正心泰片指紋圖譜的建立方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及正心泰片指紋圖譜的建立方法和應(yīng)用。包括將正心泰片樣品用溶劑提取制備樣品的供試液，在一定的色譜條件下測(cè)試供試液液相色譜指紋圖譜，并通過丹參酮ⅡA，葛根素兩個(gè)指標(biāo)性成分的含量作為質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)來控制正心泰片的質(zhì)量，從而達(dá)到控制正心泰片藥品質(zhì)量的目的。實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明的指紋圖譜多成分控制藥品質(zhì)量在藥品生產(chǎn)中能起到很好的質(zhì)量控制作用，是一種評(píng)價(jià)中藥復(fù)方制劑生產(chǎn)質(zhì)量的關(guān)鍵技術(shù)。
【專利說明】正心泰片指紋圖譜的建立方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于藥物分析檢測(cè)領(lǐng)域，涉及一種正心泰片指紋圖譜的建立方法和應(yīng)用。【背景技術(shù)】
[0002]隨著現(xiàn)代藥物分析技術(shù)的發(fā)展，指紋圖譜技術(shù)是當(dāng)今國際公認(rèn)的控制中藥質(zhì)量的質(zhì)控模式，它在原藥材的栽培、引種，中成藥生產(chǎn)工藝的規(guī)范與優(yōu)化，產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定等方面都提供全方位的質(zhì)量保證。
[0003]近年來，國外對(duì)中草藥產(chǎn)品的質(zhì)量評(píng)價(jià)也在提倡指紋圖譜。隨著各種分析技術(shù)的創(chuàng)新和提高以及計(jì)算機(jī)應(yīng)用技術(shù)的不斷發(fā)展，世界各國對(duì)天然藥物的了解和研究在不斷深入，中藥指紋圖譜技術(shù)在國內(nèi)已成為一種發(fā)展趨勢(shì)，其研究的方法和技術(shù)更趨成熟完善，成為公認(rèn)的控制中藥和天然藥質(zhì)量最有效的方法和手段。日本漢方藥在20世紀(jì)80年代就采用高效液相指紋圖譜控制質(zhì)量。歐共體也將指紋圖譜監(jiān)控技術(shù)應(yīng)用于植物藥質(zhì)量控制，美國食品藥品管理局(FDA)允許草藥保健品申報(bào)資料時(shí)提供色譜指紋圖，要求植物藥在質(zhì)量控制方面，必須制定指紋圖譜的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。世界衛(wèi)生組織在1996年草藥評(píng)價(jià)指導(dǎo)原則中規(guī)定:如果草藥的活性成分不明，可以提供色譜指紋圖以證明產(chǎn)品質(zhì)量的一致性。英國、印度、加拿大等國家在植物藥的研究中，也對(duì)指紋圖譜十分重視。在許多國家的藥典中，色譜指紋圖譜已成為主要的分離分析方法。目前，國外許多研究機(jī)構(gòu)對(duì)中藥指紋圖譜的研究主要為建立指紋圖譜與藥效的相關(guān)性研究，是以中藥理論和新藥研發(fā)研究體系為主的模式。
[0004]心腦血管疾病是嚴(yán)重危害人類的常見疾病。近年來，由于社會(huì)的發(fā)展，工作、生活、飲食結(jié)構(gòu)及環(huán)境等的變化，心腦血管疾病呈上升趨勢(shì)。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，單味植物中藥含有許多種化學(xué)成分，由數(shù)味藥組成的中藥復(fù)方，其化學(xué)成分就更加復(fù)雜，中藥化學(xué)成分的復(fù)雜性，決定了它們有多靶點(diǎn)作用。由于復(fù)方的質(zhì)量控制方法不夠全面，難以全面的控制復(fù)方質(zhì)量及藥物療效。因此，本研究針對(duì)正心泰片的質(zhì)量控制方法進(jìn)行改進(jìn)，為進(jìn)一步更好的治療心腦血管疾病提供保障。
[0005]正心泰片是由黃芪、葛根、槲寄生、丹參、山楂、川芎制成的片劑制劑，臨床上用于治療冠心病、心絞痛各類疾病等，功能是補(bǔ)氣活血，通脈益腎，其效果已經(jīng)得到臨床的驗(yàn)證，而是否能夠保證藥物的質(zhì)量以及正心泰片中有效成分的含量，是決定正心泰片療效的基礎(chǔ)。如果單純用丹參的活性成分來說明正心泰片的內(nèi)在質(zhì)量，具有一定的片面性。要控制正心泰片的功效，必須對(duì)它的物質(zhì)群整體予以控制?，F(xiàn)在，對(duì)丹參中活性成分丹參酮、丹酚酸的測(cè)定方法較多，對(duì)葛根中活性成分葛根素測(cè)定方法較多，但如何能夠用一種方法同時(shí)控制復(fù)方中多種藥材的有效成分含量，從更宏觀的角度對(duì)正心泰片片劑制劑進(jìn)行質(zhì)量控制的宏觀質(zhì)量控制方法尚未見報(bào)道。因而獲得一種有效控制正心泰片質(zhì)量的方法一直是業(yè)內(nèi)追求的目標(biāo)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供正心泰片指紋圖譜的建立方法和應(yīng)用，通過此測(cè)定方法，可控制正心泰片質(zhì)量。
[0007]本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的，一種正心泰片指紋圖譜的建立方法，其特征在于，采用液相色譜法檢測(cè)正心泰片中丹參酮II A、葛根素的含量；所述液相色譜的條件如下:
[0008]色譜柱:以十八烷基硅烷鍵合硅膠TC-C18為填充相；
[0009]流動(dòng)相:體積比9:91-59:41的乙腈和水溶液，進(jìn)行梯度洗脫；
[0010]流速:0.5-1.5mT,/min ；
[0011]柱溫:25-40°C ;
[0012]紫外檢測(cè)波長:271nm ;
[0013]理論塔板數(shù)按葛根素計(jì)算，應(yīng)不低于4000-6000。
[0014]上述正心泰片指紋圖譜的建立方法，具體包括如下步驟:
[0015]S1、制備對(duì)照品溶液:取丹參酮II A、葛根素，加甲醇制成每ImL含0.16mg丹參酮
IIA、0.084mg葛根素的溶液；
[0016]S2、制備供試品溶液:取正心泰片，除去包衣，研細(xì)；以一克粉末，加20ml含30%甲醇的乙酸乙酯溶液；超聲處理后，補(bǔ)足溶劑重量；0.45um微孔濾膜過濾，獲得所述供試品溶液；
[0017]S3、測(cè)定:吸取所述對(duì)照品與所述供試品溶液各5yL，注入液相色譜儀，進(jìn)行測(cè)定，得到指紋圖譜。
[0018]其中，步驟S3中液相色譜的條件如下:
[0019]色譜柱:Agilent250mmX4.6mm，5 u m ;
[0020]流速:lmL/min;
[0021]柱溫:25°C。
[0022]優(yōu)選方式下，步驟S2中超聲處理的參數(shù)為:功率250W，頻率25kHz，處理20分鐘。
[0023]此外，所述梯度洗脫程序按如下體積比設(shè)置進(jìn)行:
[0024]0分鐘時(shí)，流動(dòng)相為9%的乙腈和91%的水溶液；
[0025]10分鐘時(shí)，流動(dòng)相為10%的乙腈和90%的水溶液；
[0026]15分鐘時(shí)，流動(dòng)相為11%的乙腈和89%的水溶液；
[0027]40分鐘時(shí)，流動(dòng)相為11%的乙腈和89%的水溶液；
[0028]42分鐘時(shí)，流動(dòng)相為17%的乙腈和83%的水溶液；
[0029]105分鐘時(shí)，流動(dòng)相為59%的乙腈和41%的水溶液。
[0030]所述建立的指紋圖譜中包括20個(gè)特征峰，其中峰2為葛根素，峰20為丹參酮II A0
[0031]本發(fā)明還提供了一種上述權(quán)利要求所述正心泰片指紋圖譜建立方法的應(yīng)用，建立的指紋圖譜用于檢測(cè)正心泰片的質(zhì)量。
[0032]本發(fā)明以正心泰片中有效成分丹參中丹參酮II A，葛根中葛根素為主建立起來的HPLC指紋圖譜，代表著正心泰片大部分藥理活性，能有效地表征正心泰片的質(zhì)量。從而實(shí)現(xiàn)對(duì)正心泰片最大可能的化學(xué)成分進(jìn)行檢測(cè)，有利于對(duì)中藥質(zhì)量的全方面監(jiān)控。
[0033]以正心泰片中丹參葛根各有效成分指紋圖形作為一個(gè)整體看待，避免了因只測(cè)定一個(gè)藥材而判定正心泰片整體質(zhì)量的片面性，又減少了為質(zhì)量達(dá)標(biāo)而認(rèn)為處理的可能性。本發(fā)明為完整、準(zhǔn)確評(píng)價(jià)正心泰片的質(zhì)量提供了新的對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)，將為提高正心泰片及其他以丹參、葛根為主要成分制劑的質(zhì)量及療效做出貢獻(xiàn)。
[0034]本發(fā)明具有方法簡(jiǎn)便、穩(wěn)定、精密度高、重現(xiàn)性好、易于掌握的特點(diǎn)。
[0035]本發(fā)明正心泰片的檢測(cè)方法，是通過大量實(shí)驗(yàn)所得到的切實(shí)可行的方法，具有重復(fù)性?？赏ㄟ^將上述方法測(cè)定方法建立的正心泰片指紋圖譜作為標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，其測(cè)定方法可作為含有丹參、葛根制劑有效成分測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，以鑒定其有效成分。
[0036]本發(fā)明結(jié)合液相色譜指紋圖譜發(fā)展潮流，找到了合適的正心泰片指紋圖譜檢測(cè)方法，包括將正心泰片樣品用溶劑提取制備樣品的供試液，在一定的色譜條件下測(cè)試供試液液相色譜指紋圖譜，并通過丹參酮II A，葛根素兩個(gè)指標(biāo)性成分的含量作為質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)來控制正心泰片的質(zhì)量，從而達(dá)到控制正心泰片藥品質(zhì)量的目的。實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明的指紋圖譜多成分控制藥品質(zhì)量在藥品生產(chǎn)中能起到很好的質(zhì)量控制作用，是一種評(píng)價(jià)中藥復(fù)方制劑生產(chǎn)質(zhì)量的關(guān)鍵技術(shù)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0037]圖1是正心泰片HPLC指紋圖譜。
[0038]圖2是混合對(duì)照品HPLC指紋圖譜。
【具體實(shí)施方式】
[0039]本發(fā)明正心泰片指紋圖譜的建立方法，其中高效液相色譜的條件如下:色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充相；流動(dòng)相為體積比為9:91-59:41的乙腈和水溶液進(jìn)行梯度洗脫；流速:0.5-1.5mL/min ;柱溫:25-40°C ;紫外檢測(cè)波長:271nm ;理論塔板數(shù)按葛根素計(jì)算，應(yīng)不低于4000。
[0040]優(yōu)選地，所述方法還包括通過以下方法制備對(duì)照品溶液:取丹參酮II A，葛根素對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每ImL含0.16mg的丹參酮II A，0.084mg的葛根素溶液，作為對(duì)照品溶液。
[0041]優(yōu)選地，所述方法還包括通過以下方法制備供試品溶液:取正心泰片，除去包衣，研細(xì)，約1.0g，精密稱定，加20ml含30%甲醇的乙酸乙酯溶液，稱重，超聲處理(功率250W，頻率25kHz) 20分鐘，補(bǔ)足重量，0.45 um微孔濾膜過濾，作為供試品溶液。
[0042]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的方法包括如下步驟:
[0043](I)對(duì)照品溶液的制備:取丹參酮II A，葛根素對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每ImL含0.16mg的丹參酮II A，0.084mg的葛根素溶液，作為對(duì)照品溶液；
[0044](2)供試品溶液的制備:取正心泰片，除去包衣，研細(xì)，約1.0g，精密稱定，加20ml含30%甲醇的乙酸乙酯溶液，稱重，超聲處理(功率250W，頻率25kHz) 20分鐘，補(bǔ)足重量，
0.45 um微孔濾膜過濾，作為供試品溶液；
[0045](3)測(cè)定:精密吸取對(duì)照品與供試品溶液各L，注入高效液相色譜儀，根據(jù)以下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，得到指紋圖譜:
[0046]色譜柱:AgilentTC-C18 (250mmX 4.6mm, 5 u m);
[0047]流動(dòng)相:體積比為9:91-59:41的乙腈和水溶液，進(jìn)行梯度洗脫；
[0048]流速:lmL/min;
[0049]柱溫:25°C;[0050]紫外檢測(cè)波長:271nm。
[0051]優(yōu)選地，所述梯度洗脫程序按如下體積比設(shè)置進(jìn)行；
[0052]0分鐘時(shí)，流動(dòng)相為9%的乙腈和91%的水溶液；
[0053]10分鐘時(shí)，流動(dòng)相為10%的乙腈和90%的水溶液；
[0054]15分鐘時(shí)，流動(dòng)相為11%的乙腈和89%的水溶液；
[0055]40分鐘時(shí)，流動(dòng)相為11%的乙腈和89%的水溶液；
[0056]42分鐘時(shí)，流動(dòng)相為17%的乙腈和83%的水溶液；
[0057]105分鐘時(shí)，流動(dòng)相為59%的乙腈和41%的水溶液；
[0058]優(yōu)選地，所述建立的指紋圖譜中包括20個(gè)特征峰，其中峰2為葛根素，峰20為丹參酮II A0
[0059]以下參照具體的實(shí)施例來說明本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，其不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
[0060]以下各實(shí)施例中所使用的對(duì)照品如下:丹參酮II A，購自中國藥品生物制品檢定所，批號(hào):110766-200417 ;葛根素，購自中國藥品生物制品檢定所，批號(hào):110752_200511。
[0061]以下各實(shí)施例中所使用的色譜儀為美國AgilentllOO系列。
[0062]實(shí)施例1供試品溶液的制備
[0063]本實(shí)施例從以下幾個(gè)方面對(duì)供試品溶液的制備方法進(jìn)行了考查。
[0064]1、提取溶劑
[0065]以乙酸乙酯，70%甲醇的乙酸乙酯溶液，50%甲醇的乙酸乙酯溶液，30%甲醇的乙酸乙酯溶液，甲醇為提取溶劑，采用超聲提取方法，對(duì)同一批供試品進(jìn)行了提取溶劑考察。
[0066]70%甲醇的乙酸乙酯溶液，50%甲醇的乙酸乙酯溶液對(duì)葛根素的提取率過低，甲醇對(duì)丹參酮II A提取率過低，因此選用對(duì)丹參酮II A、葛根素提取率相對(duì)較高的30%甲醇的乙酸乙酯溶液作為供試品提取溶劑。
[0067]2、供試品取樣量
[0068]分別精密稱取正心泰片包衣0.5g,0.75g, 1.0g, 1.25g,加20ml含30%甲醇的乙酸乙酯溶液，稱重，超聲處理(功率250W，頻率25kHz) 20分鐘，制備供試品。
[0069]結(jié)果表明，取樣量0.5g-0.75g，圖譜(未示出)中較多色譜峰響應(yīng)值相應(yīng)較低，而取樣量1.0gU.25g各色譜峰成分在圖譜中均能明顯顯示，考慮色譜柱的保護(hù)，選擇1.0g作為供試品取樣量。
[0070]3、提取時(shí)間考察
[0071]丹參酮II A不穩(wěn)定，因此考察提取時(shí)間時(shí)分別考察了超聲時(shí)間10、20、30分鐘的提取效果。
[0072]結(jié)果發(fā)現(xiàn)，超聲處理(功率250W，頻率25kHz) 20分鐘時(shí)丹參酮II A色譜峰相對(duì)響應(yīng)值較高，因此選擇超聲20分鐘的方法制備供試品。
[0073]實(shí)施例2色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)考察
[0074]本實(shí)施例從以下各方面對(duì)正心泰片指紋圖譜的色譜條件和與系統(tǒng)適用性進(jìn)行了
試驗(yàn)考察。
[0075]1、指紋圖譜檢測(cè)方法的選擇
[0076]文獻(xiàn)調(diào)研表明，正心泰片中所含主要成分均有較好的紫外吸收，因此選用HPLC-UV檢測(cè)方法進(jìn)行指紋圖譜研究。
[0077]2、指紋圖譜檢測(cè)波長的選擇
[0078]文獻(xiàn)研究表明，正心泰片六味藥中所含有效成分紫外吸收波長特征各不相同，采用二極管陣列檢測(cè)器對(duì)樣品進(jìn)行全波長檢測(cè)，并同時(shí)收集250nm (葛根素最大吸收)、271nm(丹參酮II A)。
[0079]結(jié)合考察，在271nm波長處葛根素和丹參酮II A的信息量最大且色譜峰容易觀察，因此最后確定271nm為正心泰片指紋圖譜的檢測(cè)波長。
[0080]4、色譜柱考察
[0081]分別考察了Agilent、Diamonsil 及 Kromasil 三種色譜柱。
[0082]結(jié)果表明，在同樣條件下，Agilent色譜柱對(duì)樣品各色譜峰的分離度最佳，大部分色譜峰能達(dá)到基本分離，因此選用Agilent TC-C18 (250mmX 4.6mm, 5 y m)色譜柱進(jìn)行正心泰片指紋圖譜的測(cè)定。
[0083]5、柱流速的考察
[0084]照HPLC色譜條件，分別考察了不同的柱流速(1.1mL/分鐘，1.0mL/分鐘，0.9mL/分鐘)。
[0085]結(jié)果表明，柱流速各成分分離效果的影響不明顯，僅個(gè)別色譜峰1.0mL/分鐘的流速分離效果較好(圖未示出)，因此選用柱流速為1.0mL/分鐘。
[0086]6、柱溫考察
[0087]照HPLC色譜條件，分別考察了 3種柱溫(25°C、30°C、35°C)。
[0088]結(jié)果表明，柱溫對(duì)各色譜峰成分分離效果的影響不明顯，故選用接近室溫的25°C作為柱溫條件。
[0089]7、指紋圖譜色譜條件2倍色譜峰采集時(shí)間考察
[0090]供試品溶液進(jìn)樣后，記錄210分鐘的色譜圖，考察是否出峰完全(圖未示出)。
[0091]結(jié)果表明，在此色譜條件下，105分鐘以后未檢測(cè)出色譜峰。
[0092]8、流動(dòng)相空白考察
[0093]在HPLC色譜條件下，不進(jìn)樣單運(yùn)行程序考察105分鐘的色譜圖，未檢測(cè)到任何色譜峰(圖未示出)，結(jié)果表明流動(dòng)相空白對(duì)指紋圖譜檢測(cè)無影響。
[0094]空白溶劑影響的考察
[0095]在HPC色譜條件下記錄空白溶劑(30%甲醇的乙酸乙酯溶液)105分鐘的色譜圖，未檢測(cè)到任何色譜峰(圖未示出)，結(jié)果表明空白溶劑對(duì)指紋圖譜檢測(cè)無影響。
[0096]以上所述，僅為本發(fā)明較佳的【具體實(shí)施方式】，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何熟悉本【技術(shù)領(lǐng)域】的技術(shù)人員在本發(fā)明披露的技術(shù)范圍內(nèi)，根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案及其發(fā)明構(gòu)思加以等同替換或改變，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種正心泰片指紋圖譜的建立方法，其特征在于，采用液相色譜法檢測(cè)正心泰片中丹參酮II A、葛根素的含量；所述液相色譜的條件如下: 色譜柱:以十八烷基硅烷鍵合硅膠TC-C18為填充相； 流動(dòng)相:體積比9:91-59:41的乙腈和水溶液，進(jìn)行梯度洗脫；
流速:0.5-1.5mT,/mi n ；
柱溫:25-40 0C ； 紫外檢測(cè)波長:271nm; 理論塔板數(shù)按葛根素計(jì)算，應(yīng)不低于4000-6000。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述正心泰片指紋圖譜的建立方法，其特征在于，包括如下步驟: 51、制備對(duì)照品溶液:取丹參酮IIA、葛根素，加甲醇制成每ImL含0.16mg丹參酮II A、0.084mg葛根素的溶液； 52、制備供試品溶液:取正心泰片，除去包衣，研細(xì)；以一克粉末，加20ml含30%甲醇的乙酸乙酯溶液；超聲處理后，補(bǔ)足溶劑重量；0.45um微孔濾膜過濾，獲得所述供試品溶液； 53、測(cè)定:吸取所述對(duì)照品與所述供試品溶液各5yL，注入液相色譜儀，進(jìn)行測(cè)定，得到指紋圖譜。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述正心泰片指紋圖譜的建立方法，其特征在于，步驟S3中液相色譜的條件如下`
色譜柱:Agilent250mmX 4.6mm, 5 u m ； 流速:lmL/min ； 柱溫:25°C。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述正心泰片指紋圖譜的建立方法，其特征在于，步驟S2中超聲處理的參數(shù)為:功率250W，頻率25kHz，處理20分鐘。
5.根據(jù)權(quán)利要求4中所述正心泰片指紋圖譜的建立方法，其特征在于，所述梯度洗脫程序按如下體積比設(shè)置進(jìn)行: 0分鐘時(shí)，流動(dòng)相為9%的乙腈和91%的水溶液； 10分鐘時(shí)，流動(dòng)相為10%的乙腈和90%的水溶液； 15分鐘時(shí)，流動(dòng)相為11%的乙腈和89%的水溶液； 40分鐘時(shí)，流動(dòng)相為11%的乙腈和89%的水溶液； 42分鐘時(shí)，流動(dòng)相為17%的乙腈和83%的水溶液； 105分鐘時(shí)，流動(dòng)相為59%的乙腈和41%的水溶液。
6.根據(jù)權(quán)利要求5中所述正心泰片指紋圖譜的建立方法，其特征在于，所述建立的指紋圖譜中包括20個(gè)特征峰，其中峰2為葛根素，峰20為丹參酮II A。
7.—種上述權(quán)利要求所述正心泰片指紋圖譜建立方法的應(yīng)用，其特征在于，建立的指紋圖譜用于檢測(cè)正心泰片的質(zhì)量。
【文檔編號(hào)】G01N30/02GK103675117SQ201310545749
【公開日】2014年3月26日 申請(qǐng)日期:2013年11月6日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月6日
【發(fā)明者】李彥冰, 康曉宇 申請(qǐng)人:大連天宇制藥有限公司