一種免疫層析試紙條檢測(cè)微囊藻毒素-lr的方法
【專利摘要】一種免疫層析試紙條檢測(cè)微囊藻毒素-LR的方法，免疫分析化學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】。通過(guò)一步制備法制得具有中空結(jié)構(gòu)的Au?NCs，將其標(biāo)記到Anti?MC-LR上制得金納米籠-微囊藻毒素抗體結(jié)合物，將BSA偶聯(lián)的微囊藻毒素-LR、IgG分別噴涂于硝酸纖維素膜上作檢測(cè)線以及控制線制得免疫層析片條；利用競(jìng)爭(zhēng)免疫層析法，通過(guò)讀取檢測(cè)線上滯留的金納米籠-微囊藻毒素抗體結(jié)合物的灰度值，對(duì)試樣中微囊藻毒素-LR進(jìn)行定量分析。不但克服了試紙條技術(shù)中金溶膠不易保存的缺點(diǎn)，而且操作簡(jiǎn)單，抗體的修飾需要的時(shí)間較短。
【專利說(shuō)明】—種免疫層析試紙條檢測(cè)微囊藻毒素-LR的方法
[0001]
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明屬免疫分析化學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】 [0003]人類的生活和產(chǎn)業(yè)活動(dòng)向湖泊等水體的排污日益增多，導(dǎo)致水體富營(yíng)養(yǎng)化，藻類異常增殖，釋放次級(jí)代謝物藻毒素，特別是微囊藻毒素，從而嚴(yán)重危害自然生態(tài)環(huán)境。對(duì)水體進(jìn)行環(huán)境保護(hù)迫切需要開(kāi)發(fā)簡(jiǎn)便高效的微囊藻毒素檢測(cè)方法。
[0004]免疫層析技術(shù)作為一種新技術(shù)最早可追溯到上世紀(jì)五十年代。1957年Kohn報(bào)道了一種新的免疫電泳技術(shù)即免疫層析技術(shù)的最初形式，并在1958年嘗試用此技術(shù)分離一種已知蛋白質(zhì)跟一種未知蛋白質(zhì)，得到了優(yōu)于瓊脂擴(kuò)散電泳的分離方法。該技術(shù)的基本原理是以條狀的微孔膜(多為硝酸纖維素膜)為固相載體，通過(guò)毛細(xì)作用使待檢樣品溶液在纖維層析條上移動(dòng)，同時(shí)使樣品中的待檢物與層析材料上針對(duì)待檢物的受體(如抗體或抗原)發(fā)生高特異性、高親和性的免疫反應(yīng)，在層析反應(yīng)的過(guò)程中免疫復(fù)合物被滯留或富集在層析材料上包被有捕獲劑的檢測(cè)區(qū)域，通過(guò)酶反應(yīng)顯色或直接運(yùn)用可目測(cè)的標(biāo)記物(如膠體金、乳膠顆粒等)而對(duì)待檢測(cè)物中受體進(jìn)行定性或定量的檢測(cè)。
[0005]金納米結(jié)構(gòu)材料由于其獨(dú)特的光學(xué)和光熱性質(zhì)，在生命科學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域有著巨大的應(yīng)用潛力。近幾年來(lái)，對(duì)于金納米結(jié)構(gòu)材料的研究取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步。生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用較為廣泛的金納米結(jié)構(gòu)材料包括金納米球、金納米棒、core-shell結(jié)構(gòu)的SiO2-Au和金納米籠等。目前，免疫層析技術(shù)中常用的著色標(biāo)記物金納米顆粒溶膠存在不易保存的缺點(diǎn)。
[0006]申請(qǐng)?zhí)枮?00910035793.X的中國(guó)專利文件公布了 “一種基于金納米棒端面自組裝檢測(cè)微囊藻毒素-LR的方法”，其技術(shù)方案是以金納米棒的端面與微囊藻毒素包被原及抗微囊藻毒素抗體分別偶聯(lián)形成金納米棒的探針，利用合成的金納米棒探針與微囊藻毒素-LR進(jìn)行免疫反應(yīng)從而由于金納米棒端面的抗原抗體反應(yīng)形成納米鏈,通過(guò)納米鏈的粒徑的變化檢測(cè)微囊藻毒素-LR。申請(qǐng)?zhí)枮?01010284685.9的中國(guó)專利文件公布了“用拉曼光譜在金納米棒端面自組裝介導(dǎo)下檢測(cè)微囊藻毒素的方法”，其技術(shù)方案是以金納米棒的端面與微囊藻毒素的包被原及抗微囊藻毒素的抗體分別偶聯(lián)形成金納米棒的探針，利用合成的金納米棒探針進(jìn)行免疫反應(yīng)從而由于金納米棒端面的抗原抗體反應(yīng)形成納米鏈，組裝形成的納米鏈長(zhǎng)度的不同使拉曼信號(hào)強(qiáng)度不同，通過(guò)拉曼信號(hào)的變化檢測(cè)MC-LR含量。上述已公開(kāi)技術(shù)方案的不足之處是操作還不夠簡(jiǎn)單，抗體的修飾所需要的時(shí)間較長(zhǎng)。
[0007]金納米籠(Au NCs)材料擁有巨大比表面積以及良好的生物相容性，且在水溶液中分布穩(wěn)定自身有一定的顏色顯現(xiàn)，但金納米籠在免疫層析試紙條上的應(yīng)用迄今未見(jiàn)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的是克服目前常用著色標(biāo)記物金納米顆粒溶膠不易保存的缺點(diǎn)，提供一種免疫層析試紙條檢測(cè)微囊藻毒素-LR的方法，其操作簡(jiǎn)單，抗體的修飾需要的時(shí)間較短。
[0009]本發(fā)明采用金納米籠(Au NCs)替代金納米顆粒溶膠標(biāo)記微囊藻毒素-LR單克隆抗體(Anti MC-LR)制得免疫標(biāo)記物，將其噴涂到免疫層析試紙條的結(jié)合墊上，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)免疫法可實(shí)現(xiàn)對(duì)微囊藻毒素-LR的定量檢測(cè)。
[0010]本發(fā)明方法按如下步驟:
1、通過(guò)一步制備法制得具有中空結(jié)構(gòu)的AuNCs，將其標(biāo)記到Anti MC-LR上制得金納米籠-微囊藻毒素抗體結(jié)合物，標(biāo)記過(guò)程為:將總量為8~12 μ L的Anti MC-LR加入濃縮后pH =9的0.25 mL Au NCs溶液中，于20~26°C反應(yīng)2~2.5 h，將含2.5克BSA (牛血清白蛋白)的水溶液加入上述混合液中反應(yīng)0.4^0.6h、以封閉Au NCs的多余結(jié)合位點(diǎn)，低于10° 1:高速離心不少于10 min，棄上清液，用PBS緩沖液分散清洗，最后分散在0.9~1.1mL洗脫液中得到Au NCs - Anti MC-LR溶液，于4 ° C保存?zhèn)溆茫?br> 2、將BSA偶聯(lián)的微囊藻毒素-LR、IgG(羊抗鼠免疫球蛋白)分別噴涂于硝酸纖維素膜上作檢測(cè)線(T線)以及控制線(C線)制得免疫層析片條；
3、利用競(jìng)爭(zhēng)免疫層析法，通過(guò)讀取檢測(cè)線上滯留的金納米籠-微囊藻毒素抗體結(jié)合物的灰度值，對(duì)試樣中微囊藻毒素-LR進(jìn)行定量分析。
[0011]上述步驟I所說(shuō)一步制備法為現(xiàn)有技術(shù),例如可見(jiàn):Zhang Y, Sun Y J, Li Z,et al.Au nanocages for highly sensitive and selective detection of H2O2 [J].J.Electroanal.Chem., 2011, 656(1-2): 23-28。
`[0012]優(yōu)選地，上述步驟I所說(shuō)用PBS緩沖液分散清洗為:用0.01 mol/L PBS分散清洗兩至三次。
[0013]優(yōu)選地，上述步驟I所說(shuō)洗脫液中=Na3PO4.12H20的濃度為20 mmol/L，BSA的重量百分濃度為5%，Tween -20的重量百分濃度為0.25%，蔗糖的重量百分濃度為10%。
[0014]優(yōu)選地，制備免疫層析片條時(shí)，將條狀樣品墊浸泡于樣品墊處理液中28~32min后于37 °C~38 V烘干備用，樣品墊處理液中Triton X-100的重量百分濃度為0.25%，Tris - HCl 的濃度為 0.05 mol/L, NaCl 的濃度為 0.15 mmol/L。
[0015]優(yōu)選地,檢測(cè)線與控制線之間的距離為3.0 mm~3.2 mm。
[0016]優(yōu)選地，以PBS+Tween-20+BSA為測(cè)試底液。
[0017]優(yōu)選地，T線噴涂?jī)纱巍?br> [0018]優(yōu)選地，每次測(cè)試時(shí)滴加的金納米籠標(biāo)記單克隆抗體量為2 μ L0
[0019]優(yōu)選地，使用硝酸纖維素膜HF135。
[0020]本發(fā)明利用金納米籠巨大的比表面積以及良好的生物相容性，對(duì)微囊藻毒素-LR單克隆抗體進(jìn)行標(biāo)記，然后利用競(jìng)爭(zhēng)法免疫層析試紙條對(duì)微囊藻毒素-LR進(jìn)行定性定量檢驗(yàn)分析。在試紙條上，可通過(guò)顏色聚集進(jìn)行直觀的定性分析；借助試紙條圖像分析儀可對(duì)其進(jìn)行定量分析。
[0021]以下是工藝條件的優(yōu)化試驗(yàn):
1、測(cè)試底液對(duì)檢測(cè)結(jié)果影響
根據(jù)相似相溶原理，不同溶劑對(duì)展開(kāi)效果有不同的影響。選取PBS、PBS+BSA、PBS+Tween-20、PBS+Tween-20+BSA、蒸餾水五種不同的溶劑體系進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可以看出PBS+Tween-20+BSA對(duì)檢測(cè)效果最好，所以選取PBS+Tween-20+BSA為測(cè)試底液。
[0022]2、檢測(cè)線噴涂次數(shù)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響
檢測(cè)線噴涂的是0.2 mg/m L的BSA偶聯(lián)微囊藻毒素-LR溶液，因?yàn)閲娡看螖?shù)的不同，吸附在硝酸纖維素膜上的BSA-MC-LR總量有很大的影響，進(jìn)而對(duì)目標(biāo)物競(jìng)爭(zhēng)性吸附有很大的影響。因此，選取同一批次制作的，且在檢測(cè)線噴涂不同次數(shù)的片條對(duì)同一濃度的標(biāo)準(zhǔn)濃度微囊藻毒素-LR溶液進(jìn)行了試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可以看出，噴涂次數(shù)在2次以上時(shí)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響基本一致，所以考慮到試驗(yàn)成本，選取T線噴涂?jī)纱巫罴选?br> [0023]3、金納米籠標(biāo)記單克隆抗體用量的影響
考察了金納米籠標(biāo)記單克隆抗體(Au NCs-Anti MC-LR conjugates)在片條的金膠結(jié)合墊上的滴加量對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響，選取同一批次制作的且在T線噴涂2次的片條，滴加不同金標(biāo)量對(duì)同一濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可知，在金納米籠標(biāo)記單克隆抗體量為2 μ L以上時(shí)，檢測(cè)灰度值達(dá)到最大，所以優(yōu)選每次測(cè)試時(shí)滴加的金納米籠標(biāo)記單克隆抗體量為2 UL0[0024]4、硝酸纖維素膜的選擇
硝酸纖維素膜對(duì)溶劑的展開(kāi)有很大的影響，選取了兩種不同硝酸纖維素膜HF135和HF180制作片條，在相同試驗(yàn)條件下對(duì)同一濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行了對(duì)比檢測(cè)試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表
I。由表1可知使用HF135的硝酸纖維素膜的片條檢測(cè)效果優(yōu)于使用HF180的硝酸纖維素膜的片條。
[0025]表1兩種不同的硝酸纖維素膜檢測(cè)結(jié)果對(duì)比
【權(quán)利要求】
1.一種免疫層析試紙條檢測(cè)微囊藻毒素-LR的方法，其特征在于按如下步驟： (1)、通過(guò)一步制備法制得具有中空結(jié)構(gòu)的AuNCs，將其標(biāo)記到Anti MC-LR上制得金納米籠-微囊藻毒素抗體結(jié)合物，標(biāo)記過(guò)程為：將總量為8~12 μ L的Anti MC-LR加入濃縮后pH =9的O. 25 mL Au NCs溶液中，于20~26°C反應(yīng)2~2. 5 h，將含2. 5克BSA (牛血清白蛋白）的水溶液加入上述混合液中反應(yīng)O. 4^0. 6h、以封閉Au NCs的多余結(jié)合位點(diǎn)，低于10° 1：高速離心不少于10 min，棄上清液，用PBS緩沖液分散清洗，最后分散在O. 9~I.ImL洗脫液中得到Au NCs - Anti MC-LR溶液，于4 ° C保存?zhèn)溆茫? (2)、將BSA偶聯(lián)的微囊藻毒素-LR、IgG分別噴涂于硝酸纖維素膜上作檢測(cè)線以及控制線制得免疫層析片條； (3)、利用競(jìng)爭(zhēng)免疫層析法，通過(guò)讀取檢測(cè)線上滯留的金納米籠-微囊藻毒素抗體結(jié)合物的灰度值，對(duì)試樣中微囊藻毒素-LR進(jìn)行定量分析。
2.如權(quán)利要求1所說(shuō)的免疫層析試紙條檢測(cè)微囊藻毒素-LR的方法，其特征在于步驟I所說(shuō)用PBS緩沖液分散清洗為：用0.01 mol/L PBS分散清洗兩至三次。
3.如權(quán)利要求1所說(shuō)的免疫層析試紙條檢測(cè)微囊藻毒素-LR的方法，其特征在于步驟I所說(shuō)洗脫液中=Na3PO4 · 12H20的濃度為20 mmol/L，BSA的重量百分濃度為5%，Tween-20的重量百分濃度為O. 25%，蔗糖的重量百分濃度為10%。
4.如權(quán)利要求1所說(shuō)的免疫層析試紙條檢測(cè)微囊藻毒素-LR的方法，其特征在于：制備免疫層析片條時(shí)，將條狀樣品墊浸泡于樣品墊處理液中28~32min后于37 °C~38 °C烘干備用，樣品墊處理液中Triton X-100的重量百分濃度為O. 25%，Tris - HCl的濃度為O.05 mol/L, NaCl 的濃度為 O. 15 mmol /I,η
5.如權(quán)利要求1所說(shuō)的免疫層析試紙條檢測(cè)微囊藻毒素-LR的方法，其特征在于：檢測(cè)線與控制線之間的距離為3. O mm~3. 2 mm。
6.如權(quán)利要求1所說(shuō)的免疫層析試紙條檢測(cè)微囊藻毒素-LR的方法，其特征在于：以PBS+Tween-20+BSA 為測(cè)試底液。
7.如權(quán)利要求1所說(shuō)的免疫層析試紙條檢測(cè)微囊藻毒素-LR的方法，其特征在于T線噴涂?jī)纱巍?br> 8.如權(quán)利要求1所說(shuō)的免疫層析試紙條檢測(cè)微囊藻毒素-LR的方法，其特征在于：每次測(cè)試時(shí)滴加的金納米籠標(biāo)記單克隆抗體量為2 μ L。
9.如權(quán)利要求1所說(shuō)的免疫層析試紙條檢測(cè)微囊藻毒素-LR的方法，其特征在于使用硝酸纖維素膜HF135。
【文檔編號(hào)】G01N33/577GK103604926SQ201310610348
【公開(kāi)日】2014年2月26日 申請(qǐng)日期:2013年11月27日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月27日
【發(fā)明者】楊云慧, 牛司朋, 趙錦航, 符雪文, 趙春玲 申請(qǐng)人:云南師范大學(xué)