一種同時(shí)分析檢測(cè)動(dòng)物組織中殘留獸藥組分的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種同時(shí)分析檢測(cè)動(dòng)物組織中殘留獸藥組分的方法：動(dòng)物組織樣品經(jīng)過(guò)50%乙腈+乙醇勻漿、超聲提取，正己烷凈化，乙腈+乙醇進(jìn)一步沉淀，濃縮后用UPLC-MS/MS在負(fù)離子模式下，進(jìn)行多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)測(cè)定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和外標(biāo)法定量，檢測(cè)計(jì)算得到動(dòng)物組織中46種殘留獸藥組分的含量。本發(fā)明方法可用于18種喹諾酮類藥物、22種磺胺類藥物以及氨苯砜、苯乙醇胺A、阿莫西林、金剛烷胺、金剛乙胺、乙氧基喹啉等目前常用到的獸藥，可一次性同時(shí)快速準(zhǔn)確檢測(cè)，擴(kuò)大了本方法的應(yīng)用范圍。
【專利說(shuō)明】—種同時(shí)分析檢測(cè)動(dòng)物組織中殘留獸藥組分的方法
一、【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種動(dòng)物組織中常用獸藥殘留分析檢測(cè)的方法，尤其是涉及動(dòng)物組織中殘留的18種喹諾酮類藥物、22種磺胺類藥物、2種抗病毒藥、I種β內(nèi)酰胺類，I種砜類抗菌藥，I種喹惡啉類，I種β -激動(dòng)劑類藥物新型快速通用多組分同時(shí)分析檢測(cè)方法。
二、【背景技術(shù)】
[0002]18種喹諾酮類藥物(包括吡哌酸、麻保沙星、培氟沙星、氧氟沙星、依諾沙星、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、單諾沙星、洛美沙星、奧比沙星、雙氟沙星、沙拉沙星、斯帕沙星、西諾沙星、惡喹酸、萘啶酸、氟甲喹)；22種磺胺類藥物(磺胺、乙?；前?、磺胺嘧啶、磺胺二甲異嘧啶、磺胺噻唑、磺胺吡啶、磺胺甲嘧啶、三甲氧芐胺嘧啶、磺胺甲氧噠嗪、磺胺對(duì)甲氧嘧唆、磺胺間甲氧嘧唆、磺胺甲噻唑、磺胺二甲嘧唆、磺胺甲惡唑、磺胺二甲氧嘧唆、磺胺二甲異惡唑、磺胺苯甲酰、磺胺苯吡唑、磺胺氯噠嗪、乙胺嘧啶、磺胺多辛、磺胺喹惡啉)；氨苯砜、苯乙醇胺Α、金剛烷胺、金剛乙胺、阿莫西林、乙氧基喹啉是目前常用到的獸藥，普遍應(yīng)用于各種禽類、水產(chǎn)，在動(dòng)物的感染性疾病預(yù)防中具有重要的地位。但是不合理的使用容易造成耐藥菌的增加，同時(shí)殘留藥物可能對(duì)人體健康造成潛在的危害，所以必須按時(shí)停藥以保證動(dòng)物性產(chǎn)品質(zhì)量安全，同時(shí)按照獸藥國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和專業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定，對(duì)動(dòng)物組織中這些獸藥進(jìn)行檢測(cè)分析。但是由于各種獸藥的物理化學(xué)性質(zhì)不同，差異較大，加上檢測(cè)樣品中其他成分的干擾，對(duì)動(dòng)物組織中多種獸藥殘留同時(shí)快速分析檢測(cè)構(gòu)成很大的困難。
[0003]這些藥物日常使用率極高，并且在日常檢測(cè)中檢出陽(yáng)性比例非常高。但是很多藥物目前沒(méi)有國(guó)標(biāo)方法，例如氨苯砜、苯乙醇胺、金剛烷胺、金剛乙胺等。目前現(xiàn)有的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法中，也需要采用多個(gè)不同的方法對(duì)這些化合物進(jìn)行檢測(cè)，操作步驟復(fù)雜，需要使用固相萃取柱等，檢測(cè)成本高，因此需要開(kāi)發(fā)一種通用的檢測(cè)方法用于日常樣品的檢測(cè)。
三、
【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)、方法存在的不足，提供一種動(dòng)物組織中獸藥殘留多組分同時(shí)快速分析檢測(cè)的新方法，此種方法采用UPLC-MS/MS進(jìn)行多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)測(cè)定，既能保證分析效果，又能簡(jiǎn)化前處理操作流程，便于日常檢測(cè)。
[0005]本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:
[0006]一種同時(shí)分析檢測(cè)動(dòng)物組織中殘留獸藥組分的方法，所述方法為:動(dòng)物組織樣品經(jīng)過(guò)50%乙腈+乙醇勻漿、超聲提取，正己烷凈化，乙腈+乙醇進(jìn)一步沉淀，濃縮后用UPLC-MS/MS在負(fù)離子模式下，進(jìn)行多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)測(cè)定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和外標(biāo)法定量，檢測(cè)計(jì)算得到動(dòng)物組織中46種殘留獸藥組分的含量。具體包括以下步驟:
[0007](I)制備樣品溶液:每5g搗碎后的動(dòng)物組織樣品按照以下方法處理得到樣品溶液:
[0008]稱取5g搗碎后的動(dòng)物組織樣品于離心管中，加入6mL2.0mmol/L乙酸銨水溶液，9mL體積比4:1的乙腈+乙醇混合液，高速充分勻漿，混勻后超聲提取5min，離心，取上清液A，剩余殘?jiān)尤?5mL體積比4:1的乙腈+乙醇混合液，超聲提取5min，離心、取上清液B與上清液A合并，得提取液，加入15mL正己烷，混勻后離心，得下層清液體，取其中7.5mL，經(jīng)
0.22 μ m濾膜過(guò)濾到帶刻度的離心管中，40°C水浴下氮?dú)獯抵罥?1.2mL,加入200 μ L DMSO后，用2.0mmol/L乙酸銨水溶液定容至1.5mL刻度線，得樣品溶液；
[0009](2)將步驟(I)所得的樣品溶液經(jīng)超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測(cè)，得樣品溶液的超高效液相色譜圖，色譜條件為:以碳十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，粒徑< 5 μ m ;梯度洗脫:流動(dòng)相A為含體積分?jǐn)?shù)0.1%的甲酸的甲醇溶液，流動(dòng)相B為含體積分?jǐn)?shù)
0.1%的甲酸的水溶液；色譜柱溫度為40°C;進(jìn)樣量10 μ L，流速為0.3 μ L/min ;質(zhì)譜條件為:ESI正負(fù)離子同時(shí)掃描模式，毛細(xì)管電壓分別為3.5kV和3.0kV,源溫145°C，去溶劑氣溫度:450°C;去溶劑氣氮?dú)饬魉?900L/h ;錐孔氣氮?dú)饬魉?50L/h ;碰撞氣體:氬氣3.3X l(T3mba ；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式檢測(cè)；
[0010](3)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線:取吡哌酸、麻保沙星、培氟沙星、氧氟沙星、依諾沙星、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、單諾沙星、洛美沙星、奧比沙星、雙氟沙星、沙拉沙星、斯帕沙星、西諾沙星、惡喹酸、萘啶酸、氟甲喹、磺胺、乙?；前贰⒒前粪姿簟⒒前范桩愢姿?、磺胺噻唑、磺胺吡啶、磺胺甲嘧啶、三甲氧芐胺嘧啶、磺胺甲氧噠嗪、磺胺對(duì)甲氧嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺甲噻唑、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲惡唑、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺二甲異惡唑、磺胺苯甲酰、磺胺苯吡唑、磺胺氯噠嗪、乙胺嘧啶、磺胺多辛、磺胺喹惡啉、氨苯砜、苯乙醇胺A、金剛烷胺、金剛乙胺、阿莫西林、乙氧基喹啉的標(biāo)準(zhǔn)品，配制成不同濃度的混合的標(biāo)準(zhǔn)工作液，按照步驟(2)相同條件進(jìn)行測(cè)試，得標(biāo)準(zhǔn)工作液的超高效液相色譜圖，分別對(duì)各個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品，按照其濃度和峰面積，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別得到上述46種標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0011](4)根據(jù)步驟(2)中樣品溶液的超高效液相色譜圖中各待測(cè)成分的峰面積及其對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出樣品溶液中各待測(cè)成分的濃度，以公式(I)計(jì)算得到動(dòng)物組織樣品中各待測(cè)成分的含量:
[0012]X= (1.5XC/7.5X30)/M=6XCXMX 100%,......(I)
[0013]X——?jiǎng)游锝M織樣品中待測(cè)成分的含量，單位μ g/kg
[0014]C——根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到樣品溶液中待測(cè)成分的濃度，單位ng/mL
[0015]M——?jiǎng)游锝M織樣品的質(zhì)量，單位g。
[0016]所述步驟(2)中，所述梯度洗脫的程序優(yōu)選如下表I所示:
[0017]表I
【權(quán)利要求】
1.一種同時(shí)分析檢測(cè)動(dòng)物組織中殘留獸藥組分的方法，其特征在于所述方法為:動(dòng)物組織樣品經(jīng)過(guò)50%乙腈+乙醇勻漿、超聲提取，正己烷凈化，乙腈+乙醇進(jìn)一步沉淀，濃縮后用UPLC-MS/MS在負(fù)離子模式下，進(jìn)行多反應(yīng)監(jiān)測(cè)測(cè)定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和外標(biāo)法定量，檢測(cè)計(jì)算得到動(dòng)物組織中46種殘留獸藥組分的含量；所述殘留獸藥組分為吡哌酸、麻保沙星、培氟沙星、氧氟沙星、依諾沙星、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、單諾沙星、洛美沙星、奧比沙星、雙氟沙星、沙拉沙星、斯帕沙星、西諾沙星、惡喹酸、萘卩定酸、氟甲喹、磺胺、乙?；前?、磺胺嘧啶、磺胺二甲異嘧啶、磺胺噻唑、磺胺吡啶、磺胺甲嘧啶、三甲氧芐胺嘧啶、磺胺甲氧噠嗪、磺胺對(duì)甲氧嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺甲噻唑、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲惡唑、磺胺二甲氧嘧唆、磺胺二甲異惡唑、磺胺苯甲酰、磺胺苯吡唑、磺胺氯噠嗪、乙胺嘧唆、磺胺多辛、磺胺喹惡啉、氨苯砜、苯乙醇胺A、金剛烷胺、金剛乙胺、阿莫西林或乙氧基喹啉。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述方法包括以下步驟: (O制備樣品溶液:每5g搗碎后的動(dòng)物組織樣品按照以下方法處理得到樣品溶液: 稱取5g搗碎后的動(dòng)物組織樣品于離心管中，加入6mL2.0mmoI/L乙酸銨水溶液，9mL體積比4:1的乙腈+乙醇混合液，高速充分勻漿，混勻后超聲提取5min，離心，取上清液A，剩余殘?jiān)尤?5mL體積比4:1的乙腈+乙醇混合液，超聲提取5min，離心、取上清液B與上清液A合并，得提取液，加入15mL正己烷，混勻后離心，得下層清液體，取其中7.5mL,經(jīng)·0.22 μ m濾膜過(guò)濾到帶刻度的離心管中，40°C水浴下氮?dú)獯抵罥~1.2mL,加入200 μ L DMSO后，用2.0mmol/L乙酸銨水溶液定容至1.5mL刻度線，得樣品溶液； (2)將步驟(1)所得的樣品溶液經(jīng)超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測(cè)，得樣品溶液的超高效液相色譜圖，色譜條件為:以碳十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，粒徑< 5μπι ;梯度洗脫:流動(dòng)相A為含體積分?jǐn)?shù)0.1%的甲酸的甲醇溶液，流動(dòng)相B為含體積分?jǐn)?shù)0.1%的甲酸的水溶液；色譜柱溫度為40°C;進(jìn)樣量10 μ L，流速為0.3 μ L/min ;質(zhì)譜條件為:ESI正負(fù)離子同時(shí)掃描模式，毛細(xì)管·電壓分別為3.5kV和3.0kV，源溫145°C，去溶劑氣溫度:450°C ；去溶劑氣氮?dú)饬魉?900L/h ;錐孔氣氮?dú)饬魉?50L/h ;碰撞氣體:氬氣3.3X 10_3mba ;多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式檢測(cè)； (3)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線:取吡哌酸、麻保沙星、培氟沙星、氧氟沙星、依諾沙星、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、單諾沙星、洛美沙星、奧比沙星、雙氟沙星、沙拉沙星、斯帕沙星、西諾沙星、惡喹酸、萘啶酸、氟甲喹、磺胺、乙?；前?、磺胺嘧啶、磺胺二甲異嘧啶、磺胺噻唑、磺胺吡啶、磺胺甲嘧啶、三甲氧芐胺嘧啶、磺胺甲氧噠嗪、磺胺對(duì)甲氧嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺甲噻唑、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲惡唑、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺二甲異惡唑、磺胺苯甲酰、磺胺苯吡唑、磺胺氯噠嗪、乙胺嘧啶、磺胺多辛、磺胺喹惡啉、氨苯砜、苯乙醇胺A、金剛烷胺、金剛乙胺、阿莫西林、乙氧基喹啉的標(biāo)準(zhǔn)品，配制成不同濃度的混合的標(biāo)準(zhǔn)工作液，按照步驟(2)相同條件進(jìn)行測(cè)試，得標(biāo)準(zhǔn)工作液的超高效液相色譜圖，分別對(duì)各個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品，按照其濃度和峰面積，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別得到上述46種標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線； (4)根據(jù)步驟(2)中樣品溶液的超高效液相色譜圖中各待測(cè)成分的峰面積及其對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出樣品溶液中各待測(cè)成分的濃度，以公式(I)計(jì)算得到動(dòng)物組織樣品中各待測(cè)成分的含量: X= (1.5XC/7.5X30) /M=6XCXMX 100%......(I) X——?jiǎng)游锝M織樣品中待測(cè)成分的含量，單位μ g/kgC——根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到樣品溶液中待測(cè)成分的濃度，單位ng/mL M-動(dòng)物組織樣品的質(zhì)量,單位g。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述步驟(2)中，所述梯度洗脫的程序如下表所示:
4.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述步驟(1)中，所述高速充分勻漿通常是以20000r/min的轉(zhuǎn)速高速勻衆(zhòng)I~2min。
【文檔編號(hào)】G01N30/02GK103713056SQ201310607159
【公開(kāi)日】2014年4月9日 申請(qǐng)日期:2013年11月25日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月25日
【發(fā)明者】倪梅林, 鐘鶯鶯, 葛曉鳴, 湛嘉, 俞雪鈞 申請(qǐng)人:寧波出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心