觀賞海棠花色苷的測定方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種觀賞海棠花色苷的測定方法，屬花卉測定領域。包括：步驟1，將經(jīng)液氮速凍后的觀賞海棠花葉片放入研缽中，加入石英砂和非溶性PVPP，加入液氮研磨成粉末；步驟2，將粉末轉(zhuǎn)入試管中，加入花色苷提取液，之后在45℃超聲提取60min得到提取的花色苷提取液；步驟3，將提取的花色苷提取液純化處理，12000轉(zhuǎn)/分鐘離心3min，得上清液裝于安捷倫上樣瓶中用于HPLC檢測；步驟4，上樣，對安捷倫上樣瓶進行HPLC-DAD檢測，檢測后得到觀賞海棠花色苷的測定結果。該方法提取時間短，不足2h，不會出現(xiàn)將提取液過夜長時間放置影響測定結果的問題，從上機操作來看，大大節(jié)約了時間以及減少了試劑不必要的浪費。
【專利說明】觀賞海棠花色苷的測定方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及針對花卉的檢測方法，特別是涉及ー種用于測定觀賞海棠花的色苷的檢測方法?！颈尘凹夹g】
[0002]花青素是廣泛存在于被子植物中的ー類重要的類黃酮化合物，它是植物花朵，葉片和果實色澤形成的重要的物質(zhì)基礎之一。在自然界中，花青素常與不同種類的糖苷相結合，以花色苷的形式存在于植物中。關于植物體內(nèi)成色物質(zhì)的研究開始于19世紀中葉，至今已發(fā)現(xiàn)了很多種色素，但都可以歸成下述三大類色素:類胡蘿卜素(carotenoid)、生物堿類色素(alkaloid)和類黃酮(flavonoid)。類胡蘿卜素是胡蘿卜素(carotenes)和葉黃素(carotol)的統(tǒng)稱，類胡蘿卜素中所含的共軛雙鍵構成生色團，表現(xiàn)出黃、橙、紅、紫等彥頁色(參考:Goodwin T ff, Britton C.Dostribution and analysis of carotenoids.1n:Goodwin T W ed.Plant Pigments, 1988，61-132.Academic Press, London.)。生物喊類色素(alkaloid)是含負氧化態(tài)氮原子的環(huán)狀有機物，生物堿色素包括甜菜堿(betaine)、嬰粟堿(papaverine)、小巢堿(berberine)等；嬰粟堿使嬰粟屬(Papaver)和綠絨篙屬(Meconopssi)的花表現(xiàn)黃色；小聚堿即黃連素,使小璧屬(Berberis)的花表現(xiàn)深橙色或黃色。(參考文獻:鄭志亮.1994.花卉作物的花色基因工程.北方園藝，(3)，37 — 38.)
[0003])類黃酮(flavonoid)是ー類具有黃烷核基本骨架(C6-C3-C6)的低分子量多酚化合物的總稱，是色原酮(011'01110116)或色原燒(0111'01]^116)的衍生物。根據(jù)類黃酮物質(zhì)單體化學結構可以分為四大類:黃酮(flavone)、黃燒酮(flavanone)、黃酮醇(flavonol)和花色苷(anthocyanin)。其中，花色苷(anthocyanins)是最重要的類黃酮類色素,也是植物呈現(xiàn)紅、粉、紫、藍等不同顔色的主要決定因素。大約88%的被子科植物花的顔色改變是由花色苷所決定的。
[0004]1978年，隨著Wulf和Nagel第一次使用液相色譜對葡萄品種“赤霞珠”果皮中的花青素種類進行分離和鑒定，開創(chuàng)了花青素色譜研究的新紀元。高效液相色譜法檢測植物中花青素的含量，具有進樣量少，分析效率較高，分析時間短，靈敏度較高，檢測完流出的組分可回收利用等系列有點。近年來，隨著各種不同類型檢測器的進ー步應用，植物中各種類黃酮物質(zhì)被成功地鑒定出來(參考文獻:Jia N，Shu QY, Wang LS, et al.2008.Analysisof petal anthocyanins to investigate coloration mechanism in heroaceous peonycultivars.Sc1.Hortic (Amsterdam).117:167-173.)。例如:根據(jù)不同的類黃酮具有不同吸收光譜這ー原理，可以采用帶有光電二極管陣列檢測器(DAD)的HPLC對分離的類黃酮成分進行全波長掃描，然后用獲得的吸收光譜與標準品對照來鑒定類黃酮的化學結構。但現(xiàn)有的花色苷提取方法中，得到葉片制成的粉末，并加入花色苷提取液后形成的樣品，要將樣品于4°C冰箱內(nèi)避光浸提72小時；期間每六小時震蕩一次，于24小吋，48小時處收集上清液，并再向樣品中加入等量花色苷提取液；72小時后，將3次收集的上清液進行合井，這樣提取液必須長時間(過夜)浸泡植物材料而影響測定結果不準確的問題。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種觀賞海棠花色苷的測定方法，能在一天之內(nèi)準確測定觀賞海棠花色苷的含量，從而解決目前對觀賞海棠花色苷含量測定吋，
[0006]解決上述技術問題的技術方案如下:
[0007]本發(fā)明提供一種觀賞海棠花色苷的測定方法，包括:
[0008]步驟1，將經(jīng)液氮速凍后的觀賞海棠花葉片放入研缽中，加入石英砂和非溶性交聯(lián)聚こ烯吡咯烷酮，加入液氮研磨成粉末；
[0009]步驟2，將所述粉末轉(zhuǎn)入試管中，加入花色苷提取液，之后在45°C超聲提取60min得到；
[0010]步驟3，將提取的所述花色苷提取液進行純化處理，12000轉(zhuǎn)/分鐘離心3min，得到上清液裝于安捷倫上樣瓶中用于HPLC檢測；
[0011]步驟4，上樣，對所述安捷倫上樣瓶進行HPLC-DAD檢測，檢測后得到觀賞海棠花色苷的測定結果；所述HPLC-DAD檢測的檢測條件如下:柱溫30°C ;流速lmL/min ;進樣量20 u L ;流動相梯度，其中A為采用體積濃度為0.5%的甲酸水的流動相A ；B為采用色譜純こ臆的流動相 B:0minl0%B, 40minl9%B, 50min40%B ;柱子平衡時間 IOmin ;平衡:50.0lmin,10%, B，60min，10%B ;檢測波長:520nm ；350nm ;280nm。
[0012]本發(fā)明的有益效果為:該方法提取時間短，不足2h，不會出現(xiàn)現(xiàn)有方法中的將提取液過夜長時間放置影響測定結果的問題，從上機操作來看，大大節(jié)約了時間以及減少了試劑不必要的浪費，HPLC中涉及到的方法設置來看:梯度洗脫是為了將多種物質(zhì)分離開來，并且用最短的時間，并且建立提取的類黃酮種類較多，且分離出來的物質(zhì)含量很高，各個色譜峰之間的分離效果很好，且省時省力。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]為了更清楚地說明本發(fā)明實施例的技術方案，下面將對實施例描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實施例，對于本領域的普通技術人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他附圖。
[0014]圖1為本發(fā)明實施例提供的測定方法測定觀賞海棠花王族葉片的花色苷含量示意圖；
[0015]圖2為現(xiàn)有技術的測定方法測定觀賞海棠花王族葉片的花色苷含量示意圖；
[0016]圖3為本發(fā)明實施例提供的測定方法測定觀賞海棠花王族果皮的花色苷含量示意圖；
[0017]圖4為現(xiàn)有技術的測定方法測定觀賞海棠花王族果皮的花色苷含量示意圖；
[0018]圖5為本發(fā)明實施例提供的測定方法HPLC-MS檢測測定觀賞海棠花色苷的花色苷含量示意圖；
[0019]圖6為現(xiàn)有技術提供的測定方法HPLC-MS檢測測定觀賞海棠花色苷的含量示意圖。【具體實施方式】
[0020]下面對本發(fā)明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發(fā)明的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0021]本發(fā)明實施例提供一種觀賞海棠花色苷的測定方法，包括以下步驟:
[0022]步驟1，將經(jīng)液氮速凍后的觀賞海棠花葉片放入研缽中，加入石英砂和非溶性交聯(lián)聚こ烯吡咯烷酮(PVPP)，加入液氮研磨成粉末；
[0023]步驟2，將所述粉末轉(zhuǎn)入試管中，加入花色苷提取液，之后在45°C超聲提取60min得到；
[0024]步驟3，將提取的所述花色苷提取液進行純化處理，12000轉(zhuǎn)/分鐘離心3min，得到上清液裝于安捷倫上樣瓶中用于HPLC檢測；
[0025]步驟4，上樣，對所述安捷倫上樣瓶進行HPLC-DAD檢測，檢測后得到觀賞海棠花色苷的測定結果；所述HPLC-DAD檢測的檢測條件如下:柱溫30°C ;流速lmL/min ;進樣量20 u L ;流動相梯度，其中A為采用體積濃度為0.5%的甲酸水的流動相A ；B為采用色譜純こ臆的流動相 B:0minl0%B, 40minl9%B, 50min40%B ;柱子平衡時間 IOmin ;平衡:50.0lmin,10%, B，60min，10%B ;檢測波長:520nm ；350nm ;280nm。
[0026]上述方法步驟I中，觀賞海棠花葉片與石英砂的質(zhì)量比為1:10 ;石英砂和非溶性交聯(lián)聚こ烯吡咯烷酮的質(zhì)量比為1:1。如步驟I中，用Ig觀賞海棠花葉片，則加入0.1g石英砂和0.1g非溶性交聯(lián)聚こ烯吡咯烷酮。
[0027]上述方法步驟2中，試管中的粉末與加入的花色苷提取液的質(zhì)量比為0.1:5。如步驟2中采用0.1g步驟I中的粉末，則加入5ml (相當于5g)的花色苷提取液；該加入到試管中的花色苷提取液由甲醇冰:甲酸按80:19:1的體積比構成。
[0028]上述方法步驟3還包括:得到上清液后，將除上清液之外的濾液用0.22iim微孔濾膜進行過濾，并將剩余濾液于_80°C保存?zhèn)溆谩?br> [0029]下面結合具體實施例對本發(fā)明的測定方法作進ー步地詳細描述。
[0030]步驟1，取約Ig經(jīng)液氮速凍后的葉片放入研缽中，加入0.1g石英砂和0.1g非溶性PVPP，加液氮迅速研磨成粉末狀；
[0031]步驟2，將0.1g粉末轉(zhuǎn)入15mL試管中，加入5mL的花色苷提取液(花色苷提取液該由按體積比為80:19:1的甲醇:水:甲酸組成)，45°C超聲提取60min得到提取后的花色苷提取液；
[0032]步驟3，將收集到的提取后的花色苷提取液進行純化處理，12000轉(zhuǎn)/分鐘離心3min，得到上清液，收集花色苷提取液分裝于2ml安捷倫上樣瓶中用于HPLC檢測；該步驟進一步可以包括將濾液用0.22 微孔濾膜進ー步過濾，剰余濾液于-80°C保存?zhèn)溆玫牟襟E。
[0033]步驟4，配置流動相，流動相A為:體積濃度為0.5%的甲酸水；流動相B為:色譜純こ腈。
[0034]步驟5，上樣，進行HPLC-DAD檢測，檢測條件如下:柱溫30°C ;流速lmL/min ;進樣量20 u L ;流動相梯度:0minl0%B,40minl9%B, 50min40%B ;柱子平衡時間IOmin ;平衡:50.0lmin, 10%,B,60min, 10%B ;檢測波長:520nm ；350nm ;280nm。由于 HPLC-DAD 檢測需要用到A、B流動相，上述參數(shù)中只給出B的參數(shù)，A的省略，去掉B后剩余的就是A。[0035]而現(xiàn)有的花色苷提取方法中，得到葉片制成的粉末，并加入花色苷提取液后形成的樣品，要將樣品于4°C冰箱內(nèi)避光浸提72小時；期間姆六小時震蕩一次,于24小時,48小時處收集上清液，并再向樣品中加入等量花色苷提取液；72小時后，將3次收集的上清液進行合并。
[0036]從提取方法上比較，現(xiàn)有方法整個浸提時間至少需要三天，本發(fā)明的測定方法提取時間不足2h，從上機操作來看，本發(fā)明的測定方法大大節(jié)約了時間，在一天內(nèi)即可完成從取樣到完成樣品的測定，以及減少了試劑不必要的浪費，HPLC中涉及到的方法設置來看:梯度洗脫是為了將多種物質(zhì)分離開來，并且用最短的時間，這就是原則，耿健的方法(耿健在論文《觀賞海棠花青素代謝途徑與產(chǎn)物的研究》中使用的測定方法)是等度洗脫設置的，從測試結果來看，耿健的方法不適合梯度洗脫。判斷標準為[I]于世林高效液相色譜方法及應用[M].北京:化學エ業(yè)出版社，2005.122 — 140。樣品中第一個峰與最后ー個峰的保留時間分別為ti=4.849min和tr=48.439min,此時末峰與首峰的保留時間差A tg為:At=tr-ti=43.59min ；,梯度洗脫時間tG=70min,依據(jù)A t / tG的比值,來判定是否需要進行梯度洗脫若A t / tG ^ 0.25，進行等度洗脫；A t / tG>0.25，進行梯度洗脫；在本分離中:At / tG=43.59 / 70=0.6227，由于0.6227>0.25，所以對樣品的分離應進行梯度洗脫。因此在這樣的基礎上我們進行了方法的改進，采用梯度洗脫，即，流動相梯度為:0minl0%B，40minl9%B,50min40%B ;柱子平衡時間 IOmin0 平衡:50.01min, 10%, B，60min，10%B。
[0037]以觀賞海棠的品種之一王族葉片和果皮為材料進行了測試，與現(xiàn)有的耿健的測定方法相比，本發(fā)明的測定方法的建立提取的類黃酮種類較多，且分離出來的物質(zhì)含量很高，各個色譜峰之間的分離效果很好，且省時省力。
[0038]王族葉片:
[0039]本發(fā)明的測定方法結`果如圖1所示，清晰地將所有的出峰全部分離出來；而采用現(xiàn)有的耿健的測定方法結果如圖2 (主要是通過圖2中給出的線條趨勢進行分析)所示，在樣品分離中:At / tG=43.59 / 70=0.6227，由于0.6227>0.25，所以對樣品的分離應進行梯度洗脫；由于該方法不適于梯度洗脫，前IOmin的峰全堆積在一起，明顯難以分離。
[0040]王族果皮:本發(fā)明的測定方法結果如圖3所示，所有物質(zhì)峰均清晰分離；而采用現(xiàn)有的耿健的測定方法結果如圖4所示，與葉片結果一致，前IOmin的峰圖聚在一起，不能分出。
[0041]此外進行HPLC-MS檢測時:現(xiàn)有耿健的測定方法在提取以及流動相配比中由于提取試劑以及流動相配制中酸的含量過高，在二者的雙重作用下，對樣品進行HPLC-MS負離子檢測，無響應(緑色部分代表質(zhì)譜MS檢測，本發(fā)明測定方法的檢測圖為圖5，該方法建立減少了酸的含量，進行HPLC-MS負離子檢測，質(zhì)譜信號響應強烈，現(xiàn)有耿健的測定方法的檢測圖為圖6)。
[0042]通過上述對比可知，本發(fā)明的測定方法安全可靠，對樣品進行檢測能達到高分離度、較快速度。本發(fā)明研發(fā)出了更適用于觀賞海棠植物組織的花色苷檢測方法。并選擇不同葉色、花色及果色的觀賞海棠品種為材料對此進行了鑒定。為今后進ー步從觀賞海棠葉、花、果的成色機理打下了堅實的基礎；對蘋果屬植物種質(zhì)資源的研究，保護和利用具有一定的理論和實踐價值。
[0043]以上所述，僅為本發(fā)明較佳的【具體實施方式】，但本發(fā)明的保護范圍并不局限于此，任何熟悉本【技術領域】的技術人員在本發(fā)明披露的技術范圍內(nèi)，可輕易想到的變化或替換，都應涵蓋在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。因此，本發(fā)明的保護范圍應該以權利要求書的保護范圍為準。
【權利要求】
1.一種觀賞海棠花色苷的測定方法，其特征在于，包括: 步驟I，將經(jīng)液氮速凍后的觀賞海棠花葉片放入研缽中，加入石英砂和非溶性交聯(lián)聚こ烯吡咯烷酮，加入液氮研磨成粉末； 步驟2，將所述粉末轉(zhuǎn)入試管中，加入花色苷提取液，之后在45°C超聲提取60min得到提取的花色苷提取液； 步驟3，將提取的所述花色苷提取液進行純化處理，12000轉(zhuǎn)/分鐘離心3min，得到上清液裝于安捷倫上樣瓶中用于HPLC檢測； 步驟4，上樣，對所述安捷倫上樣瓶進行HPLC-DAD檢測，檢測后得到觀賞海棠花色苷的測定結果；所述HPLC-DAD檢測的檢測條件如下:柱溫30°C ;流速lmL/min ;進樣量20 y L ;流動相梯度，其中A為采用體積濃度為0.5%的甲酸水的流動相A ；B為采用色譜純こ腈的流動相 B:0minl0%B, 40minl9%B, 50min40%B ;柱子平衡時間 IOmin ;平衡:50.0lmin, 10%, B，60min, 10%B ;檢測波長:520nm ；350nm ;280nm。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟I中，所述觀賞海棠花葉片與石英砂的質(zhì)量比為1:10 ;所述石英砂和非溶性交聯(lián)聚こ烯吡咯烷酮的質(zhì)量比為1:1。
3.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟2中，試管中的所述粉末與加入的所述花色苷提取液的質(zhì)量比為0.1:5。
4.根據(jù)權利要求1至3任一項所述的方法，其特征在于，所述步驟2加入到試管中的所述花色苷提取液由甲醇:水:甲酸按80:19:1的體積比構成。
5.根據(jù)權利要求1至3任一項所述的方法，其特征在于，所述步驟3還包括:得到上清液后，將除上清液之外的濾液用0.22 y m微孔濾膜進行過濾，并將剩余濾液于_80°C保存?zhèn)溆谩?br> 【文檔編號】G01N30/02GK103499659SQ201310487972
【公開日】2014年1月8日 申請日期:2013年10月17日 優(yōu)先權日:2013年10月17日
【發(fā)明者】姚允聰, 宋婷婷, 張 杰, 田佶, 秦曉曉 申請人:北京農(nóng)學院