一種用于檢測雞烏膚位點基因型的引物、試劑盒及檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于檢測雞烏膚位點基因型的引物、試劑盒及檢測方法，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明針對編碼基因EDN3基因設(shè)計引物對P，提取待鑒定雞的基因組DNA，進(jìn)行熒光定量PCR，檢測待測雞烏膚位點EDN3基因的相對拷貝數(shù)，進(jìn)而判定待測雞烏膚位點的基因型。該方法簡便，分型準(zhǔn)確，成本低，效率高，不需要測序，不需要特殊的儀器，易推廣普及。通過檢測烏膚位點EDN3基因的相對拷貝數(shù)，能夠判定待測雞烏膚位點的基因型，從而對雞群進(jìn)行選留，提高后代皮膚顏色的一致性，在烏膚雞品種選育中具有廣泛應(yīng)用。
【專利說明】—種用于檢測雞烏膚位點基因型的引物、試劑盒及檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明具體涉及一種用于檢測雞烏膚位點基因型的引物，以及包含該引物的試劑盒及檢測方法，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】 [0002]烏骨雞是聞名中外的藥用家禽，1874年被國際上承認(rèn)為標(biāo)準(zhǔn)品種，它具有特殊的藥用、營養(yǎng)及觀賞價值。研究表明，烏雞的藥用價值主要在于其黑色素的作用，烏膚性狀是消費者對黑色素表達(dá)最直接的判定。
[0003]烏膚基因座Fm是影響雞烏膚性狀的基因座位，其座位上的顯性等位基因Fm是引起雞類纖維色素增生(f ibromelanosis)的原因,從而使攜帶此基因型的個體全身皮膚呈現(xiàn)烏色。目前，已確認(rèn)雞烏膚基因基因座編碼ATP5E(ATP synthase epsilonsubunit), TUBBl(tubulin, betal), SLM02 (slowmo homolog2)和 EDN3 (endothelin3)四個蛋白。研究表明:雞烏膚位點等位基因是由于 ATP5E (ATP synthase epsilonsubunit), TUBBl (tubulin,betal), SLM02 (slowmo homolog2)和 EDN3 (endothelin3)等基因拷貝數(shù)增加造成的。其中，Endothelin3 (EDN3)蛋白，是影響色素細(xì)胞發(fā)育的一個主要因素。該基因座上EDN3基因拷貝數(shù)的變化導(dǎo)致色素細(xì)胞過量生成，而過量的色素細(xì)胞產(chǎn)生大量的黑色素。顯性等位基因Fm是EDN3等四個基因相對拷貝數(shù)為2的基因型，隱性等位基因fm是EDN3等四個基因相對拷貝數(shù)為I的基因型。對于拷貝數(shù)變異的基因片段來說，常規(guī)PCR擴(kuò)增后瓊脂糖凝膠電泳無法對純合子和雜合子進(jìn)行分型，必須使用熒光定量PCR的方法對拷貝數(shù)變異進(jìn)行鑒定，而目前仍缺乏一種行之有效的鑒定方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種用于檢測雞烏膚位點基因型的引物。
[0005]同時，本發(fā)明還提供一種用于檢測雞烏膚位點基因型的試劑盒。
[0006]最后，本發(fā)明還提供一種檢測雞烏膚位點基因型的方法。
[0007]為了實現(xiàn)以上目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是:
[0008]一種用于檢測雞烏膚位點基因型的引物，包括引物對P，
[0009]所述的引物對P為:
[0010]上游引物P-F:5’ -CTTGACTTTTGGGATTTACCT-3’(如 SEQ ID N0.1 所示)；
[0011]下游引物P-R:5，-ACTGGTGCAGTATTTTCTGTT-3’(如 SEQ ID N0.2 所示)。
[0012]一種用于檢測雞烏膚位點基因型的試劑盒，主要包括引物對P:
[0013]上游引物P-F:5’ -CTTGACTTTTGGGATTTACCT-3’ ；
[0014]下游引物P-R:5’ -ACTGGTGCAGTATTTTCTGTT-3’。
[0015]優(yōu)選的，一種用于檢測雞烏膚位點基因型的試劑盒，還包括熒光定量PCR2X緩沖液、滅菌超純水和熒光定量標(biāo)準(zhǔn)品。[0016]所述的熒光定量PCR2X緩沖液主要包括5U/ μ L Taq DNA Polymerase,10XBuffer,25mM MgCl2, 2mM dNTPs, SYBR Green I。
[0017]所述的熒光定量標(biāo)準(zhǔn)品為白膚雞全血基因組DNA，濃度分別為80，40，20，10，5，2.5ng/ μ L0
[0018]一種檢測雞烏膚位點基因型的方法，包括以下步驟:以包含EDN3基因的待測雞全血基因組DNA為模板，以引物對P為引物進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增片段的DNA序列如SEQ ID N0.3所示。該序列的全長為134bp，是位于雞烏膚位點EDN3基因上的分子標(biāo)記，能夠檢測雞烏膚基因位點EDN3基因是否存在拷貝數(shù)變異。
[0019]所述的熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為:熒光定量PCR2X緩沖液10 μ L，ddH207 μ L，P-F0.5 μ L，P-R0.5 μ L，DNA 模板 2 μ L。[0020]所述的熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序為:95°C預(yù)變性2min;40個循環(huán):95°C變性30s，57。。退火 30s，72。。延伸 30s ;72°C 延伸 IOmin ;20°C保存。
[0021]具體的，一種檢測雞烏膚位點基因型的方法，還包括以下步驟:利用標(biāo)準(zhǔn)曲線求待測雞EDN3基因的相對拷貝數(shù)，根據(jù)其相對拷貝數(shù)鑒定雞烏膚位點的基因型。
[0022]所述的標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作方法為:以白膚雞全血基因組DNA作為熒光定量標(biāo)準(zhǔn)品，濃度分別為80，40，20，10，5，2.5ng/yL,以引物對P為引物進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，以上述六個標(biāo)準(zhǔn)品的Ct值為縱坐標(biāo)，以濃度的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。
[0023]所述的利用標(biāo)準(zhǔn)曲線求待測雞EDN3基因的相對拷貝數(shù)的方法為:熒光定量PCR擴(kuò)增前，先將待測雞的DNA稀釋到同一濃度IOng/ μ L，再將待測雞的Ct值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程中，求出其對應(yīng)的對數(shù)濃度，再轉(zhuǎn)化為濃度，即為該待測雞EDN3基因的相對拷貝數(shù)。
[0024]所述的根據(jù)相對拷貝數(shù)鑒定雞烏膚位點的基因型的方法為:當(dāng)待測雞EDN3基因的相對拷貝數(shù)為2時，該個體為烏膚純合子(FmFm);當(dāng)待測雞EDN3基因的相對拷貝數(shù)為1.5時，該個體為烏膚雜合子(Fmfm);當(dāng)待測雞EDN3基因的相對拷貝數(shù)為I時，該個體為非烏膚純合子(fmfm)。
[0025]本發(fā)明的有益效果:
[0026]本發(fā)明以雞烏膚位點EDN3基因的DNA全長序列為模板，設(shè)計引物對P，進(jìn)行熒光定量PCR，計算待測雞烏膚位點EDN3基因的相對拷貝數(shù)，進(jìn)而判定待測雞烏膚位點的基因型，從而對雞群進(jìn)行選留，提高后代皮膚顏色的一致性，在烏膚雞品種選育中具有廣泛應(yīng)用。
[0027]本發(fā)明通過提取待鑒定雞的基因組DNA，將其濃度調(diào)為一致(IOng/μ L);使用引物對P，以調(diào)整濃度后的DNA為模板進(jìn)行熒光定量PCR，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行計算；將白膚個體的EDN3基因的相對拷貝數(shù)設(shè)為1，當(dāng)待測雞的EDN3基因的相對拷貝數(shù)為1.5時，待測個體為烏膚雜合子(Fmfm)，表型為烏膚；當(dāng)待測雞的EDN3基因的相對拷貝數(shù)為2時，待測個體為烏膚純合子(FmFm)，表型為烏膚。該方法簡便，分型準(zhǔn)確，成本低，效率高，不需要測序，不需要特殊的儀器，易推廣普及。
[0028]本發(fā)明通過檢測雞不同皮膚表型群體中EDN3基因的相對拷貝數(shù)，發(fā)現(xiàn)純種烏膚雞種EDN3基因的相對拷貝數(shù)為純種白膚雞種EDN3基因的相對拷貝數(shù)的2倍；而純種的烏膚雞種與白膚雞種的雜交后代的EDN3基因的相對拷貝數(shù)為純種白膚雞種EDN3基因的相對拷貝數(shù)的1.5倍。[0029] 本發(fā)明通過對不同雞品種群體和不同基因型群體進(jìn)行熒光定量PCR檢測并進(jìn)行判型驗證了其準(zhǔn)確性。研究表明該方法能有效地診斷雞烏膚位點的基因型，可以用于雞烏膚位點基因型判定的分子標(biāo)記輔助選擇。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0030]圖1為本發(fā)明實施例1的技術(shù)路線示意圖；
[0031]圖2為實施例1中的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；
[0032]圖3為實施例2中的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
【具體實施方式】
[0033]下述實施例僅對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明，但不構(gòu)成對本發(fā)明的任何限制。
[0034]實施例1
[0035]本實施例中檢測四個不同品種雞烏膚位點基因型的方法，技術(shù)路線示意圖如圖1所示，具體包括以下步驟:
[0036]( I)試樣的制備與保存
[0037]河南農(nóng)業(yè)大學(xué)種雞站5只固始雞(白膚)、5只絲羽烏骨雞(烏膚)、5只盧氏雞(白膚)和5只貴妃雞(白膚)翅靜脈采血，加1/3抗凝劑，用氯仿-苯酚法提取血液DNA，將DNA樣品保存于4°C冰箱保存?zhèn)溆谩?br> [0038](2 ) DNA樣品濃度調(diào)整
[0039]將待測樣品的DNA利用微量分光光度儀進(jìn)行濃度測定，根據(jù)所測濃度，將每一個待測樣品DNA濃度加TE稀釋至IOng/μ L，稀釋后用微量紫外分光光度計測定，4°C冰箱保存?zhèn)溆谩?br> [0040](3)標(biāo)準(zhǔn)品的制備
[0041]隨機取一個固始雞DNA樣本，測定濃度后，將其稀釋至80ng/ μ L，作為標(biāo)準(zhǔn)品母液，將母液倍比稀釋為80，40，20，10,5,2.5ng/μ L，作為制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的6個標(biāo)準(zhǔn)品。
[0042](4)引物設(shè)計
[0043]以雞EDN3基因的DNA序列(GenBank登錄號為:NC_006107.3)為模板，設(shè)計引物對P:
[0044]上游引物P-F:5 ’ -CTTGACTTTTGGGATTTACCT-3 ’ ；
[0045]下游引物P-R: 5，-ACTGGTGCAGTATTTTCTGTT-3，。
[0046](5 )熒光定量PCR擴(kuò)增
[0047]以引物對P為擴(kuò)增引物，建立20yL體系:熒光定量PCR2X緩沖液(主要包括5U/ μ LTaq DNA Polymerase, 10 XBuffer, 25mM MgCl2, 2mM dNTPs, SYBR Green I) 10 μ L,ddH207 μ L, P-F0.5 μ L, P-R0.5 μ L，DNA 模板 2 μ L ;反應(yīng)程序為:95°C預(yù)變性 2min ;95°C變性 30s，57°C退火 30s，72。。延伸 30s, 40 個循環(huán)；72°C延伸 IOmin ;20°C保存。
[0048](6)熒光定量PCR擴(kuò)增數(shù)據(jù)處理和基因型結(jié)果的判定
[0049]以80、40、20、10、5、2.5ng/ μ L的6個標(biāo)準(zhǔn)品的Ct值為縱坐標(biāo)，以濃度的對數(shù)為橫坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖2所示。求出標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程y=_0.285x+7.665，R2=0.9986和該反應(yīng)的擴(kuò)增效率92.72%。[0050]將待測個體的Ct值帶入方程，求出其對應(yīng)的對數(shù)濃度，再轉(zhuǎn)化為濃度，即為該待測雞的相對拷貝數(shù)。試驗結(jié)果如表1~4所示。
[0051 ] 表1固始雞烏膚位點EDN3基因相對拷貝數(shù)
【權(quán)利要求】
1.一種用于檢測雞烏膚位點基因型的引物，其特征在于:包括引物對P:
上游引物 P-F:5’ -CTTGACTTTTGGGATTTACCT-3’ ；
下游引物 P-R:5’ -ACTGGTGCAGTATTTTCTGTT-3’。
2.一種用于檢測雞烏膚位點基因型的試劑盒，其特征在于:主要包括引物對P:
上游引物 P-F:5’ -CTTGACTTTTGGGATTTACCT-3’ ；
下游引物 P-R:5’ -ACTGGTGCAGTATTTTCTGTT-3’。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于檢測雞烏膚位點基因型的試劑盒，其特征在于:還包括熒光定量PCR2X緩沖液、滅菌超純水和熒光定量標(biāo)準(zhǔn)品。
4.一種檢測雞烏膚位點基因型的方法，其特征在于:包括以下步驟:以包含EDN3基因的待測雞全血基因組DNA為模板，以引物對P為引物進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增片段的DNA序列如SEQ ID N0.3所示； 所述的引物對P為:
上游引物 P-F:5’ -CTTGACTTTTGGGATTTACCT-3’，
下游引物 P-R:5’ -ACTGGTGCAGTATTTTCTGTT-3’。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測雞烏膚位點基因型的方法，其特征在于:所述的熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為:熒光定量PCR2X緩沖液10μ L，ddH207 y L，P-F0.5μ L，P-R0.5μ L，DNA 模板 2 μ L。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測雞烏膚位點基因型的方法，其特征在于:所述的熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序為:95°C預(yù)變性2min ；40個循環(huán):95°C變性30s，57°C退火30s，72°C延伸 30s ;72°C延伸 IOmin ;20°C保存。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測雞烏膚位點基因型的方法，其特征在于:還包括以下步驟:利用標(biāo)準(zhǔn)曲線求得待測雞EDN3基因的相對拷貝數(shù)，根據(jù)其相對拷貝數(shù)鑒定雞烏膚位點的基因型。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的檢測雞烏膚位點基因型的方法，其特征在于:所述的標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作方法為:以白膚雞全血基因組DNA作為熒光定量標(biāo)準(zhǔn)品，濃度分別為80，40，20，10,5,2.5ng/yL,以引物對P為引物進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，以上述六個標(biāo)準(zhǔn)品的Ct值為縱坐標(biāo)，以濃度的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的檢測雞烏膚位點基因型的方法，其特征在于:所述的利用標(biāo)準(zhǔn)曲線求待測雞EDN3基因的相對拷貝數(shù)的方法為:熒光定量PCR擴(kuò)增前，先將待測雞的DNA稀釋到同一濃度IOng/ μ L，再將待測雞的Ct值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程中，求出其對應(yīng)的對數(shù)濃度，再轉(zhuǎn)化為濃度，即為該待測雞EDN3基因的相對拷貝數(shù)。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的檢測雞烏膚位點基因型的方法，其特征在于:所述的根據(jù)相對拷貝數(shù)鑒定雞烏膚位點的基因型的方法為:當(dāng)待測雞EDN3基因的相對拷貝數(shù)為2時，該個體為烏膚純合子；當(dāng)待測雞EDN3基因的相對拷貝數(shù)為1.5時，該個體為烏膚雜合子；當(dāng)待測雞EDN3基因的相對拷貝數(shù)為I時，該個體為非烏膚純合子。
【文檔編號】G01N21/64GK103571952SQ201310509015
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2013年10月24日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月24日
【發(fā)明者】康相濤, 韓瑞麗, 楊朋坤, 王丹丹, 李轉(zhuǎn)見, 田亞東, 蔣瑞瑞, 孫桂榮, 呂世杰, 李國喜, 閆峰賓, 王彥彬, 劉小軍, 許殿明, 李孝法, 索智勇, 曹向陽 申請人:河南農(nóng)業(yè)大學(xué)