微升I摩爾每升的氯化氫； 試劑F ：500微升0. I摩爾每升Tris, 0. I摩爾每升borate, 2摩爾每升EDTA。
5.權利要求4的制備方法，其特征在于： 試劑A :制備及保存具體過程如下：首先溶解碘化鉀在電離水中，充分攪拌至全部溶解，再將碘加入到溶液攪拌，最終溶液需分裝在放鋁箔紙包裹的2毫升樣品罐中，每個2毫升樣品罐中存有500微升處理試劑.試劑需放置在冰箱冷凍層中； 試劑B :組分為I摩爾每升的氫氧化鈉和I摩爾每升的氯化鈉，儲存形式為200微升每2毫升樣品Sil中； 試劑C ：40微摩爾每升的磷酸氫鈉（Na2HP04)和磷酸的混合物，PH值為7. 2-7. 7300微升每2毫升樣品Sil中存放； 試劑D :500微升去離子純凈水，同樣存于2毫升樣品罐中； 試劑E :500微升I摩爾每升的氯化氫，同樣存于2毫升樣品罐中； 試劑F :500微升0. I摩爾每升Tris, 0. I摩爾每升borate, 2摩爾每升EDTA同樣存于2毫升樣品中。
6.一種檢測早期癌癥的方法，其特征在于，利用權利要求1或2或3的設備與權利要求4的試劑盒來檢測病人尿樣蝶呤類物質(zhì)的含量，從含量判定早期癌癥情況。
7.根據(jù)權利要求6所述的檢測早期癌癥的方法，其特征在于，蝶呤類物質(zhì)為異黃蝶呤類或黃蝶呤類。
8.根據(jù)權利要求6或7所述的檢測早期癌癥的方法，其特征在于，檢測病人尿樣，其過程中對尿樣的處理，樣品拿到后迅速放置-80攝氏度冰箱中保存；將尿樣轉移至試劑A的樣品罐中，輕搖并靜，再將試劑B加入樣品罐中，充分混合然后放置4度冰箱15分鐘，完成后在8000轉冷凍離心機下離心10分鐘；轉移100微升上清液到試劑C的樣品罐中，充分混合后等待進樣。
9.根據(jù)權利要求6或7所述的檢測早期乳腺癌的方法，其特征在于，利用權利要求1或2或3的設備，進樣品前，用預處理毛細管，用試劑C和試劑D分別進樣3分鐘.緊接著進樣試劑E和試劑D3分鐘，最有用試劑F進樣10分鐘，樣品進樣保持20秒，具體電泳參數(shù)如下:保持電壓18千伏9分鐘.每一個樣品結束后需要重復預處理步驟:用試劑C和試劑D分別進樣3分鐘.緊接著進樣試劑E和試劑D3分鐘，最后用試劑F進樣10分鐘；蝶呤類物質(zhì)的特征峰在6.5分鐘的時候出現(xiàn).在完成所有樣品后，再進樣標準溶液I 一 5從而得到標準曲線，標準液為蝶呤類物質(zhì)溶于磷酸氫鈉(Na2HP04)和磷酸的混合物。
10.根據(jù)權利要求8所述的檢測早期乳腺癌的方法，其特征在于，標準溶液I一 5如下: 標準溶液I為0.01克每升的蝶呤類物質(zhì)溶于40微摩爾每升的磷酸氫鈉(Na2HP04)和磷酸的混合物； 標準溶液2為1x10-3克每升的蝶呤類物質(zhì)溶于40微摩爾每升的磷酸氫鈉(Na2HP04)和磷酸的混合物； 標準溶液3為1x10-4克每升的蝶呤類物質(zhì)溶于40微摩爾每升的磷酸氫鈉(Na2HP04)和磷酸的混合物； 標準溶液4為1x10-5克每升的蝶呤類物質(zhì)溶于40微摩爾每升的磷酸氫鈉(Na2HP04)和磷酸的混合物； 標準溶液5為1x10-6克每升的蝶呤類物質(zhì)溶于40微摩爾每升的磷酸氫鈉(Na2HP04)和磷酸的混合物。
【文檔編號】G01N21/64GK103529005SQ201310485378
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2013年10月16日 優(yōu)先權日:2013年10月16日
【發(fā)明者】成曉亮, 季軍, 馬銀法 申請人:江蘇禾爾思生物科技有限公司