一種血清中氨含量的測(cè)定方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種測(cè)定血清中氨含量的方法。即公開了一種測(cè)定血氨含量的雙試劑，所述試劑37℃和42℃加速破壞試驗(yàn)表明，試劑穩(wěn)定性良好，解決了凍干劑需要凍干和復(fù)溶的繁瑣問題，可現(xiàn)配現(xiàn)用，2-8℃可穩(wěn)定20個(gè)月；臨床相關(guān)性試驗(yàn)表明，本方法測(cè)值穩(wěn)定，準(zhǔn)確度高，適用于手動(dòng)、半自動(dòng)、自動(dòng)檢測(cè)系統(tǒng)，易于推廣使用。
【專利說明】一種血清中氨含量的測(cè)定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種檢測(cè)血清中氨含量的方法，屬于體外診斷領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]正常人體內(nèi)游離血氨含量極低，正常值是(10-52) μ mol/L。血氨按其來源可分為內(nèi)源性氨和外源性氨，高血氨含量有神經(jīng)毒性，血氨的測(cè)定對(duì)于肝硬化門脈高壓、肝昏迷、Reye's綜合癥及兒科的一些先天性代謝紊亂等病的診斷、觀察和預(yù)后診斷有重要意義。
[0003]谷氨酸脫氫酶法較其他方法操作簡(jiǎn)便，適用于自動(dòng)生化分析儀，其反應(yīng)原理是:氨在谷氨酸脫氫酶的作用下與a -KG和NADH反應(yīng)，生成L-谷氨酸和NAD+，通過監(jiān)測(cè)NADH的下降速率，與校準(zhǔn)液相比，計(jì)算出血清中氨的含量。
[0004]應(yīng)用于臨床診斷的AMM試劑盒多為谷氨酸脫氫酶法，存在單、雙、三試劑等多種液體劑型及干片制劑。試劑盒的主要難點(diǎn)是試劑的穩(wěn)定性，尤其是NADH的穩(wěn)定性問題。NADH作為常用的還原性輔酶，在340nm有最強(qiáng)吸收峰，在體外診斷試劑中常被作為色原。但它在水溶液中不穩(wěn)定，容易發(fā)生氧化還原反應(yīng)，從而使試劑效期變短，難于在醫(yī)院推廣使用。血氨干片制劑很好地解決了液體劑型穩(wěn)定性差的缺點(diǎn)，但試劑制備時(shí)需要凍干過程，應(yīng)用時(shí)需要復(fù)溶過程，較為繁瑣，也增加了試劑成本。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明利用本領(lǐng)域中公認(rèn)的測(cè)定血氨的原理，確定了一種測(cè)定血氨含量的方法，采用兩種試劑與血清樣本混合反應(yīng)，通過確定各試劑中組成，并得到保質(zhì)期時(shí)間較長(zhǎng)，測(cè)值穩(wěn)定的試劑組成。
[0006]本發(fā)明的上述目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的:
[0007]一種血清中氨含量的測(cè)定方法，包括如下步驟:
[0008]①配制試劑a:試劑a包括緩沖液、α _酮戊二酸、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸和穩(wěn)定劑；
[0009]②配制試劑b:試劑b包括緩沖液、谷氨酸脫氫酶和穩(wěn)定劑；
[0010]③將試劑a、試劑b和血清樣本按120?240:40:10?20比例混合反應(yīng)，比色法測(cè)定血清樣本中血氨含量，或在自動(dòng)生化儀上檢測(cè)血氨含量；
[0011]所述試劑a中各組分的濃度為:緩沖液50_250mM、α -酮戊二酸2_50mM、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸0.15-0.45mM、穩(wěn)定劑占單體試劑總體積的0.05-3% ；
[0012]所述試劑b中各組分的濃度為:緩沖液50-200禮、谷氨酸脫氫酶500-40000U。
[0013]本發(fā)明所述的測(cè)定方法，步驟③中所述試劑a、試劑b和血清樣本按160?200:40:15?20比例混合。
[0014]本發(fā)明所述的測(cè)定方法，步驟③中所述試劑a、試劑b和血清樣本按200:40:20比例混合。
[0015]本發(fā)明所述的測(cè)定方法，所述試劑a和試劑b中的緩沖液選自3_(環(huán)己胺)-2_羥基-1-丙磺酸緩沖液、三羥甲基氨基甲烷緩沖液、嗎啉代丙烷磺酸緩沖液、3-(環(huán)己胺基)丙磺酸緩沖液、3-(環(huán)己氨基)-1_丙磺酸或N-三(羥甲基)甲基-3-氨基丙烷磺酸緩沖液中的至少一種或多種的混合物。
[0016]本發(fā)明所述的測(cè)定方法，所述試劑a中各組分的濃度為:緩沖液50_150mM、α -酮戊二酸10-30mM、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸0.15-0.25mM、穩(wěn)定劑占單體試劑總體積的0.05-1%。
[0017]本發(fā)明所述的測(cè)定方法，所述緩沖液的pH為7.0-12.0。
[0018]本發(fā)明所述的測(cè)定方法，所述緩沖液的pH為為8.0-10.0。
[0019]本發(fā)明所述的測(cè)定方法，所述穩(wěn)定劑選自牛血清白蛋白、EDTA鈉/鉀鹽、乙二醇、疊氮鈉或TritonX-1OO中的至少一種或多種。
[0020]本發(fā)明所述的測(cè)定方法，所述試劑a的組成為:100mM3-(環(huán)己氨基)_1_丙磺酸，pH=9.5，α -酮戊二酸15mM，還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸0.20mM, EDTA鈉鹽0.05%，疊氮鈉0.1% ;所述試劑b的組成為50mM三羥甲基氨基甲烷緩沖液，pH=8.0，谷氨酸脫氫酶20000U，BSA0.05%,疊氮鈉 0.1%。
[0021]本發(fā)明提供了一種應(yīng)用所述血氨檢測(cè)液體雙試劑檢測(cè)血清中血氨含量的方法，包括:將待檢測(cè)樣品加入到血氨檢測(cè)液體單試劑進(jìn)行反應(yīng)；將反應(yīng)物置于紫外/可見分光光度計(jì)或半、全自動(dòng)生化分析儀上，檢測(cè)340nm波長(zhǎng)下吸光度的下降，計(jì)算血氨含量。
[0022]其中待檢測(cè)樣品與血氨檢測(cè)液體單試劑比例為120~240:40:10~20 ;所述的反應(yīng)時(shí)間優(yōu)選為3-10分鐘，可在25-40°C范圍內(nèi)檢測(cè)，最優(yōu)溫度為37°C。
[0023]37°C和42°C加速 破壞試驗(yàn)和臨床相關(guān)性試驗(yàn)表明，本發(fā)明所制備的血氨液體雙試劑穩(wěn)定性良好，解決了凍干劑需要凍干和復(fù)溶的繁瑣問題，可現(xiàn)配現(xiàn)用，(2-8) °C可穩(wěn)定18個(gè)月，測(cè)值準(zhǔn)確，適用于手動(dòng)、半自動(dòng)、自動(dòng)檢測(cè)系統(tǒng)，易于在各大醫(yī)院推廣使用。
【具體實(shí)施方式】
[0024]下述非限制性實(shí)施例可以使本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。
[0025]實(shí)施例1
[0026]配制試劑并檢測(cè):按表1中各組分濃度配制試劑a和試劑b，將試劑a、試劑b和血清樣本按120~240:40:10~20比例混合反應(yīng)，于生化儀上檢測(cè)血清樣本中血氨含量，或紫外分光光度儀上檢測(cè)。
[0027]表1
[0028]
【權(quán)利要求】
1.一種血清中氨含量的測(cè)定方法，其特征在于包括如下步驟: ①配制試劑a:試劑a包括緩沖液、α -酮戊二酸、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸和穩(wěn)定劑； ②配制試劑b:試劑b包括緩沖液、谷氨酸脫氫酶和穩(wěn)定劑； ③將試劑a、試劑b和血清樣本按120?240:40:10?20比例混合反應(yīng)，比色法測(cè)定血清樣本中血氨含量，或在自動(dòng)生化儀上檢測(cè)血氨含量； 所述試劑a中各組分的濃度為:緩沖液50-250mM、α -酮戊二酸2_50mM、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸0.15-0.45mM、穩(wěn)定劑占單體試劑總體積的0.05-3% ； 所述試劑b中各組分的濃度為:緩沖液50-200mM、谷氨酸脫氫酶500-40000U。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測(cè)定方法，其特征在于步驟③中所述試劑a、試劑b和血清樣本按160?200:40:15?20比例混合。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測(cè)定方法，其特征在于步驟③中所述試劑a、試劑b和血清樣本按200:40:20比例混合。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測(cè)定方法，其特征在于所述試劑a和試劑b中的緩沖液選自3_(環(huán)己胺)-2-羥基-1-丙磺酸緩沖液、三羥甲基氨基甲烷緩沖液、嗎啉代丙烷磺酸緩沖液、3-(環(huán)己胺基)丙磺酸緩沖液、3-(環(huán)己氨基)-1-丙磺酸或N-三(羥甲基)甲基-3-氨基丙烷磺酸緩沖液中的至少一種或多種的混合物。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測(cè)定方法，其特征在于所述試劑a中各組分的濃度為:緩沖液50-150mM、α -酮戊二酸10_30mM、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸0.15-0.25mM、穩(wěn)定劑占單體試劑總體積的0.05-1%。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一權(quán)利要求所述的測(cè)定方法，其特征在于:所述緩沖液的pH為7.0-12.0。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一權(quán)利要求所述的測(cè)定方法，其特征在于:所述緩沖液的pH為為 8.0-10.0。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測(cè)定方法，其特征在于:所述穩(wěn)定劑選自牛血清白蛋白、EDTA鈉/鉀鹽、乙二醇、疊氮鈉或TritonX-1OO中的至少一種或多種。
9.根據(jù)權(quán)利要求1?8任一權(quán)利要求所述的測(cè)定方法，其特征在于所述試劑a的組成為:100mM3-(環(huán)己氨基)-1-丙磺酸，pH=9.5，α -酮戊二酸15mM，還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸 0.20mM, EDTA 鈉鹽 0.05%,疊氮鈉 0.1% ； 所述試劑b的組成為50mM三羥甲基氨基甲烷緩沖液，pH=8.0，谷氨酸脫氫酶20000U，BSA0.05%,疊氮鈉 0.1%。
【文檔編號(hào)】G01N21/33GK103543117SQ201310500886
【公開日】2014年1月29日 申請(qǐng)日期:2013年10月21日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月21日
【發(fā)明者】秦宏佳 申請(qǐng)人:大連市沙河口區(qū)中小微企業(yè)服務(wù)中心