一種鹽酸多柔比星脂質(zhì)體包封率的測(cè)定方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于化學(xué)藥品檢測(cè)領(lǐng)域，特別涉及一種關(guān)于鹽酸多柔比星脂質(zhì)體包封率的測(cè)定方法。鹽酸多柔比星脂質(zhì)體為磷脂雙層膜包裹鹽酸多柔比星而形成的納米小球，沒有包裹的鹽酸多柔比星游離在球的外面。當(dāng)體系中加入堿液時(shí)，游離多柔比星與堿發(fā)生反應(yīng)，游離的多柔比星吸收波長(zhǎng)長(zhǎng)移，而包裹在膜內(nèi)的多柔比星，由于膜的隔離不與堿發(fā)生反應(yīng)，保持原來(lái)吸收波長(zhǎng)。利用紫外可見光光度計(jì)，通過波長(zhǎng)變化，計(jì)算出脂質(zhì)體的包封率。該方法具有測(cè)定耗時(shí)短、方便、準(zhǔn)確、誤差小、重現(xiàn)好，適用于工業(yè)化生產(chǎn)過程控制的特點(diǎn)。
【專利說明】一種鹽酸多柔比星脂質(zhì)體包封率的測(cè)定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于化學(xué)藥品檢測(cè)領(lǐng)域，特別涉及一種關(guān)于鹽酸多柔比星脂質(zhì)體包封率的測(cè)定方法。
【背景技術(shù)】
[0002]包封率是脂質(zhì)體和納米粒質(zhì)量控制的一個(gè)重要的指標(biāo)，反映了藥物被載體包封的程度，藥物和載體的濃度，制備過程中的條件是影響其包封率的主要因素。包封率包括百分包封率和包裹容積的測(cè)定，一般文獻(xiàn)主要考察百分包封率(Encapsulationpercentage, EN%)。其表達(dá)式是EN%=(1 — Cf / Ct) X 100%。式中Cf為游離藥物的量；Ct為納米?；蛑|(zhì)體懸液中藥物的總量。為準(zhǔn)確測(cè)定包封率，將納米粒或脂質(zhì)體和游離藥物分離是關(guān)鍵的步驟。由于脂質(zhì)體或納米粒比被包裹的藥物粒子要大的多，可以利用它們的大小不同來(lái)分離除去未包裹的藥物，這些方法有凝膠過濾柱層析法、滲析法等；如果被包裹的藥物是蛋白質(zhì)或DNA等，或未被包裹的藥物可能形成較大的聚結(jié)物，則可以利用它們與納米?；蛑|(zhì)體浮力、密度不同而采用離心等方法進(jìn)行分離。常見包封率檢測(cè)方法如下:
[0003]1.柱層析法
[0004]凝膠滲透層析技術(shù)因其有效且快速而在實(shí)驗(yàn)室得到廣泛應(yīng)用。它可用于分離除去未包裹藥物也可以對(duì)懸液中的脂質(zhì)體或納米粒大小分組。應(yīng)注意的是脂質(zhì)體或納米粒被洗脫介質(zhì)稀釋后可能需要增加濃縮步驟。柱層析填料常用葡聚糖如Sephadex G-50,也有文獻(xiàn)報(bào)道使用Sephadex G-25和Sephadex G-200,具體步驟為:在層析柱中裝入用水或生理鹽水或磷酸鹽緩沖液溶脹的Sephadex G_50，將混懸液上柱，用水或生理鹽水或磷酸鹽緩沖液控制流速洗脫。選用凝膠的粒徑大小、洗脫液的種類、洗脫的速度、溫度對(duì)分離有重要的影響，在具體的實(shí)驗(yàn)中需要作出洗脫曲線以確定最佳的分離效果。
[0005]韓靜等人在測(cè)定降香揮發(fā)油固體脂質(zhì)納米粒的包封率時(shí)采用柱層析法分離。條件是:Sephadex G-50柱(16cmX 2cm),洗脫液為蒸懼水,流速為Iml / min,室溫。移取降香揮發(fā)油固體納米粒0.5ml上柱，以柱層析條件洗脫，每3ml收集一次。被包封的藥物量應(yīng)用含藥量測(cè)定的HPLC條件測(cè)定。
[0006]何軍等人將溶脹12小時(shí)的S印hadex G-25裝柱，用80ml水洗脫，流速Iml /min，收集后40ml洗脫液進(jìn)行測(cè)定(2)。紫杉醇長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)納米粒的包封率測(cè)定同樣選用Sephadex凝膠柱，用水為洗脫液，接取其中帶有藍(lán)色乳光的部分測(cè)定。
[0007]欒立標(biāo)等在測(cè)定酮洛芬明膠微球包封率時(shí)發(fā)現(xiàn)凝膠柱層析法除有準(zhǔn)確、方便、微粒不易破壞、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)外，還可以純化微球，不僅可以除去未包裹的藥物、無(wú)機(jī)鹽等低分子量雜質(zhì)，而且也可以分離出吐溫-20。
[0008]高曉黎等對(duì)葡聚糖凝膠色譜法測(cè)定脂質(zhì)體包封率的條件進(jìn)行了篩選。對(duì)玻璃色譜柱，凝膠的粒徑并不是越小越好，若凝膠顆粒太細(xì)，較大的脂質(zhì)體可能被滯留在凝膠柱上，選用時(shí)要考慮被分離化合物的分子大小和性質(zhì)。對(duì)于多層脂質(zhì)體宜選用中粗級(jí)的凝膠(粒徑大小50 — 150 μ m)，而對(duì)于小單層脂質(zhì)體則可以用任何級(jí)別的凝膠。在柱色譜過程中，所用的色譜柱的徑高比，洗脫液的流速以及上樣量的多少均影響從脂質(zhì)體中分離游離藥物，宜選擇能使脂質(zhì)體達(dá)到最大分離程度的洗脫條件，才能保證準(zhǔn)確的包封率。還應(yīng)注意的是葡聚糖表面存在著能與脂質(zhì)體膜結(jié)合并相互作用的微小部位。雖然這種作用并不影響脂質(zhì)體在凝膠柱上的流動(dòng)特性，但仍可導(dǎo)致少量脂質(zhì)的損失，使膜不穩(wěn)定性增加，從而導(dǎo)致膜滲透性的改變及包裹物質(zhì)的滲漏。這種現(xiàn)象在脂質(zhì)濃度較低的情況下應(yīng)予以特別的注意，一般可通過加大脂質(zhì)體樣品上柱量或用空脂質(zhì)體預(yù)先將柱子飽和來(lái)解決。
[0009]2.滲析法
[0010]滲析法是利用脂質(zhì)體或納米粒粒子和藥物分子大小不同，通過半透膜材料的膜孔截留作用將游離藥物除去的方法。脂質(zhì)體和納米粒較大不能透過半透膜，而游離藥物可以通過，一般把脂質(zhì)體和納米粒放在半透膜內(nèi)，常用的半透膜材料有羊皮紙，動(dòng)物膀胱和火棉膠等。膜外放純?nèi)軇?，由于濃度差因素，膜?nèi)的游離藥物不斷向膜外滲透，經(jīng)常更換膜外的溶劑，使游離藥物被完全分離出來(lái)。此法是最簡(jiǎn)單的也是最常用的除去未包封藥物的方法(大分子化合物除外)。它不需要復(fù)雜的技術(shù)，也無(wú)需昂貴的儀器，且能夠擴(kuò)大生產(chǎn)。通過不斷改換滲析介質(zhì)可除去所有的游離藥物。但此法很費(fèi)時(shí)，一般室溫條件下，要除去95%以上的游離藥物至少需要更換三次滲析介質(zhì)，時(shí)間在10 - 24h以上。此外，滲析介質(zhì)的滲透強(qiáng)度應(yīng)與脂質(zhì)體或納米粒懸液的濃度一致，否則在滲析中就會(huì)改變脂質(zhì)體和納米粒懸液的體積，且可能引起包裹物質(zhì)的滲漏。
[0011]胰島素納米粒的分離應(yīng)用滲析法，胰島素脂質(zhì)體用pH7.4PBS配制成合適濃度，取Iml放入透析袋中，pH7.4PBS10.0ml為溶出介質(zhì)，置于三角具塞燒瓶中，將三角燒瓶置于振蕩器內(nèi)振蕩，恒溫37°C，振蕩頻率為150r / min。3h后取透析液，測(cè)定其濃度。
[0012]張桂芳等在測(cè)定尼莫地液納米脂質(zhì)體包封率中將脂質(zhì)體溶液Iml于已處理的透析袋(分子量10000 )中，將透析袋浸入透析袋(即制備該脂質(zhì)體時(shí)所用的水合介質(zhì))45ml，置于磁力攪拌器上攪拌，定時(shí)更換透析液。因?yàn)樵谠搶?shí)驗(yàn)中脂質(zhì)體粒子較小(約30 — 150nm)，離心法分離效果不是很好，滲析的效果比較好。
[0013]呂文莉等在燈蓋花素脂質(zhì)體包封率測(cè)定中將每瓶脂質(zhì)體凍干粉加Iml重蒸水水合后，精密移取0.5ml，加入筒裝的透析袋中，放入盛有IOOml0.9% NaCl的錐形瓶中，在37°C水浴中磁力攪拌。在預(yù)實(shí)驗(yàn)中，確定在4h取外液進(jìn)行測(cè)定。熊非等人在燈盞花素納米脂質(zhì)體包封率的測(cè)定方法中應(yīng)用了反透析法。具體方法是將脂質(zhì)體溶液置于透析袋外，水合介質(zhì)于透析袋內(nèi)，攪拌透析袋外液，透析16h。精密吸取透析袋內(nèi)液進(jìn)行測(cè)定。
[0014]由于制備的脂質(zhì)體較小，平均粒徑20.8nm，采用葡聚糖凝膠柱色譜法，換取不同的上樣體積和流動(dòng)相均難以分離脂質(zhì)體和游離藥物，而且脂質(zhì)體從上樣和完全洗脫稀釋倍數(shù)較大，有可能導(dǎo)致脂質(zhì)體滲漏。脂質(zhì)體的粒徑較小，用較長(zhǎng)時(shí)間的超速離心也無(wú)法分離脂質(zhì)體和游離藥物。常規(guī)滲析法是將脂質(zhì)體置于透析袋內(nèi)，透析物質(zhì)置于透析袋外液，游離藥物可以透過透析袋，直到透析袋中游離藥物的濃度與透析介質(zhì)中達(dá)到平衡，但由于透析袋外液的體積一般為內(nèi)液體積的20 - 50倍，當(dāng)透析完全時(shí)，脂質(zhì)體周圍藥物濃度會(huì)稀釋較大倍數(shù)，可能由于脂質(zhì)體和游離藥物的動(dòng)態(tài)平衡被打破而導(dǎo)致透析過程中脂質(zhì)體藥物的滲漏。所以反滲透法可以有效的避免滲漏。
[0015]3.離心法
[0016]在不同的離心力下離心分離是分離除去不同種類脂質(zhì)體或納米粒中游離藥物的有效方法。為了完全除去游離藥物，常常需要重復(fù)懸浮和多次離心。使脂質(zhì)體或納米粒下沉所需要的離心力取決于脂質(zhì)體和納米粒的大小，在某種程度上還取決于混懸液的絮凝狀態(tài)。如果脂質(zhì)體或納米粒小且分布窄，就需要高速離心及冰凍條件。低速(2000 — 4000r /min)離心只能使大脂質(zhì)體或納米粒沉降。對(duì)于大量脂質(zhì)體和納米粒利用高速冰凍離心及其消耗能量且比較昂貴，因此此法不適于分離小脂質(zhì)體或納米粒。
[0017]文獻(xiàn)報(bào)道中，納米粒和較大的脂質(zhì)體多用離心法分離。周小菊等用離心法將熊果酸磷脂納米粒與其游離藥物分離，低溫超速離心(4°C, IOOOOOr / min,60min)后,取上清夜測(cè)定。阿柔比星A聚乳酸毫微粒、眼用諾氟沙星毫微粒、吡喹酮脂質(zhì)體等都是應(yīng)用低溫高速離心來(lái)分離游離藥物的。Tasana Pitaksuteepong等人在油包水微乳界面聚合制備親水物質(zhì)的納米粒中用的分離條件為:51500Xg、lh、25°C (14)。對(duì)于比較大的脂質(zhì)體，低速離心可縮短時(shí)間并且可同時(shí)將較稀的脂質(zhì)體混懸液濃縮到所需的濃度。為了避免脂質(zhì)體遭到破壞，必須注意保證重復(fù)混懸介質(zhì)的滲透壓和脂質(zhì)體懸液的滲透壓一致。
[0018]4.超濾法
[0019]超濾(簡(jiǎn)稱UF)，是以壓力為推動(dòng)力，利用超濾膜不同孔徑對(duì)液體進(jìn)行分離的物理篩分過程。其分子切割量(CWCO)—般為6000到50萬(wàn)，孔徑為IOOnm (納米)。起源于是1748年，Schmidt用棉花膠膜或璐膜分濾溶液，當(dāng)施加一定壓力時(shí)，溶液(水)透過膜，而蛋白質(zhì)、膠體等物質(zhì)則被截留下來(lái)，其過濾精度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過濾紙，故稱超濾。超濾的分離特點(diǎn)有:①分離過程無(wú)相變化，因此節(jié)約能源分離是在常溫下進(jìn)行，適合于一些熱敏感性物質(zhì)(如果汁，藥品，生物制劑)的濃縮和提純；③系列化的超濾膜，可將多組份的大分子溶液體系實(shí)行分子量分級(jí)；④設(shè)備簡(jiǎn)單，易于操作、管理和維修超濾是一個(gè)由高分子聚合物制成的均勻的連續(xù)體，在使用過程中，膜本身無(wú)任何碎屑或微粒脫落，保證透過水純凈。
[0020]在包封率測(cè)定中，超濾器也被用于分離脂質(zhì)體或納米粒和游離藥物。喜樹堿固體脂質(zhì)體納米粒研究中用SS-5中空纖維超濾器(截留平均分子量10000)進(jìn)行超濾。王準(zhǔn)紅等在噴昔洛韋脂質(zhì)體的藥物包封率測(cè)定中用SS-14A型超濾器，超濾膜分子截留量3萬(wàn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0021]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是:現(xiàn)有技術(shù)中，測(cè)定包封率，通常需要將脂質(zhì)體與未被包封的藥物分離，操作復(fù)雜，準(zhǔn)確率下降。
[0022]為解決這一技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:
[0023]本發(fā)明提供了一種鹽酸多柔比星脂質(zhì)體包封率的測(cè)定方法，分為3個(gè)步驟:
[0024](I)總藥物測(cè)定:配制一定濃度的鹽酸多柔比星脂質(zhì)體樣品溶液，測(cè)定該樣品溶液的吸收度，
[0025]以多柔比星計(jì)，鹽酸多柔比星脂質(zhì)體的濃度控制為0.00001mg/ml?2mg/ml，總藥物測(cè)定波長(zhǎng)為249— 259nm，
[0026]作為優(yōu)選，可采用如下操作，取鹽酸多柔比星脂質(zhì)體，稀釋至0.004mg/ml,以甲醇為空白，利用紫外可見光光度計(jì)，在254nm處測(cè)定吸收度A1 ；
[0027](2)游離藥物測(cè)定:向與步驟(I)為同一批次的，同濃度鹽酸多柔比星脂質(zhì)體溶液中，加入過量的堿反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，測(cè)定吸收度。
[0028]其中，堿選自氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化鋰、氨水中一種或多種，堿的濃度為0.0Olmol/L~3mol/L，堿性越強(qiáng)，反應(yīng)時(shí)間越短，反應(yīng)越完全，
[0029]反應(yīng)溫度為0°C~55°C，溫度高利于反應(yīng)，但脂質(zhì)體膜具有相轉(zhuǎn)變溫度，太高的條件下，膜就變得易于通透，這樣堿會(huì)進(jìn)入脂質(zhì)體中心，從而影響測(cè)定結(jié)果。
[0030]本發(fā)明包封率檢測(cè)時(shí)間短是其顯著特點(diǎn)，當(dāng)堿加入脂質(zhì)體中，游離多柔比星立刻反應(yīng)，使體系變藍(lán)，其反應(yīng)時(shí)間為0.001小時(shí)~0.5小時(shí)。
[0031]以多柔比星計(jì)，鹽酸多柔比星脂質(zhì)體的濃度控制為0.001mg/ml~2.5mg/ml，游離藥物測(cè)定波長(zhǎng)為570— 610nm，
[0032]作為優(yōu)選，可采用如下操作，取2mg/ml的同一批次的鹽酸多柔比星脂質(zhì)體1ml，稀釋500倍后，加入過量的堿反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，以同濃度的鹽酸多柔比星脂質(zhì)體為空白，利用紫外可見光光度計(jì)，在600nm處測(cè)定吸收度A2 ；
[0033](3)通過校正因子計(jì)算包封率，包封率= (1-AdfyA1)MO(Fc),考慮測(cè)試儀器及品牌的不同，校正因子f為1.488~1.522，本發(fā)明中測(cè)定f為1.500。
[0034]因?yàn)橹|(zhì)體雙層膜具有隔離作用。當(dāng)體系中加入堿液時(shí)，游離多柔比星與堿發(fā)生反應(yīng)，游離的多柔比星吸收波長(zhǎng)長(zhǎng)移，而包裹在膜內(nèi)的多柔比星，由于膜的隔離不與堿發(fā)生反應(yīng)，保持原來(lái)吸收波長(zhǎng)，不存在干擾。從而可以直接測(cè)定游離藥物，計(jì)算出包封率。
[0035]本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明為脂質(zhì)體包封率測(cè)定提供了一種新型方法，在無(wú)需采用分離手段的情況下，具有測(cè)定耗時(shí)短、方便、準(zhǔn)確、誤差小、重現(xiàn)好，適用于工業(yè)化生產(chǎn)過程控制的特點(diǎn)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0036]圖1為鹽酸多柔比星的掃描圖，在600nm處不存在吸收。
[0037]圖2為加堿后的鹽酸多柔比星掃描圖，可見明顯在600nm處存在吸收。
[0038]圖3為70%包封率的鹽酸多柔比星脂質(zhì)體掃描圖，在600nm處不存在吸收。
[0039]圖4為70%包封率的鹽酸多柔比星脂質(zhì)體，加堿后的掃描圖，可見明顯在600nm處存在吸收。
【具體實(shí)施方式】
[0040]實(shí)施例1
[0041]鹽酸多柔比星脂質(zhì)體批號(hào)0344689包封率約80%
[0042](I)總藥物的測(cè)定:取2mg/ml的鹽酸多柔比星脂質(zhì)體Iml于50ml的容量瓶中，加甲醇至刻度搖勻。取其中Iml于IOml的容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，以甲醇為空白在254nm處測(cè)定吸收度為Altt=0.382.[0043](2)游離藥物測(cè)定:取2mg/ml的與步驟(1)為同一批次的鹽酸多柔比星脂質(zhì)體Iml于50ml的容量瓶中，加水至刻度搖勻。取其中Iml于IOml的容量瓶中，在2~8°C下加
0.lmol/L的氫氧化鈉至刻度,搖勻，反應(yīng)5分鐘。
[0044]取同濃度(同一批次)的鹽酸多柔比星脂質(zhì)體，取Iml于50ml的容量瓶中，加水至刻度搖勻，再取其中Iml于IOml的容量瓶中，在室溫下，加水至刻度，搖勻，為空白。
[0045]利用紫外可見光光度計(jì)，在600nm處測(cè)定吸收度為A2tt=0.051。
[0046](3)通過校正因子計(jì)算包封率，包封率=(1-4村7^)*100%，校正因子f為1.5。[0047]測(cè)定結(jié)果分析
【權(quán)利要求】
1.一種鹽酸多柔比星脂質(zhì)體包封率的測(cè)定方法，其特征在于:所述的測(cè)定方法為， (1)總藥物測(cè)定:配制一定濃度的鹽酸多柔比星脂質(zhì)體樣品溶液，測(cè)定該樣品溶液的吸收度； (2)游離藥物測(cè)定:向與步驟(I)為同一批次的，同濃度鹽酸多柔比星脂質(zhì)體溶液中，加入過量的堿反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，測(cè)定吸收度； (3)通過校正因子計(jì)算包封率。
2.如權(quán)利要求1所述的鹽酸多柔比星脂質(zhì)體包封率的測(cè)定方法，其特征在于:步驟(2)中所述的堿，選自氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化鋰、氨水中一種或多種。
3.如權(quán)利要求1所述的鹽酸多柔比星脂質(zhì)體包封率的測(cè)定方法，其特征在于:步驟(2)中，加入堿的濃度為0.0Olmol/L?3mol/L。
4.如權(quán)利要求1所述的鹽酸多柔比星脂質(zhì)體包封率的測(cè)定方法，其特征在于:步驟(2)中所述的反應(yīng)溫度為0°C?55°C。
5.如權(quán)利要求1所述的鹽酸多柔比星脂質(zhì)體包封率的測(cè)定方法，其特征在于:步驟(I)中，總藥物測(cè)定波長(zhǎng)為249— 259nm ;步驟(2)中游離藥物測(cè)定波長(zhǎng)為570— 610nm。
6.如權(quán)利要求1所述的鹽酸多柔比星脂質(zhì)體包封率的測(cè)定方法，其特征在于:步驟(3)中所述的校正因子為1.488?1.522。
7.如權(quán)利要求1所述的鹽酸多柔比星脂質(zhì)體包封率的測(cè)定方法，其特征在于:步驟(I)或步驟(2)中，以多柔比星計(jì),鹽酸多柔比星脂質(zhì)體的濃度為0.001mg/ml?2.5mg/ml。
【文檔編號(hào)】G01N21/33GK103630508SQ201310585408
【公開日】2014年3月12日 申請(qǐng)日期:2013年11月19日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月19日
【發(fā)明者】朱瑤俊, 賀明, 符俊, 代光玉 申請(qǐng)人:常州金遠(yuǎn)藥業(yè)制造有限公司