一種基于t細(xì)胞表位篩查低乳糜瀉毒性小麥品種的方法
【專利摘要】一種基于T細(xì)胞表位篩查低乳糜瀉毒性小麥品種的方法，具體包括兩步法分離提取小麥麩質(zhì)蛋白、SDS-PAGE電泳結(jié)合PageBlueTM染色法鑒定麩質(zhì)蛋白，以及免疫印跡法檢測麩質(zhì)蛋白致乳糜瀉T細(xì)胞表位等步驟。本發(fā)明通過基于T細(xì)胞表位的篩選方法，能夠篩查出低乳糜瀉毒性小麥品種，可從原料這一源頭開始為乳糜瀉患者提供安全可靠的低麩質(zhì)食品，降低乳糜瀉患者的安全風(fēng)險(xiǎn)。
【專利說明】—種基于T細(xì)胞表位篩查低乳糜瀉毒性小麥品種的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明所屬領(lǐng)域主要為食品和生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種基于T細(xì)胞表位篩查低乳糜瀉毒性小麥品種的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]乳糜瀉是一種遺傳易感者對小麥、黑麥和大麥麩質(zhì)蛋白不耐受而引發(fā)的慢性腸炎疾病。它在歐美發(fā)病率達(dá)1_2%，且全球呈上升趨勢。該病目前無有效療法，嚴(yán)格的無麩質(zhì)飲食是患者唯一的治療方式。但由于市面上無麩質(zhì)食品少且質(zhì)量良莠不齊，同時(shí)很多并不含有麩質(zhì)的食品也有可能在加工過程中混入麩質(zhì)，嚴(yán)重影響了乳糜瀉患者的生活。因此，篩查低乳糜瀉毒性小麥品種具有重大的意義。
[0003]麩質(zhì)蛋白主要包括單體的麥醇溶蛋白(a/0、Y、醇溶蛋白)和多聚體的麥谷蛋白(高分子量麥谷蛋白和低分子量麥谷蛋白)。二者含有大量的脯氨酸和谷氨酰胺，含少量精氨酸、賴氨酸和組氨酸。麥醇溶蛋白主要溶解于醇溶液，麥谷蛋白溶解于含還原劑的醇溶液。由于麩質(zhì)蛋白氨基酸種類和含量的特殊性，導(dǎo)致其不同于普通的食物蛋白，常規(guī)的各種方法對于麩質(zhì)蛋白的研究并不適用。
[0004]弓丨發(fā)乳糜瀉的是麩質(zhì)蛋白上的某些T細(xì)胞表位，這些表位不僅存在于麥醇溶蛋白上，也存在于麥谷蛋白上。麩質(zhì)蛋白的高效分離提取對于致乳糜瀉T細(xì)胞表位的鑒定至關(guān)重要。目前，關(guān)于小麥麩質(zhì)蛋白的提取方法主要有60%的乙醇法和50%異丙醇結(jié)合DTT —步法。60%乙醇提取法是使用最早也較普遍的一種提取方法，但該法對于同樣存在致乳糜瀉表位的麥谷蛋白提取效率不聞，有研究報(bào)道60%乙醇提取法可從每克小麥中提取鉄質(zhì)蛋白
0.0lg，濃度為0.33mg/mL。而50%異丙醇結(jié)合DTT的一步法由于加入了還原劑DTT，因而對于麥谷蛋白的提取效率大大提聞了，可從每克小麥中提取鉄質(zhì)蛋白0.03g,該法提取的鉄質(zhì)蛋白濃度為1.01mg/ml。但一步提取法對醇溶蛋白和D-型低分子量蛋白的提取效率不高，現(xiàn)有報(bào)道的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，該法提取的麩質(zhì)蛋白中這兩種蛋白會(huì)有很大程度的缺失。
[0005]提取的麩質(zhì)蛋白通過SDS-PAGE (SDS-聚丙烯酰胺凝膠)電泳進(jìn)行鑒定，常規(guī)SDS-PAGE膠的染色方法主要有考馬斯亮藍(lán)(R-250)染色法和銀染等。由于麩質(zhì)蛋白具有非典型的氨基酸組成，因而不同的染色條件對麩質(zhì)蛋白的鑒定有不同程度的偏差。其中傳統(tǒng)的考馬斯亮藍(lán)(R-250)染色法主要與賴氨酸和精氨酸殘基反應(yīng)，檢測靈敏度為8-16 ng，且該法操作簡單。但是傳統(tǒng)考馬斯亮藍(lán)染色后的麩質(zhì)蛋白，在脫色過程中，蛋白會(huì)不同程度地被洗脫，特別是醇溶蛋白和低分子量麥谷蛋白，有些蛋白甚至?xí)笔Аｃy染靈雖然敏度較高，為4-8 ng,但操作程序復(fù)雜，且容易染色過度。研究發(fā)現(xiàn)，銀染對高分子量麥谷蛋白的染色效果也較差，如若延長染色時(shí)間又容易造成其他蛋白的染色過度。
[0006]現(xiàn)有的用于檢測小麥麩質(zhì)蛋白的方法有ELISA法，免疫印跡法和質(zhì)譜法。ELISA法需要采用特定的試劑盒，成本較高。目前市售的試劑盒主要是基于R5單抗和Skerritt抗體。這兩種抗體都只是檢測醇溶蛋白的，而對于同樣存在乳糜瀉毒性的麥谷蛋白不能檢測出。免疫印跡法原理同ELISA法一致，但該法對抗體的選擇比較自由，不再局限于針對醇溶蛋白的抗體，而是可以結(jié)合針對致乳糜瀉T細(xì)胞表位的抗體，檢測結(jié)果更準(zhǔn)確、直觀。質(zhì)譜分析具有靈敏度高、樣品用量少、質(zhì)量精度高且結(jié)果可靠等優(yōu)點(diǎn)，但與免疫學(xué)檢測方法相t匕，質(zhì)譜法依賴貴重設(shè)備，費(fèi)用較高、費(fèi)時(shí)費(fèi)力,不適用于食品行業(yè)現(xiàn)的場快速、大量檢測。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0007]本發(fā)明的目的是建立一種基于T細(xì)胞表位篩查低乳糜瀉毒性小麥品種的方法，具體提供分離提取麩質(zhì)蛋白的兩步法、麩質(zhì)蛋白鑒定的SDS-PAGE (SDS-聚丙烯酰胺凝膠)電泳結(jié)合PageBlue?染色法和麩質(zhì)蛋白致乳糜瀉T細(xì)胞表位鑒定的免疫印跡法。不僅可以應(yīng)用于篩查低乳糜瀉毒性小麥品種，還可應(yīng)用于篩查低乳糜瀉毒性的大麥、黑麥以及燕麥品種。該法檢測結(jié)果清晰、全面、直觀。
[0008]本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的。
[0009]本發(fā)明具體步驟如下。
[0010]1、麩質(zhì)蛋白的提取和鑒定。
[0011](I)麩質(zhì)蛋白的提取。選取各品種小麥仁研缽研磨成細(xì)粉，倒入離心管中，用于提取鉄質(zhì)蛋白。第一次抽提，用50%(v/v)的異丙醇抽提,超聲震蕩IOmin后，潤旋混勻30min,1000Orpm離心IOmin,收集上清液,保留沉淀。第二次抽提，每管沉淀加入0.5ml 50%異丙醇/l%DIT/50mM Tris pH 7.5，超聲震蕩 lOmin，60°C加熱 30min，每 5-10 min 混勻一次，1000Orpm離心IOmin,收集上清液,棄沉淀,將將兩次的上清液合并，14000rpm離心Imin,得上清液，即為總的麩質(zhì)蛋白。
[0012](2)麩質(zhì)蛋白的鑒定。采用常規(guī)SDS-PAGE電泳，用10%的分離膠和4%的濃縮膠進(jìn)行蛋白分離，用PageBlue?對麩質(zhì)蛋白進(jìn)行染色過夜，凝膠成像。
[0013]2、致乳糜瀉T細(xì)胞表位的鑒定。
[0014](I)按常規(guī)方法將電泳分離的小麥麩質(zhì)蛋白轉(zhuǎn)印到硝酸纖維脂膜(NC膜)上，取出膜，超純水沖洗3次，MemCode?染色試劑盒染色，凝膠成像后脫色。
[0015](2)以基于T細(xì)胞表位的兩種單克隆抗體(抗Glia-a 9單抗和抗Glia-a 20單抗)為一抗，按照常規(guī)方法做免疫印跡，BCIP/NBT顯色，Quantity One軟件分析。
[0016](3)通過灰度掃描比較T細(xì)胞表位含量的高低，評估小麥品種乳糜瀉毒性強(qiáng)弱。
[0017]本發(fā)明建立了兩步法提取麩質(zhì)蛋白，可以快速有效且較全面地提取麩質(zhì)蛋白，第一步和第二步可從每克小麥中提取鉄質(zhì)蛋白分別為0.05g和0.01g,提取的鉄質(zhì)蛋白濃度分別為1.52mg/mL和0.33mg/mL。且SDS-PAGE結(jié)果顯示提取出的麩質(zhì)蛋白包含麥醇溶蛋白和麥谷蛋白。同時(shí)，本發(fā)明創(chuàng)造性地選擇了 PageBlue?(G-250)染料用于染色鑒定SDS-PAGE中的麩質(zhì)蛋白，該法操作簡單，對麩質(zhì)蛋白的檢測靈敏度高達(dá)5 ng,且對高分子量麥谷蛋白的染色效果要強(qiáng)于銀染。本發(fā)明還建立了基于T細(xì)胞表位單克隆抗體的免疫印跡法檢測麩質(zhì)蛋白中致乳糜瀉T細(xì)胞表位，進(jìn)而評估小麥的乳糜瀉毒性。該法能同時(shí)檢測麥醇溶蛋白和麥谷蛋白上的致乳糜瀉T細(xì)胞表位，且操作方法簡單，檢測結(jié)果清晰直觀。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1不同小麥品種麩質(zhì)蛋白SDS-PAGE圖(2 ii g, 1-8號)M: Maker; Bov:Bovi ctus,普通六倍體小麥,用于對照。[0019]圖2麩質(zhì)蛋白免疫印跡結(jié)果和印跡相對強(qiáng)度；A:抗Glia_a9單抗；B:抗Glia- a 20單抗；Bov: Bovictus,六倍體小麥,用于對照。
【具體實(shí)施方式】
[0020]本發(fā)明將通過以下實(shí)施例作進(jìn)一步說明。
[0021]實(shí)施例1:不同小麥品種致乳糜瀉T細(xì)胞表位的篩查。
[0022]整個(gè)篩查過程包括小麥麩質(zhì)蛋白的提取、麩質(zhì)蛋白的SDS-PAGE結(jié)合PageBlue?染色鑒定，基于T細(xì)胞表位單抗的免疫印跡。具體的實(shí)施過程包括如下步驟。
[0023]1、麩質(zhì)蛋白的提取和鑒定。
[0024]選取8個(gè)小麥品種，1-8號分別為偃師16、內(nèi)鄉(xiāng)184、鄭州941、偃展893、小偃54、新旱I號、鄭農(nóng)16、豫農(nóng)015和一個(gè)對照品種Bovictus,磨粉后提取麩質(zhì)蛋白。
[0025]麩質(zhì)蛋白的提取采用50%異丙醇/DTT兩步法。選取各品種小麥仁研缽研磨成細(xì)粉，倒入離心管中，用于提取麩質(zhì)蛋白。第一次抽提，用50% (v/v)的異丙醇抽提，超聲震蕩IOmin后，潤旋混勻30min, IOOOOrpm離心IOmin,收集上清液(上清液I),保留沉淀。第二次抽提，每管沉淀加入0.5ml 50%異丙醇/l%DTT/50mM Tris pH 7.5，超聲震蕩lOmin，60°C加熱30min,每5-10 min混勻一次，IOOOOrpm離心IOmin,收集上清液(上清液2),棄沉淀,將上清液1、上清液2合并，HOOOrpm離心lmin，得上清液，即為總的麩質(zhì)蛋白。
[0026]采用常規(guī)SDS-PAGE電泳，條件為10%的分離膠和4%的濃縮膠，上樣量為每個(gè)品種2 u g，電泳I塊板系統(tǒng)選用分離膠10mA，30min,濃縮膠20mA，lh，直至溴酚藍(lán)跑到底部，取出膠用50%的乙醇和10%的乙酸固定15min。固定后用超純水漂洗5min,用PageBlue?對麩質(zhì)蛋白進(jìn)行染色過夜，凝膠成像，結(jié)果見圖1。
[0027]圖1泳道1-8分別為8個(gè)小麥品種，Bovictus為對照品種。從SDS-PAGE圖上可以看出采用50%異丙醇結(jié)合DTT的方法可以有效的提取出麩質(zhì)蛋白，提取出的麩質(zhì)蛋白包括高分子量蛋白、醇溶蛋白、低分子量蛋白和a/P-，Y-醇溶蛋白。且從電泳圖上可以清晰地看出各個(gè)小麥品種間麩質(zhì)蛋白存在差異。
[0028]2、致乳糜瀉T細(xì)胞表位的鑒定。
[0029]麩質(zhì)蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后，通過濕法轉(zhuǎn)膜，將麩質(zhì)蛋白轉(zhuǎn)印到NC膜上，取出膜，超純水沖洗3次，MemCode?染色試劑盒染色，凝膠成像后脫色。隨后按照常規(guī)方法做免疫印跡,加入一抗(分別為抗Glia-a 9單抗和抗Glia-a 20單抗)過夜，過夜后的膜加入二抗以及底物顯色。印跡結(jié)果通過Quantity One軟件進(jìn)行灰度掃描，計(jì)算其T細(xì)胞表位含量的相對強(qiáng)度值，通過比較得出致乳糜瀉T細(xì)胞表位強(qiáng)度最低的品種，最后綜合兩種單抗的印跡結(jié)果確定低乳糜瀉毒性小麥品種。其結(jié)果見圖2。
[0030]圖2 A為抗Glia- a 9單抗印跡結(jié)果和麩質(zhì)蛋白致乳糜瀉T細(xì)胞表位的相對強(qiáng)度圖，B為抗Glia-a 20單抗印跡結(jié)果和麩質(zhì)蛋白致乳糜瀉T細(xì)胞表位的相對強(qiáng)度圖。從A圖結(jié)合A的相對強(qiáng)度圖可以看出品種4號和6號含有的致乳糜灣T細(xì)胞表位Glia-a 9相比于其他品種較低。從B圖結(jié)合B的相對強(qiáng)度圖可以看出品種6號、4號和7號含有的致乳糜瀉T細(xì)胞表位Glia-a 20相比于其他品種較低。雖然7號品種含有較少的Glia-a 20表位，但由于7號含有較多的Glia- a 9表位，且該表位是主要的致乳糜瀉T細(xì)胞表位，因而排除7號。由于4號和6號品種在兩個(gè)印跡反應(yīng)中，二者表現(xiàn)相當(dāng)，因而誰的乳糜瀉毒性更低，則需要進(jìn)一步的研究。綜合考慮，得出4號和6號小麥品種的乳糜瀉毒性最低。
【權(quán)利要求】
1.一種基于T細(xì)胞表位篩查低乳糜瀉毒性小麥品種的方法，其特征是按如下步驟: (1)鉄質(zhì)蛋白的提取和鑒定 a)麩質(zhì)蛋白的提取:選取各品種小麥仁研缽研磨成細(xì)粉，倒入離心管中，用于提取麩質(zhì)蛋白；第一次抽提，用50% (v/v)的異丙醇抽提，超聲震蕩IOmin后，潤旋混勻30min,IOOOOrpm離心IOmin,收集上清液,保留沉淀；第二次抽提,每管沉淀加入0.5ml 50%異丙醇/l%DIT/50mM Tris pH 7.5，超聲震蕩 lOmin，60°C加熱 30min，每 5-10 min 混勻一次，IOOOOrpm離心IOmin,收集上清液,棄沉淀,將兩次的上清液合并，14000rpm離心Imin,得上清液，即為總的麩質(zhì)蛋白； b)麩質(zhì)蛋白的鑒定:采用常規(guī)SDS-PAGE電泳，用10%的分離膠和4%的濃縮膠進(jìn)行蛋白分離，用PageBlue?對麩質(zhì)蛋白進(jìn)行染色過夜，凝膠成像； (2)致乳糜瀉T細(xì)胞表位的鑒定 a)按常規(guī)方法將電泳分離的小麥麩質(zhì)蛋白轉(zhuǎn)印到硝酸纖維脂膜上，取出膜，超純水沖洗3次，MemCode?染色試劑盒染色，凝膠成像后脫色； b)以基于T細(xì)胞表位的Glia-a 9單抗和Glia- a 20單抗為一抗，按照常規(guī)方法做免疫印跡，BCIP/NBT顯色，Quantity One軟件分析； c)通過灰度掃描比較T細(xì)胞表位含量的高低，評估小麥品種乳糜瀉毒性強(qiáng)弱。
【文檔編號】G01N33/577GK103675291SQ201310600169
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年11月25日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月25日
【發(fā)明者】陳紅兵, 朱曉燕, 吳志華, 高金燕, 袁娟麗, 李欣, 佟平, 楊安樹 申請人:南昌大學(xué)