草魚(yú)呼腸孤病毒ⅱ型s10基因編碼的重組蛋白、由其制備的多克隆抗體及應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種草魚(yú)呼腸孤病毒Ⅱ型S10基因編碼的重組蛋白、由其制備的多克隆抗體及應(yīng)用。草魚(yú)呼腸孤病毒Ⅱ型S10基因編碼蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO:2所示，編碼該蛋白的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。本發(fā)明獲得的重組蛋白具有較好的免疫原性，與GCRV其它結(jié)構(gòu)蛋白相比，其誘導(dǎo)免疫動(dòng)物產(chǎn)生的特異性抗體效價(jià)更高。進(jìn)一步試驗(yàn)表明，用S10重組蛋白免疫草魚(yú)，可使草魚(yú)誘導(dǎo)產(chǎn)生較高的特異性抗體，并能對(duì)草魚(yú)呼腸孤病毒強(qiáng)毒株的攻擊起到一定的免疫保護(hù)作用。因此，對(duì)GCRVⅡ型S10基因編碼蛋白的研究和應(yīng)用，對(duì)開(kāi)發(fā)草魚(yú)出血病新型疫苗及免疫學(xué)檢測(cè)試劑盒具有極其重要的意義，為草魚(yú)出血病提供新的有效解決途徑。
【專(zhuān)利說(shuō)明】草魚(yú)呼腸孤病毒II型SI O基因編碼的重組蛋白、由其制備的多克隆抗體及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物基因工程領(lǐng)域，具體涉及由草魚(yú)呼腸孤病毒II型SlO基因編碼的重組SlO抗原蛋白、由SlO抗原蛋白制備的多克隆抗體及其應(yīng)用。 【背景技術(shù)】
[0002]由草魚(yú)呼腸孤病毒(Grass Crap Reovirus, GCRV)引起的草魚(yú)出血病給我國(guó)草魚(yú)養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重制約著我國(guó)草魚(yú)養(yǎng)殖的健康發(fā)展。GCRV具雙層衣殼，病毒粒子平均直徑為60 nm~70 nm，二十面體對(duì)稱(chēng)，無(wú)囊膜，基因組由11條分節(jié)段的雙鏈RNA組成，根據(jù)其基因節(jié)段的大小，將其基因組按分子量大小分為3個(gè)組，分別命名為L(zhǎng)1-L3、M4-M6和S7-S11。這11個(gè)RNA節(jié)段可以編碼12種多肽蛋白，其中7種結(jié)構(gòu)蛋白，分別命名為VP1-VP7，其余為非結(jié)構(gòu)蛋白，命名為NS1-NS5。由于病毒的基因組的分節(jié)段特性，不同毒株之間可發(fā)生重配而產(chǎn)生高度變異，使得草魚(yú)呼腸孤病毒的毒株較為復(fù)雜，目前已報(bào)道有 20 多個(gè)分離株，包括 GCRV854、GCRV861、GCRV873、GCRV875、GCRV876、GCRV991、GCRV096、GCRV829、H962、ZV-8802、ZV-8909、GCHV-854、GCRV-HZ08、JX09-01、GCRV-104、GCRV-9014、GCRV-2008、⑶108等，不同分離株在基因組序列、基因組帶型、細(xì)胞病變、對(duì)草魚(yú)的致病力等方面差異較大。根據(jù)現(xiàn)有的分離株基因序列信息，進(jìn)行核苷酸序列與氨基酸序列比對(duì)以及構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析，所有毒株總體上可以分為3大類(lèi)，分為3個(gè)基因型，即GCRV I型(代表株為 GCRV-873 與 GCRV-JX09-01)、GCRV II 型(代表株為 GCRV-HZ08)和 GCRV III型(代表株為GCRV-104為)。當(dāng)前，全國(guó)各地分離到的流行株中，三類(lèi)亞型均有報(bào)道，有單獨(dú)感染，也有混合感染，以HZ08株為代表的GCRV II型是目前導(dǎo)致草魚(yú)出血病流行和爆發(fā)的主要株型。
[0003]目前，對(duì)于草魚(yú)出血病的防治，還沒(méi)有特異有效的治療藥物和方法，最為有效的辦法仍然是免疫預(yù)防，草魚(yú)出血病細(xì)胞滅活疫苗與細(xì)胞弱毒疫苗的應(yīng)用，對(duì)減少草魚(yú)出血病的發(fā)生起到了一定的效果。但滅活疫苗的免疫原性比較差，需要足夠大的量才能引起免疫應(yīng)答，而大劑量又可引起局部或全身反應(yīng)，并且所獲得的免疫應(yīng)答比較短暫，需要多次注射來(lái)增強(qiáng)免疫應(yīng)答，而滅活疫苗的生產(chǎn)成本又比較高；細(xì)胞弱毒疫苗存在毒力返強(qiáng)的危險(xiǎn)，有散毒的風(fēng)險(xiǎn)。和傳統(tǒng)疫苗相比，基因工程疫苗存在較多有點(diǎn)，其抗原成分單一、免疫原性強(qiáng)，能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答,持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)；可規(guī)?；a(chǎn),成本相對(duì)低廉。此外，一種疫苗的免疫效果如何，需要合適的方法來(lái)檢測(cè)和評(píng)價(jià)。通過(guò)免疫學(xué)方法來(lái)檢測(cè)免疫動(dòng)物特異性抗體的有無(wú)及抗體效價(jià)的高低是目前最為簡(jiǎn)便和有效的方法。由于草魚(yú)呼腸孤病毒免疫原性比較差，至今還沒(méi)有一種有效的免疫學(xué)診斷方法，尤其是缺乏評(píng)價(jià)疫苗免疫效果的血清學(xué)檢測(cè)方法。
[0004]GCRV-873 ( I型)是第一個(gè)完成全基因組測(cè)序的水生呼腸孤病毒，是至今為止研究最為深入和系統(tǒng)的毒株，關(guān)于GCRV-873株基因組各基因節(jié)段及其編碼蛋白的功能和作用研究比較多。GCRV-HZ08 (II型)為一個(gè)新的分離株，對(duì)其各節(jié)段基因及其編碼蛋白的功能和作用還未有深入研究。通過(guò)生物信息學(xué)軟件分析表明，HZ08株SlO編碼一個(gè)長(zhǎng)達(dá)345AA的VP38蛋白，分子量為38.39kDa，該蛋白與禽呼腸孤病毒(Avian Reovirus，ARV)的非結(jié)構(gòu)蛋白sNS同源性約14.5%,與哺乳動(dòng)物正呼腸孤病毒(Mammal reovirus,MRV)的非結(jié)構(gòu)sNS的同源性約7.2%，在核苷酸和氨基酸水平上均找不到和水生呼腸孤病毒的同源基因。因此，一直以來(lái)GCRV-HZ08株SlO基因編碼蛋白被認(rèn)為是非結(jié)構(gòu)蛋白，且可能具有與MRV和ARV的sNS蛋白相似的功能。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]我們的最近研究發(fā)現(xiàn):GCRV-HZ08株SlO基因編碼蛋白為結(jié)構(gòu)蛋白，且比GCRV其它結(jié)構(gòu)蛋白誘導(dǎo)免疫動(dòng)物產(chǎn)生更高效價(jià)的特異性抗體，具有更好的免疫原性；針對(duì)SlO編碼蛋白的抗體可以特異性識(shí)別GCRV II型毒株，并對(duì)該類(lèi)型毒株具有很強(qiáng)的中和能力；進(jìn)一步試驗(yàn)表明，用SlO重組蛋白免疫草魚(yú)，可使草魚(yú)誘導(dǎo)產(chǎn)生較高的特異性抗體，并能對(duì)草魚(yú)呼腸孤病毒強(qiáng)毒株的攻擊起到一定的免疫保護(hù)作用。因此，對(duì)GCRV II型SlO基因編碼蛋白的研究和應(yīng)用，對(duì)開(kāi)發(fā)草魚(yú)出血病新型疫苗及免疫學(xué)檢測(cè)試劑盒具有極其重要的意義。
[0006]由此，本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種SlO抗原蛋白，及由其制備得到的多克隆抗體。
[0007]本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供上述SlO抗原蛋白和抗SlO抗原蛋白的多克隆抗體在制備草魚(yú)出血病基因工程疫苗或制備草魚(yú)呼腸孤病毒檢測(cè)試劑盒上中的應(yīng)用。
[0008]本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是: 一種草魚(yú)呼腸孤病毒II型SlO基因編碼蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示。
[0009]一種編碼權(quán)利要求1所述蛋白的核酸，其堿基序列如SEQ ID NO:1所示。
[0010]上述SlO基因編碼蛋白作為魚(yú)呼腸孤病毒抗原蛋白的應(yīng)用。
[0011]一種多克隆抗體，是以氨基酸序列為SEQ ID NO: 2所示的蛋白為抗原，免疫動(dòng)物制備所得。
[0012]上述SlO基因編碼蛋白和/或上述的抗SlO基因編碼蛋白的多克隆抗體在制備草魚(yú)出血病基因工程疫苗中的應(yīng)用。
[0013]上述SlO基因編碼蛋白在制備草魚(yú)呼腸孤病毒檢測(cè)試劑盒上的應(yīng)用。
[0014]一種基因工程疫苗，含有上述的SlO基因編碼蛋白或抗SlO基因編碼蛋白的多克隆抗體。
[0015]一種檢測(cè)草魚(yú)呼腸孤病毒的試劑盒，含有上述的SlO基因編碼蛋白。
[0016]本發(fā)明的有益效果是:
本發(fā)明獲得的重組蛋白具有較好的免疫原性，與GCRV其它結(jié)構(gòu)蛋白相比，其誘導(dǎo)免疫動(dòng)物產(chǎn)生的特異性抗體效價(jià)更高。以SlO基因編碼蛋白免疫草魚(yú)，可使草魚(yú)誘導(dǎo)產(chǎn)生較高的特異性抗體，并能對(duì)草魚(yú)呼腸孤病毒強(qiáng)毒株的攻擊起到較好的免疫保護(hù)效果(保護(hù)率為73.3%)。因此，SlO基因編碼蛋白是研制草魚(yú)出血病基因工程疫苗較好的候選抗原。以SlO基因編碼蛋白作為檢測(cè)草魚(yú)呼腸孤病毒抗體效價(jià)的間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)的包被抗原，能很好的識(shí)別GCRV感染或疫苗免疫草魚(yú)產(chǎn)生的特異性抗體；并且，通過(guò)該方法獲取的包被抗原，具有快速、特異、敏感、簡(jiǎn)便和安全的優(yōu)點(diǎn)，克服了組織和細(xì)胞培養(yǎng)方法產(chǎn)生完整病毒作為間接ELISA包被抗原而造成的操作過(guò)程繁瑣、不穩(wěn)定、產(chǎn)量低、成本高的缺點(diǎn)。因此，本發(fā)明的GCRV II型SlO基因及其編碼蛋白，對(duì)開(kāi)發(fā)草魚(yú)出血病新型疫苗、免疫學(xué)檢測(cè)試劑盒及治療產(chǎn)品具有重要的意義，為草魚(yú)出血病提供新的有效解決途徑。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0017]圖1為GCRV II型毒株SlO基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖，圖1中M為DL marker1000 ；1為陰性對(duì)照；2為以pVAXl-S10質(zhì)粒為模板的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；
圖2為重組質(zhì)粒pET-32a-S10雙酶切鑒定結(jié)果，圖2中M為DL marker 15000 ；1為重組質(zhì)粒pET-32a-S10雙酶切產(chǎn)物；2為空載體pET_32a ( + )雙酶切產(chǎn)物；
圖3為SDS-PAGE分析重組質(zhì)粒pET-32a-S10表達(dá)產(chǎn)物及其可溶性，圖3中M為低分子質(zhì)量蛋白質(zhì)marker ；1為IPTG誘導(dǎo)的pET_32a_S10菌體；2為IPTG誘導(dǎo)的pET_32a_S10菌液上清；3為未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的pET-32a-S10菌體；4為未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)pET-32a_S10的菌液上清；5為IPTG誘導(dǎo)的pET-32a ( + )的菌體；6為菌體超聲波破碎后的上清；7為菌體超聲波破碎后的沉淀；
圖4為SlO基因編碼重組蛋白經(jīng)Ni柱純化后SDS-PAGE分析結(jié)果，圖4中M低分子質(zhì)量蛋白質(zhì)marker ；1為純化的SlO基因編碼重組蛋白；2為通過(guò)Ni柱的流穿液；3為未純化的菌體總蛋白；
圖5為western blot分析SlO編碼蛋白抗血清特性，圖5中M低分子質(zhì)量蛋白質(zhì)marker ；1為純化的HZ08毒株；2為pET_32a ( + )空載體；3為純化的SlO基因編碼重組蛋白；
圖6為間接免疫熒光分析SlO編碼蛋白抗血清特性，圖6中A為接種HZ08株的CIK細(xì)胞為未接種病毒的正常CIK細(xì)胞對(duì)照。
【具體實(shí)施方式】
[0018]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明，但并不局限于此。
[0019]以下實(shí)施例中所采用的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)包括PCR擴(kuò)增、質(zhì)粒提取、質(zhì)粒轉(zhuǎn)化、DNA片段連接、酶切、凝膠電泳等，如無(wú)特殊說(shuō)明，通常按照常規(guī)方法操作，具體可參見(jiàn)《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第三版)(Sambrook J, Russell Dff, Janssen K, Argentine J.黃培堂等譯，2002，北京:科學(xué)出版社)，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例
[0020]一、草魚(yú)呼腸孤病毒HZ08株RNA的提取和SlO基因片段擴(kuò)增
按照Qiagen RNA提取試劑盒(購(gòu)自Qiagen公司，貨號(hào):74104)的說(shuō)明書(shū)步驟,從感染GCRV HZ08株病毒的CIK細(xì)胞內(nèi)中提取RNA，用TAKARA (購(gòu)自大連寶生物工程有限公司，貨號(hào):)反轉(zhuǎn)錄試劑盒將病毒RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。GCRV HZ08病毒株由珠江水產(chǎn)研究所魚(yú)病
室保藏。
[0021]根據(jù)GenBank (GenBank:⑶350747.1)中 GCRV-HZ08 株 SlO 基因序列設(shè)計(jì) I 對(duì)引物，上游引物:5’_ ATA GGA TCC ATG GCG GGT GTG TCT CT CAA CA - 3’ (SEQ ID NO:3)；下游引物:5’-GCT AAG CTT CAG CAT CTG CGC AAA TAT ACG TC -3’ (SEQ ID NO:4)，在上下游引物序列中分別插入BanH I和Hand III酶切位點(diǎn)(帶下劃線的基因)，以上述制備的cDNA為模版，對(duì)SlO基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。每25yL反應(yīng)體系中加入2.5yL 10XPCR reactionbuffer,0.5μ L dNTP (IOmM each)，上、下游引物分別為 0.5 μ L，2 μ L cDNA 作為模版，LATaq 酶 0.25 μ L，ddH20 18.75 μ L ;反應(yīng)條件為:95°C預(yù)變性 5min，94°C 40s，54°C 45s, 72°Clmin,共30個(gè)循環(huán)，72°C延伸8min。
[0022]PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在約IlObp處出現(xiàn)一條預(yù)期大小一致的特異性擴(kuò)增條帶(見(jiàn)圖1)，用膠回收試劑盒回收純化目的條帶，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證與預(yù)期相符。
[0023]二、pET-32a_S10重組表達(dá)載體構(gòu)建
將PCR回收產(chǎn)物和原核表達(dá)載體pET-32a ( + )分別雙酶切處理(BanH I I μ I,Hand IIII μ 1，IOXK buffer 2 μ 1，質(zhì)粒16 μ I)后，經(jīng)1%瓊脂糖電泳分析，膠回收SlO目的片段和處理好的pET_32a ( + )載體，用T4 DNA連接酶連接SlO目的片段和pET_32a ( + ) (T4 Liqase1.5μ 1，T4 Liqase buffer 1.5μ l，pET_32a ( + ) 3μ I,SlO 目的片段 9 μ 1，共 15μ I)，，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 α，篩選陽(yáng)性克隆，菌液PCR鑒定為陽(yáng)性的提取質(zhì)粒，質(zhì)粒經(jīng)雙酶切和測(cè)序鑒定正確后，命名為pET-32a-S10，保存用于后續(xù)試驗(yàn)。
[0024]PCR和雙酶切鑒定結(jié)果(見(jiàn)圖2)均顯示重組表達(dá)質(zhì)粒pET-32a_S10構(gòu)建正確，測(cè)序結(jié)果證實(shí)目的片段及閱讀框均正確，且目的基因SlO和pET-32a ( + )的His-Tag標(biāo)簽蛋白在同一開(kāi)放閱讀框下。
[0025]三、誘導(dǎo)表達(dá)和可溶性分析
誘導(dǎo)表達(dá):將鑒定正確的重組質(zhì)粒pET-32a-S10轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21 (DE3)，挑取LB/Amp平板篩選的陽(yáng)性克隆,于LB/Amp培養(yǎng)基中，37°C, 200rpm/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)至光密度(0D600=0.6)時(shí)，加入終濃度為lmmol/L的TPTG誘導(dǎo)，誘導(dǎo)IOh后取200 μ I菌液離心收集菌體和上清備用，同時(shí)設(shè)立空 載體pET-32a ( + )作為陰性對(duì)照。
[0026]可溶性分析:將pET-32a_S10誘導(dǎo)表達(dá)20ml，離心收集菌體，用PBS重懸離心洗滌2次后，加入5ml PBS重懸菌體，在冰上超聲波破碎(工作5s，間歇10s，功率250w)約2h至溶液澄清，吸取200 μ L破碎液，6000rpm/min離心5min，將上清吸到另一 EP管記為溶液A，沉淀用200 μ I 6Μ的尿素溶解，記為溶液B，分別將Α、B溶液進(jìn)行SDS-PAGE，對(duì)該重組蛋白進(jìn)行可溶性分析，若目的蛋白主要在A溶液中，則該蛋白為可溶性蛋白；若目的蛋白主要在B溶液中，則目的蛋白以包涵體形式存在。
[0027]經(jīng)SDS-PAGE分析誘導(dǎo)表達(dá)的重組蛋白顯示，重組質(zhì)粒pET-32a_S10菌株在53ku處出現(xiàn)一條目的條帶(見(jiàn)圖3), pET-32a ( + )載體的的His-標(biāo)簽蛋白與目的蛋白一起融合表達(dá)。取超聲波破碎液離心后的上清溶液A和6M尿素溶解沉淀的溶液B，經(jīng)SDS-PAGE分析表明，融合標(biāo)簽蛋白的目的蛋白主要存在B溶液中，即目的蛋白主要以包涵體形式存在(見(jiàn)圖3)。
[0028]四、誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化
采用棋盤(pán)法優(yōu)化誘導(dǎo)條件，把pET-32a-S10轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21 (DE3)感受態(tài)中，LB/Amp平板篩選陽(yáng)性菌落,挑取單菌落于3ml LB/Amp培養(yǎng)基中，在37°C, 200rpm/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)12h，然后將菌液接種20 μ L到2mL LB/Amp培養(yǎng)基中，在37°C，200rpm/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)至光密度(0D600設(shè)0.2、0.4、0.6、0.8和1.0，已實(shí)際測(cè)定為準(zhǔn))時(shí)，加入TPTG誘導(dǎo)(IPTG終濃度設(shè)0.5、1.0、1.5,2.0,3.0 mmol/L)，培養(yǎng)IOh后取200 μ I菌液離心，收集菌體，經(jīng)SDS-PAGE分析后用BandScan 5.0軟件分析重組蛋白的相對(duì)表達(dá)量。[0029]最后得出當(dāng)誘導(dǎo)表達(dá)條件是:0D600為0.8左右，IPTG終濃度為1.5mmol/L時(shí)，其表達(dá)條件最佳，目的蛋白的含量可達(dá)60%以上。
[0030]五、目的蛋白的大量表達(dá)和純化
挑取LB/Amp平板篩選得陽(yáng)性單菌落到ImL LB/Amp培養(yǎng)基培養(yǎng)l(Tl2h，然后將其接種到IL LB/Amp培養(yǎng)基，37°C，200rpm/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)，在優(yōu)化的表達(dá)條件下誘導(dǎo)表達(dá)。將誘導(dǎo)表達(dá)的菌液在10000rpm/min離心5min,收集菌體,用400ml PBS重懸離心洗漆2次，再加入100 ml PBS重懸，在冰上超聲波破碎至溶液澄清。將破碎液離心收集包涵體(該蛋白可溶性檢驗(yàn)為包涵體蛋白)，然后參照N1-凝膠純化試劑盒(包涵體蛋白純化)說(shuō)明書(shū)純化目的蛋白。用50ml Binding Buffer溶解包涵體過(guò)夜,將溶解液10000rpm/min離心20min收集上清,再0.45 μ m的濾膜過(guò)濾，將上清負(fù)載上已平衡好的Ni柱流速10倍柱體積/小時(shí)，收集流穿液；用15倍柱體積的Binding Buffer洗去未結(jié)合蛋白和雜蛋白，然后用20mlElution Buffer洗脫目的蛋白，收集洗脫峰(整個(gè)純化過(guò)程在4?冰箱中進(jìn)行)。將Ni柱上洗脫下的蛋白裝入透析袋，依次放入含6M，4M，2M，1M，0.5M，OM尿素的PBS溶液中透析，每個(gè)濃度透析12h(全部過(guò)程在4°C冰箱中進(jìn)行)。透析完成后加入PEG-6000，4°C冰箱靜置濃縮，濃縮50%后分裝成ImL/管，用紫外吸光光度法測(cè)濃度后一 20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0031]六、多克隆抗體的制備
將純化的目的蛋白用無(wú)菌PBS稀釋至200 μ g/ml后注射昆明小白鼠。第一次免疫用弗氏完全佐劑1:1 乳化，注射量為200 μ L/只，共免疫10只。第二次免疫和第三次免疫用弗氏不完全佐劑1:1乳化，注射同樣的量。每次免疫時(shí)間間隔14d。第三次免疫IOd后天斷尾取血，制備血清，用ELISA檢測(cè)血清抗體的效價(jià)。如抗體效價(jià)不夠，可以加強(qiáng)免疫一次，如足夠高，則第14d摘眼球取血。采取的血樣37°C靜置Ih后4°C冰箱靜置過(guò)夜，第二天3000rpm/min離心8min，收集血清，一 20°C保存?zhèn)溆谩?duì)照組注射無(wú)菌PBS制備陰性血清。
[0032]七、血清抗體效價(jià)測(cè)定
根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室建立的草魚(yú)呼腸孤病毒間接ELISA檢測(cè)方法來(lái)測(cè)定血清抗體效價(jià)，即用純化的SlO編碼蛋白作為抗原包被聚苯乙烯反應(yīng)板來(lái)建立的間接ELISA方法。其簡(jiǎn)要過(guò)程如下:將純化的重組蛋白用pH9.6的碳酸鹽緩沖液按1:8000倍稀釋(70ng/ml)包被IOOyL于96孔酶標(biāo)板，4°C過(guò)夜；用200 μ L 1%BSA于37°C封閉2h ;將制備的血清按1:10、1:102、1:103、1:104、1:105、1:106、1:107、1:108、1:109、1:1010 等梯度稀釋加入 100 μ L,37°C孵育2h，以相應(yīng)稀釋倍數(shù)的陰性血清做對(duì)照；加入1:5000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgGlOOyL, 37°C孵育Ih ;以上每步反應(yīng)后都用200 μ L PBST洗板3—5次，每次5min ;最后用TMB顯色試劑盒顯色20min，加入0.5M的H2S04終止顯色，在酶標(biāo)儀(Infinite M200PRO)上讀0D450值。當(dāng)0D450≥0.277，且P/N≥2.1判定為陽(yáng)性。
[0033]用間接ELISA法對(duì)SlO基因編碼重組蛋白鼠抗血清進(jìn)行效價(jià)測(cè)定，結(jié)果表明該抗體效價(jià)約為1:106。
[0034]八、多克隆抗體特性分析
Western blot分析:將純化的GCRV HZ08病毒、IPTG誘導(dǎo)的pET_32a (+)空載體和純化的SlO基因編碼重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后用半干轉(zhuǎn)膜法將蛋白轉(zhuǎn)移到NC膜上，用含5%脫脂牛奶的TBST緩沖液4°C封閉過(guò)夜；加入1:1000稀釋的血清，37°C孵育2h ；加入1:5000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG，37°C孵育Ih ;每次反應(yīng)后用TBST洗3~5次，每次5min,最后用DAB顯色劑顯色并觀察結(jié)果。
[0035]制備的多克隆抗體經(jīng)western blot分析，加入純化的GCRV HZ08毒株的孔道中，在約38ku處出現(xiàn)一條特異性條帶，與病毒SlO基因自身編碼的蛋白大小一致；在加入純化的重組蛋白的孔道中，在約53ku處出現(xiàn)一條特異條帶，與預(yù)期大小一直；而加入空載體菌體的孔道中沒(méi)有任何條帶。
[0036]間接免疫突光試驗(yàn)(Indirectimmunofluorescent assay, IFA):將 CIK 細(xì)胞傳代至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待細(xì)胞長(zhǎng)至單層鋪滿(mǎn)80%左右后，感染HZ08病毒；感染病毒5d后，將細(xì)胞培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基吸盡，用0.01mol/L的PBS洗滌3次，加入80%的丙酮溶液室溫孵育30min，吸去丙酮，室溫干燥Ih ;每孔加100 μ I 1: 1000稀釋的鼠抗SlO蛋白多克隆抗體，37°C孵育lh，PBST洗滌3次，加入1:50稀釋的羊抗鼠IgG-FITC標(biāo)記的熒光二抗100μ 1，37°C孵育Ih ；PBST洗滌3次，最后加入細(xì)胞核染料碘化丙啶(PI)作用5min，熒光倒置顯微鏡(Nikon，Eclipse T1-S)下觀察結(jié)果。陰性對(duì)照為未感染病毒的正常CIK細(xì)胞。
[0037]間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，制備的多克隆抗體能使感染HZ08毒株的CIK細(xì)胞能產(chǎn)生特異性的熒光(見(jiàn)圖6中A)，而在未感染病毒的正常CIK細(xì)胞中觀察不到熒光信號(hào)。
[0038]九、動(dòng)物免疫保護(hù)試驗(yàn)
以當(dāng)年8 — 10 cm左右大小(大約20g-25 g)的草魚(yú)作為免疫對(duì)象,在試驗(yàn)池中暫養(yǎng)2周后進(jìn)行免疫試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)前采取10尾草魚(yú)的血清，作為陰性對(duì)照。純化的重組蛋白用無(wú)菌PBS稀釋?zhuān)囼?yàn)分為3各組，每組30尾魚(yú)，第一組沒(méi)尾注射10 μ g重組蛋白；第二組注射20 μ g重組蛋白，第三組注射PBS作為空白對(duì)照。第一次免疫用弗氏完全佐劑1:1乳化，每尾腹腔注射200yL。免疫2周后，加強(qiáng)免疫用弗氏不完全佐劑1:1乳化，注射同樣的量。分別從第一次2周和加強(qiáng)免疫2周后的每組魚(yú)中采取4尾魚(yú)的血清，用ELISA檢測(cè)血清抗體的滴度。ELISA檢測(cè)的操 作步驟為:大體步驟實(shí)施例第七步所述方法進(jìn)行，只是這里的血清換成200倍稀釋的草魚(yú)血清作為一抗，每孔加入100 μ L，酶標(biāo)二抗換成HRP標(biāo)記的鼠抗草魚(yú)IgM,最后用TMB顯色試劑盒顯色20min，加入0.5M的H2SO4終止顯色，在酶標(biāo)儀(InfiniteM200 PRO)上讀 OD45tl 值(見(jiàn)表 I)。
[0039]表1免疫草魚(yú)血清特異性抗體滴度
蓽量血清腿驢_郵
試驗(yàn)組
—兔2屑后二免2周后
空白破_Cl 0S6 0*07S 0.1220.134 0.13 0.096 0.106 0.113
IOug0.223 0,218 0.1980.236 0.43 0.€21 0,398 CL 368
20ug fegffl 0.263 0,321 0.2920.346 0.76 0,542 0,435 0,587
以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，用SlO重組蛋白免疫草魚(yú)，可使草魚(yú)誘導(dǎo)產(chǎn)生較高的特異性抗體，并能對(duì)草魚(yú)呼腸孤病毒強(qiáng)毒株的攻擊起到一定的免疫保護(hù)作用。
[0040]以上實(shí)施例僅為介紹本發(fā)明的優(yōu)選案例，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不背離本發(fā)明精神的范圍內(nèi)所進(jìn)行的任何顯而易見(jiàn)的變化和改進(jìn)，都應(yīng)被視為本發(fā)明的一部分。
【權(quán)利要求】
1.一種草魚(yú)呼腸孤病毒II型SlO基因編碼蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示。
2.一種編碼權(quán)利要求1所述蛋白的核酸，其堿基序列如SEQ ID NO:1所示。
3.權(quán)利要求1所述的SlO基因編碼蛋白作為魚(yú)呼腸孤病毒抗原蛋白的應(yīng)用。
4.一種多克隆抗體，其特征在于，是以氨基酸序列為SEQ ID NO:2所示的蛋白為抗原，免疫動(dòng)物制備所得。
5.權(quán)利要求1所述的SlO基因編碼蛋白和/或權(quán)利要求4所述的多克隆抗體在制備草魚(yú)出血病基因工程疫苗中的應(yīng)用。
6.權(quán)利要求1所述的SlO基因編碼蛋白在制備草魚(yú)呼腸孤病毒檢測(cè)試劑盒上的應(yīng)用。
7.一種基因工程疫苗，其特征在于，含有權(quán)利要求1所述的SlO基因編碼蛋白或含有權(quán)利要求4所述的多克隆抗體。
8.—種檢測(cè)草魚(yú)呼腸孤病毒的試劑盒，其特征在于，含有權(quán)利要求1所述的SlO基因編碼蛋白。
【文檔編號(hào)】G01N33/68GK103539842SQ201310513653
【公開(kāi)日】2014年1月29日 申請(qǐng)日期:2013年10月25日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月25日
【發(fā)明者】曾偉偉, 王慶, 吳淑勤, 王英英, 梁紅茹, 石存斌, 李瑩瑩, 劉春
申請(qǐng)人:中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所