一種菜豆植物凝集素凝血活性定量檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種菜豆植物凝集素凝血活性定量檢測方法，屬于植物成分檢測【技術(shù)領(lǐng)域】。該方法對(duì)檢測用紅細(xì)胞懸液進(jìn)行了細(xì)胞定量，同時(shí)利用已知濃度的菜豆植物凝集素作為標(biāo)準(zhǔn)品繪制凝血活性濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)而計(jì)算出菜豆植物凝集素凝血活性濃度，從而對(duì)菜豆植物凝集素凝血活性進(jìn)行定量。
【專利說明】一種菜豆植物凝集素凝血活性定量檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于植物成分檢測【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種菜豆植物凝集素凝血活性定量檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002]菜豆中含有的植物凝集素是引起菜豆食物中毒的有毒物質(zhì)之一，尤其是鮮菜豆豆莢，常常因烹飪不當(dāng)造成中毒事件的發(fā)生。菜豆中毒是多因素的，其中最重要的因素是由于菜豆中的凝集素可與紅細(xì)胞表面特異糖基識(shí)別并專一性結(jié)合在紅細(xì)胞表面形成許多交叉的“橋”，使紅細(xì)胞發(fā)生凝集，進(jìn)而引起機(jī)體的整體反應(yīng)。不同菜豆品種中植物凝集素的含量不盡相同，因此可用紅細(xì)胞凝集法來檢測菜豆中植物凝集素活性，對(duì)指導(dǎo)人們選擇植物凝集素活性較低的菜豆品種種植和使用提供依據(jù)。
[0003]紅細(xì)胞凝集法是目前應(yīng)用最為廣泛的植物凝集素檢測方法。該方法利用天然的、酶處理的、戊二醛固定的兔、羊、人等動(dòng)物紅細(xì)胞，配制成一定濃度的紅細(xì)胞懸液，將凝集素溶液經(jīng)過倍比稀釋后加入等體積紅細(xì)胞懸液，在一定條件下靜置一段時(shí)間后利用肉眼觀察和比色法進(jìn)行活性判定。
[0004]現(xiàn)有的測定凝集素活性的方法主要分為兩大類:一類以觀察血細(xì)胞凝集效果的定性分析，如V形酶標(biāo)板法，平板法，試管法等等；另一類是以分光光度計(jì)及酶標(biāo)儀測定的特定波長下的吸光度的半定量分析方法。這些方法存在以下缺點(diǎn):(1)只能進(jìn)行定性或半定量測定；(2)配制標(biāo)準(zhǔn)紅細(xì)胞懸液方法不一，多用體積百分?jǐn)?shù)來表示，重現(xiàn)性差；(3)確定讀取終點(diǎn)時(shí)間的隨意性較大，有的有肉眼觀察結(jié)果，主觀性大，結(jié)果誤差也大，精確度低；(4)測定方法多種多樣，測得的結(jié)果千差萬別，無法進(jìn)行比較。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是為解決上述問題而提供了一種高通量定量檢測菜豆植物凝集素凝血活性的方法。
[0006]本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是:
[0007]—種菜豆植物凝集素凝血活性定量檢測方法，所述方法包括以下步驟:
[0008]( I)對(duì)檢測用紅細(xì)胞懸液進(jìn)行細(xì)胞定量；
[0009](2)用已知濃度的菜豆植物凝膠素作為標(biāo)準(zhǔn)品繪制凝血活性濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0010](3)計(jì)算出菜豆植物凝集素凝血活性濃度。
[0011]進(jìn)一步地，所述步驟(I)具體為:
[0012](A)采集新鮮兔血置于5%?10%枸櫞酸鈉抗凝劑中，與4倍體積阿氏(Alsever’ s)液混勻后置于4°C冰箱保存?zhèn)溆茫?br> [0013](B)將步驟(A)得到的新鮮兔血與生理鹽水按5:8的比例緩慢混勻，800?IOOOrpm離心10分鐘，收集沉淀；
[0014](C)重復(fù)上述步驟洗滌紅細(xì)胞，至上清液顏色近乎透明后，按紅細(xì)胞體積配成20%的紅細(xì)胞懸液。
[0015](D)取步驟(C)得到的紅細(xì)胞懸液經(jīng)生理鹽水稀釋后計(jì)數(shù)紅細(xì)胞，并調(diào)整紅細(xì)胞濃度為5 X IO7個(gè)/ml-5 X IO8個(gè)/ml，4°C冰箱保存?zhèn)溆谩?br> [0016]優(yōu)選地，所述步驟(A)中得到的新鮮兔血保存?zhèn)溆貌坏贸^14天。
[0017]進(jìn)一步地,所述步驟(2)具體為:
[0018](a)在酶標(biāo)板上，將已知濃度的菜豆植物凝集素標(biāo)準(zhǔn)品二倍稀釋六個(gè)稀釋度；
[0019](b)向上述酶標(biāo)板各孔加入已定量的紅細(xì)胞懸液，混合均勻，并靜置10分鐘，在酶標(biāo)儀450nm處讀取吸光值，繪制菜豆植物凝集素凝血活性濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0020]更進(jìn)一步地，所述步驟(a)中，菜豆植物凝集素標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為lmg/ml，二倍稀釋六個(gè)稀釋度為 lmg/ml、0.5mg/ml、0.25mg/ml、0.125mg/ml、0.0625mg/ml 和 0.03125mg/ml。
[0021]進(jìn)一步地,所述步驟(3)具體為:
[0022]( I )將新鮮菜豆植物洗凈擦干后稱重，置于研缽中，加入質(zhì)量體積比為1:1的生理鹽水，于冰上研碎；
[0023](II)將步驟(I )得到的菜豆植物在4°C下，8000rpm，離心lOmin，取上清液；
[0024](III)將步驟(II)得到的上清液靜置5分鐘后，再次取上清液，得到菜豆植物凝集素浸提液；
[0025](IV)在酶標(biāo)板上，將步驟(III)得到的菜豆植物凝集素浸提液二倍稀釋三個(gè)稀釋度；
[0026](V)向上述酶標(biāo)板各孔加入步驟(I)得到的紅細(xì)胞懸液，混合均勻，并靜置10分鐘，在酶標(biāo)儀450nm處讀取吸光值，將該值代入步驟(2)得到的菜豆植物凝集素凝血活性濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線的公式中，計(jì)算得到菜豆植物凝集素凝血活性濃度。
[0027]優(yōu)選地，所述菜豆植物為菜豆豆莢或豆粒。
[0028]優(yōu)選地，所述酶標(biāo)板為96孔。
[0029]本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn):
[0030]該檢測方法步驟簡單，利用該方法可以對(duì)菜豆植物進(jìn)行高通量定量的凝集素凝血活性檢測；制備出的紅細(xì)胞懸液進(jìn)行了細(xì)胞定量，可保證各批次間測定結(jié)果的相對(duì)一致；同時(shí)檢測出的結(jié)果更加精確，誤差度小，測定出的結(jié)果可以進(jìn)行互相比較。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0031]圖1為實(shí)施例中菜豆植物凝集素標(biāo)準(zhǔn)品測定曲線圖。
【具體實(shí)施方式】
[0032]下面結(jié)合附圖和實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)的說明。
[0033]( I)制備標(biāo)準(zhǔn)紅細(xì)胞懸液及測定標(biāo)準(zhǔn)曲線:
[0034]1.用心臟采血法采集新鮮兔血2ml，置于300ul的8%枸櫞酸鈉抗凝劑中，再與8mlAlsever’s液混勻后置于4°C冰箱保存?zhèn)溆?2周內(nèi)紅細(xì)胞正常，超過2周，紅細(xì)胞出現(xiàn)溶血現(xiàn)象)。
[0035]2.取用Alsever’s液保存的新鮮兔血2.5ml，與生理鹽水按5:8的比例緩慢混勻，800-1000rpm離心10分鐘，收集紅細(xì)胞沉淀。[0036]3.重復(fù)上述步驟洗滌紅細(xì)胞五次后，上清液顏色完全透明，再根據(jù)紅細(xì)胞沉淀的體積配成20%的紅細(xì)胞懸液。
[0037]4.取IOOul上述紅細(xì)胞懸液用生理鹽水稀釋10倍后，取稀釋后的紅細(xì)胞懸液IOOul，再稀釋10倍，然后取15ul經(jīng)兩次稀釋后的紅細(xì)胞懸液計(jì)數(shù)紅細(xì)胞數(shù)量，調(diào)整紅細(xì)胞濃度為 5 X IO7 個(gè) /ml-5 X IO8 個(gè) /ml。
[0038]5.在96孔酶標(biāo)板上加入IOOul的lmg/ml菜豆植物凝集素標(biāo)準(zhǔn)品，并做二倍稀釋6個(gè)稀釋度，滴加不同濃度(5 X IO7個(gè)/ml、I X IO8個(gè)/ml、2 X IO8個(gè)/ml、4X IO8個(gè)/mDlOul紅細(xì)胞懸液，觀察凝血情況，并測定450nm處的吸光值。
[0039]參照?qǐng)D1，結(jié)果顯示紅細(xì)胞濃度為2 X IO8個(gè)/ml時(shí)，凝血反應(yīng)速度適中，根據(jù)450nm處的吸光值做出的標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性相關(guān)系數(shù)大于0.99。
[0040](2)菜豆植物凝集素浸提液的制備
[0041]1.新鮮菜豆豆莢或豆粒洗凈擦干后稱重，置于研缽中，加入質(zhì)量體積比為1:1的生理鹽水，于冰上研碎。
[0042]2.在 4°C下,8000r/min 離心 IOmin,取上清液。
[0043]3.靜置5分鐘后，再次取上清液，即為菜豆植物凝集素浸提液。
[0044](3)菜豆植物凝集素活性濃度測定
[0045]1.在96孔酶標(biāo)板上，加入58種不同品種的菜豆豆莢浸提液各
[0046]IOOul。
[0047]2.向各孔中加入2 X IO8個(gè)/ml的紅細(xì)胞懸液IOul，混合均勻，靜置10分鐘，在酶標(biāo)儀450nm處讀取吸光值，將該值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線的公式進(jìn)行菜豆植物凝集素凝血活性濃度的計(jì)算，公式如圖1所示。
[0048]對(duì)于凝集素含量較高，超出標(biāo)準(zhǔn)曲線測定范圍的15種菜豆豆莢浸提液，用生理鹽水進(jìn)行二倍稀釋3個(gè)濃度梯度，每孔lOOul，再向各孔中加入2X IO8個(gè)/ml的紅細(xì)胞懸液10ul，混合均勻，靜置10分鐘，在酶標(biāo)儀450nm處讀取吸光值，取吸光值位于標(biāo)準(zhǔn)曲線內(nèi)的數(shù)值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線的公式進(jìn)行菜豆植物凝集素凝血活性濃度的計(jì)算。
[0049]最后所應(yīng)說明的是，以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍當(dāng)中。
【權(quán)利要求】
1.一種菜豆植物凝集素凝血活性定量檢測方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟: (1)對(duì)檢測用紅細(xì)胞懸液進(jìn)行細(xì)胞定量； (2)用已知濃度的菜豆植物凝膠素作為標(biāo)準(zhǔn)品繪制凝血活性濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線； (3)計(jì)算出菜豆植物凝集素凝血活性濃度。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的菜豆植物凝集素凝血活性定量檢測方法，其特征在于，所述步驟(1)具體為: (A)采集新鮮兔血置于5%~10%枸櫞酸鈉抗凝劑中，與4倍體積阿氏液混勻后置于4°C冰箱保存?zhèn)溆茫? (B)將步驟(A)得到的新鮮兔血與生理鹽水按5:8的比例緩慢混勻，800~1000rpm離心10分鐘，收集沉淀； (C)重復(fù)上述步驟洗滌紅細(xì)胞，至上清液顏色近乎透明后，按紅細(xì)胞體積配成20%的紅細(xì)胞懸液。 (D)取步驟(C)得到的紅細(xì)胞懸液經(jīng)生理鹽水稀釋后計(jì)數(shù)紅細(xì)胞，并調(diào)整紅細(xì)胞濃度為5 X IO7個(gè)/ml-5 X IO8個(gè)/ml，4°C冰箱保存?zhèn)溆谩?br> 3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的菜豆植物凝集素凝血活性定量檢測方法，其特征在于，所述步驟(A)中得到的新鮮兔血保存?zhèn)溆貌坏贸^14天。`
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的菜豆植物凝集素凝血活性定量檢測方法，其特征在于，所述步驟(2)具體為: Ca)在酶標(biāo)板上，將已知濃度的菜豆植物凝集素標(biāo)準(zhǔn)品二倍稀釋六個(gè)稀釋度； (b)向上述酶標(biāo)板各孔加入已定量的紅細(xì)胞懸液，混合均勻，并靜置10分鐘，在酶標(biāo)儀450nm處讀取吸光值，繪制菜豆植物凝集素凝血活性濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的菜豆植物凝集素凝血活性定量檢測方法，其特征在于，所述步驟(a)中，菜豆植物凝集素標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為lmg/ml，二倍稀釋六個(gè)稀釋度為lmg/ml、0.5mg/ml、0.25mg/ml、0.125mg/ml、0.0625mg/ml 和 0.03125mg/ml。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的菜豆植物凝集素凝血活性定量檢測方法，其特征在于，所述步驟(3)具體為: (I)將新鮮菜豆植物洗凈擦干后稱重，置于研缽中，加入質(zhì)量體積比為1:1的生理鹽水，于冰上研碎； (II)將步驟(I)得到的菜豆植物在4°C下，8000rpm，離心lOmin，取上清液； (III)將步驟(II)得到的上清液靜置5分鐘后，再次取上清液，得到菜豆植物凝集素浸提液； (IV)在酶標(biāo)板上，將步驟(III)得到的菜豆植物凝集素浸提液二倍稀釋三個(gè)稀釋度； (V)向上述酶標(biāo)板各孔加入步驟(1)得到的紅細(xì)胞懸液，混合均勻，并靜置10分鐘，在酶標(biāo)儀450nm處讀取吸光值，將該值代入步驟(2)得到的菜豆植物凝集素凝血活性濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線的公式中，計(jì)算得到菜豆植物凝集素凝血活性濃度。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的菜豆植物凝集素凝血活性定量檢測方法，其特征在于，所述菜豆植物為菜豆豆莢或豆粒。
8.根據(jù)權(quán)利要求4或6所述的菜豆植物凝集素凝血活性定量檢測方法，其特征在于，所述酶標(biāo)板為 96孔。
【文檔編號(hào)】G01N21/33GK103558176SQ201310532286
【公開日】2014年2月5日 申請(qǐng)日期:2013年10月31日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月31日
【發(fā)明者】李佳楠, 陳禪友, 潘磊 申請(qǐng)人:江漢大學(xué)