一種犬細小病毒化學發(fā)光檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】一種犬細小病毒化學發(fā)光檢測試劑盒，涉及檢測犬細小病毒的試劑盒，包括盒體，盒體內設有包被有濃度為10ug/mL的犬細小病毒包被抗體的聚苯乙烯96孔微孔板、犬細小病毒抗原質控對照品、辣根過氧化酶標記的羊抗鼠抗體溶液、犬細小病毒標準溶液、樣品稀釋液、濃縮洗滌液和化學發(fā)光液。本發(fā)明試劑盒靈敏度高可達3ng/mL，并且具有高特異性、寬檢測范圍、操作方法簡單、反應結果易于觀察等特點，不僅提高了檢測效率，而且保證了檢測的精確度，可用于出口檢驗、食品安全檢驗及動物養(yǎng)殖業(yè)現(xiàn)場快速檢測。
【專利說明】一種犬細小病毒化學發(fā)光檢測試劑盒
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及免疫學檢測領域，具體的說涉及一種犬細小病毒化學發(fā)光檢測試劑盒。
【背景技術】
[0002]犬細小病毒(CPV)是美國Eugster于1978年從患處血性腸炎的犬糞便中發(fā)現(xiàn)的病毒，該病毒為細小病毒科細小病毒屬，單股線狀DNA病毒。犬細小病毒以導致犬發(fā)病率高，傳染性強、死亡率高等特點已成為犬科動物臨床發(fā)病的重要致病病毒。犬細小病毒已成為我國養(yǎng)犬業(yè)最為嚴重的傳染病之一，該病既影響著家養(yǎng)寵物的生命健康，又危害著我國養(yǎng)犬業(yè)、毛皮動物養(yǎng)殖業(yè)及野生動物保護業(yè)的發(fā)展。
[0003]目前，犬細小病毒的傳統(tǒng)檢測方法有血清學檢測方法和病原學檢測方法。血清學檢測方法主要為血凝試驗、酶聯(lián)免疫吸附試驗和免疫膠體金檢測方法，但靈敏度不高、特異性不強。病原學檢測方法目前常用F81、MDCK等傳代細胞系分離培養(yǎng)病毒，病毒分離方法雖然在理論上可以檢出一個感染性的病毒粒子，確診犬細小病毒的感染，但也因分離病毒的操作繁瑣、代價高及確診緩慢等因素沒有投入臨床和滿足基層使用。隨著分子生物學的發(fā)展，目前已有多種PCR方法用于犬細小病毒的檢測，雖在靈敏度方面有所改進，但由于需要精密儀器的配套使用，同樣也無法滿足現(xiàn)有檢測的需要。
【發(fā)明內容】
[0004]本發(fā)明的目的是提供一種具有高靈敏、高特異性、操作方法簡單、反應結果易于觀察，非常適用于現(xiàn)場檢測犬細小病毒的化學發(fā)光試劑盒。
[0005]為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術方案為:一種犬細小病毒化學發(fā)光檢測試劑盒，包括盒體，盒體內設有包被有濃度為10ug/mL的犬細小病毒包被抗體的聚苯乙烯96孔微孔板、犬細小病毒抗原質控對照品、辣根過氧化酶標記的羊抗鼠抗體溶液、犬細小病毒標準溶液、樣品稀釋液、濃縮洗滌液和化學發(fā)光液。
[0006]所述犬細小病毒抗原質控對照品包括30-80IU/L的低質控對照品和200-350IU/L的聞質控對照品。
[0007]所述犬細小病毒標準溶液有6種,濃度分別為:16ng/mL、22ng/mL、35ng/mL、40ng/mL、55ng/mL和 65ng/mL。
[0008]所述樣品稀釋液是將8g NaCU0.2g KH2PO4,22.9g Na2HPO4.12Η20、0.2g KCl 和酪蛋白溶于IOOOmL蒸餾水中制備而成，其中酪蛋白濃度為1%。
[0009]所述濃縮洗滌液是將80g NaCl,2.0g KH2PO4,229.0g Na2HPO4.12Η20、2.0g KCl 和吐溫-20溶于IOOOmL蒸餾水中制備而成，其中吐溫_20的濃度為5%。
[0010]所述化學發(fā)光液分為化學發(fā)光底物液A和化學發(fā)光底物液B兩種液體,化學發(fā)光底物液A為用Tris緩沖液配制的含2mmol/L魯米諾和0.2mmol/L對碘苯酹的混合液,化學發(fā)光底物液B為用Tris緩沖液配制的含7.5mmol/L雙氧水的混合液。[0011]所述辣根過氧化酶標記的羊抗鼠抗體溶液為辣根過氧化酶-羊抗鼠IgG原液。
[0012]所述犬細小病毒包被抗體的包被過程是將犬細小病毒單克隆抗體溶于0.lmol/L的碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液中形成10ug/mL的溶液，將上述溶液加入到聚苯乙烯96孔微孔板的各孔中，并在4°C下靜置12h，然后傾去上述溶液，用洗滌液洗滌各孔3次、拍干，然后向各孔加入150ul/孔的封閉液，并在37°C下孵育2h，傾去孔內液體，洗滌液洗滌3次，拍干，最后將微孔板用鋁箔袋真空密封，并在4°C下保存。其中，所述的犬細小病毒單克隆抗體與0.lmol/L的碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液的稀釋度為1:800，所述封閉液是由IOg BSA溶于IOOml水中，再加入5%的脫脂奶粉、1%的明膠、0.05%的NaN3制成的。
[0013]有益效果:本發(fā)明試劑盒靈敏度高可達3ng/mL，并且具有高特異性、寬檢測范圍、操作方法簡單、反應結果易于觀察等特點，不僅提高了檢測效率，而且保證了檢測的精確度，可用于出口檢驗、食品安全檢驗及動物養(yǎng)殖業(yè)現(xiàn)場快速檢測。
【具體實施方式】
[0014]一種犬細小病毒化學發(fā)光檢測試劑盒，包括盒體，盒體內設有包被有濃度為IOug/HiL的犬細小病毒包被抗體的聚苯乙烯96孔微孔板、犬細小病毒抗原質控對照品、辣根過氧化酶標記的羊抗鼠抗體溶液、犬細小病毒標準溶液、樣品稀釋液、濃縮洗滌液和化學發(fā)光液。
[0015]所述犬細小病毒抗原質控對照品包括30-80IU/L的低質控對照品和200-350IU/L的聞質控對照品。
[0016]所述犬細小病毒標準溶液有6種,濃度分別為:16ng/mL、22ng/mL、35ng/mL、40ng/mL、55ng/mL和 65ng/mL。
[0017]所述樣品稀釋液是將8g NaCU0.2g KH2PO4,22.9g Na2HPO4.12Η20、0.2g KCl 和酪蛋白溶于IOOOmL蒸餾水中制備而成，其中酪蛋白濃度為1%。
[0018]所述濃縮洗滌液是將80g NaCl,2.0g KH2PO4,229.0g Na2HPO4.12Η20、2.0g KCl 和吐溫-20溶于IOOOmL蒸餾水中制備而成，其中吐溫_20的濃度為5%。
[0019]所述化學發(fā)光液分為化學發(fā)光底物液A和化學發(fā)光底物液B兩種,化學發(fā)光底物液A為用Tris緩沖液配制的含2mmol/L魯米諾和0.2mmol/L對碘苯酹的混合液,化學發(fā)光底物液B為用Tris緩沖液配制的含7.5mmol/L雙氧水的混合液。
[0020]所述辣根過氧化酶標記的羊抗鼠抗體溶液為辣根過氧化酶-羊抗鼠IgG原液。
[0021]所述犬細小病毒包被抗體的包被過程是將犬細小病毒單克隆抗體溶于0.lmol/L的碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液中形成10ug/mL的溶液，將上述溶液加入到聚苯乙烯96孔微孔板的各孔中，并在4°C下靜置12h，然后傾去上述溶液，用洗滌液洗滌各孔3次、拍干，然后向各孔加入150ul/孔的封閉液，并在37°C下孵育2h，傾去孔內液體，洗滌液洗滌3次，拍干，最后將微孔板用鋁箔袋真空密封，并在4°C下保存。其中，所述的犬細小病毒單克隆抗體與0.lmol/L的碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液的稀釋度為1:800，所述封閉液是由IOg BSA溶于IOOml水中，再加入5%的脫脂奶粉、1%的明膠、0.05%的NaN3制成的。
[0022]應用本發(fā)明的試劑盒檢測犬細小病毒的方法包括如下步驟:
(O配洗液:將濃縮洗滌液用蒸餾水稀釋20倍，制成工作濃度的洗滌液；
(2)編號:在所述包被過犬細小病毒包被抗體的聚苯乙烯96孔微孔板上設高質控對照品孔、低質控對照品孔、犬細小病毒標準溶液孔以及待檢樣品孔，并編號；
(3)加樣孔稀釋液:向待檢樣品孔加入樣品稀釋液，每孔90ul；
(4)加樣:分別向聞質控對照品孔和低質控對照品孔加入對應的質控對照品IOOul,向犬細小病毒標準溶液孔內加入各個標準溶液IOOul/孔,并向各待檢樣品孔加入待檢樣品IOul,然后在37±2°C下溫育30分鐘；
(5)洗滌:傾出各孔中的液體，然后向各孔加入步驟(1)的洗滌液250yL，洗滌3次，拍
干;
(6)加酶標羊抗鼠抗體溶液:將辣根過氧化酶標記的羊抗鼠抗體溶液與步驟(1)的洗滌液配制成1:2500工作濃度的稀釋液，然后向各孔加入100 μ L上述稀釋液，再在37±2°C下溫育30分鐘；
(7)洗滌:傾出各孔中的液體，每孔加入步驟(1)的洗滌液250μ L，洗滌3次，拍干；
(8)加化學發(fā)光液:向各孔均先后加入化學發(fā)光底物液A和化學發(fā)光底物液B各50 μ L ；
(9)檢測:用化學發(fā)光免疫分析儀測定各孔的發(fā)光強度；
(10)結果判斷:以犬細小病毒標準溶液的濃度對數(shù)做橫坐標，標準溶液的發(fā)光值對數(shù)做縱坐標，做標準曲線，根據每一個待檢樣品的發(fā)光值可以從標準曲線上計算出待檢樣品的濃度。
[0023]本發(fā)明試劑盒的特異性、靈敏度和精密度的檢測結果如下:
1、特異性試驗結果
【權利要求】
1.一種犬細小病毒化學發(fā)光檢測試劑盒，包括盒體，其特征在于:盒體內設有包被有濃度為10ug/mL的犬細小病毒包被抗體的聚苯乙烯96孔微孔板、犬細小病毒抗原質控對照品、辣根過氧化酶標記的羊抗鼠抗體溶液、犬細小病毒標準溶液、樣品稀釋液、濃縮洗滌液和化學發(fā)光液； 所述犬細小病毒標準溶液有6種，濃度分別為:16ng/mL、22ng/mL、35ng/mL、40ng/mL、55ng/mL 和 65ng/mL ； 所述樣品稀釋液是將 8g NaCU0.2g KH2PO4,22.9g Na2HPO4.12H20、0.2g KCl 和酪蛋白溶于IOOOmL蒸餾水中制備而成，其中酪蛋白濃度為1%; 所述濃縮洗滌液是將 80g NaCl,2.0g KH2PO4,229.0g Na2HPO4.12Η20、2.0g KCl 和吐溫-20溶于IOOOmL蒸餾水中制備而成，其中吐溫_20的濃度為5% ； 所述化學發(fā)光液分為化學發(fā)光底物液A和化學發(fā)光底物液B兩種液體,化學發(fā)光底物液A為用Tris緩沖液配制的含2mmol/L魯米諾和0.2mmol/L對碘苯酹的混合液,化學發(fā)光底物液B為用Tris緩沖液配制的含7.5mmol/L雙氧水的混合液。
【文檔編號】G01N33/569GK103630688SQ201310556137
【公開日】2014年3月12日 申請日期:2013年11月11日 優(yōu)先權日:2013年11月11日
【發(fā)明者】王善普, 李秀梅, 李長印, 王會會, 張莎莎 申請人:洛陽萊普生信息科技有限公司